阅读说明：本技术 地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶和烟叶发酵中的应用 (Application of bacillus licheniformis LCCC10161 in production of alpha-amylase and tobacco fermentation ) 是由 王胜利 关艳丽 叶亚军 池景良 张永岗 赵新海 于宏男 刘月明 张宝 *** 李 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161在生产α-淀粉酶和烟叶发酵中的应用,地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161能够产生高酶活性的α-淀粉酶,利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161生产α-淀粉酶,为α-淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径,可以实现α-淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌应用到烟叶发酵中,能加速烟叶中淀粉的降解,明显缩短烟叶的发酵周期,提升烟叶的品质。(The invention provides an application of Bacillus licheniformis (LCCC 10161) in producing alpha-amylase and tobacco fermentation, the Bacillus licheniformis (LCCC 10161) can produce alpha-amylase with high enzymatic activity, the Bacillus licheniformis (LCCC 10161) is used for producing the alpha-amylase, a new way is provided for the production source of the alpha-amylase, and the large-scale production of the alpha-amylase can be realized; the bacillus licheniformis with the alpha-amylase producing high enzyme activity is applied to the fermentation of the tobacco leaves, so that the degradation of starch in the tobacco leaves can be accelerated, the fermentation period of the tobacco leaves is obviously shortened, and the quality of the tobacco leaves is improved.)

地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶和烟叶发酵中的 应用

技术领域

本发明涉及地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶烟叶发酵中的应用，属于微生物应用的技术领域。

背景技术

烟叶发酵是烟叶加工过程中的重要环节之一，烟叶发酵实质实在一定的温度和湿度条件下，促使烟叶理化特性发生深刻变化的过程，是卷烟工业提高产品质量的一种初加工方法。

对于烟叶的发酵，目前多数采用自然发酵与人工发酵。自然发酵主要是借助自然气候的变化进行发酵的，它的主要特点是在烟叶贮藏期间，利用一年一度的春季温度上升，促进烟叶内酶的活动，使烟叶经过缓慢的发酵过程，以达到改善烟叶品质的目的。人工发酵是利用人为的适合烟叶内在品质变化的条件(即适宜的温度和湿度)，促使烟叶加快变化的方法。但两种方法均存在发酵进展缓慢的缺陷。

α-淀粉酶通过水解淀粉分子链中的α-1,4-葡萄糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、寡糖和少量麦芽糖和葡萄糖，是烟叶发酵中用到的主要酶类之一。α-淀粉酶可由微生物发酵产生，也可由植物、动物提取。目前，工业生产中都是以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶。有使用价值的α-淀粉酶的产生菌为：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、米曲霉、黑曲霉等。

现有技术CN104357357B公开了一株产α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HWyb1401，保藏号为CGMCC No.8718。本发明地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)HWyb1401具有耐高温特性，在70℃条件下仍能存活，并代谢出α-淀粉酶，55℃其发酵液中α-淀粉酶的酶活力可达70U/mL。该发明专利中提供一株新的地衣芽孢杆菌菌株，该地衣芽孢杆菌菌株具有耐高温特性，不涉及在已有菌株中筛选高酶活力的α-淀粉酶的内容。

发明内容

本发明的目的在于提供一种地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶和烟叶发酵中的应用，地衣芽孢杆菌LCCC10161能够高产α-淀粉酶，十分适用于生产α-淀粉酶和烟叶发酵。

一方面，本发明提供了地衣芽孢杆菌LCCC10161在生产α-淀粉酶中的应用，地衣芽孢杆菌LCCC10161能够产生高酶活性的α-淀粉酶，为α-淀粉酶的生产来源提供了一个新的来源。

另一方面，本发明还提供了利用地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161生产α-淀粉酶的方法，该方法包括将活化的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)LCCC10161接种于液体培养基中进行发酵培养，发酵液离心得上清液的步骤。

优选的，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161的接种量为10⁵～10⁷cfu/ml，所述培养为振荡培养，转速为150～250r/min，温度为20～45℃，时间为3～5d；

优选的，接种量为10⁶cfu/ml，转速为200r/min，温度为36℃，时间为4d；

优选的，所述液体培养基含有：豆饼粉0.8g、玉米粉2.0g、NaCl 1.0g、K₂HPO₄0.01g、KH₂PO₄ 0.01g、CaCl₂ 0.3g、蒸馏水100mL，pH为7.5～8.5，液体培养基的装量为8～15％；

优选的，pH为8.0，液体培养基的装量为10％；

优选的，将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161活化培养15～25d后进行接种；

优选的，活化地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161所用培养基为LB培养基；

优选的，LB培养基含有蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L；

优选的，所述离心的温度为0～4℃，转速为8000～12000rpm，时间为20～40min。

进一步的，所述方法还包括将在上清液加入硫酸铵进行沉淀，透析脱盐后，得粗酶液的步骤；

优选的，硫酸铵的饱和度为40～60％；

优选的，在上清液加入所述硫酸铵溶解后，离心，沉淀用ddH₂O溶解后，使用15～25mmol/L、pH 5.8～6.2的醋酸缓冲液透析脱盐。

进一步的，所述方法还包括将粗酶液使用DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱和Sephadex G-75凝胶过滤层析柱进行纯化的步骤。

优选的，粗酶液纯化的具体步骤为：

(1)将粗酶液上样到Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱，使用醋酸缓冲液A洗脱至A280不变后，再用含0.1mol/L NaCl的醋酸缓冲液进行洗脱，流速为0.8～1.2mL/min，得到收集液；

(2)将收集液上样到Sephadex G-75凝胶过滤层析柱，用含0.2mol/L NaCl的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为0.2～0.4mL/min，收集的活性组分浓缩至密度为1.1～1.2g/ml。

另一方面，本发明还提供了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161或所述的方法在烟叶发酵中的应用。

另一方面，本发明还提供了一种烟叶发酵方法，在烟叶中接种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161进行发酵。

优选的，地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～45℃，湿度为50～70％，时间为5～10d。

本发明的有益效果为：

本发明公开了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161能够产生高酶活性的α-淀粉酶，为α-淀粉酶的生产来源提供了一个新的途径，可以实现α-淀粉酶的规模化生产；将具有产高酶活力的α-淀粉酶的地衣芽孢杆菌应用到烟叶发酵中，能加速烟叶中淀粉的降解，明显缩短烟叶的发酵周期，提升烟叶的品质。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明，以下实施例仅为方便本领域技术人员理解本发明技术方案，实现或使用本发明所做的说明，并不以此限定本发明的保护范围。

本发明中，如未指定，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。本发明使用的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)菌株购于辽宁省微生物菌种保藏中心，编号为：LCCC10161。

实施例中的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1利用地衣芽孢杆菌LCCC10161生产α-淀粉酶

为提高LCCC10161地衣芽孢杆菌产酶量对其培养条件进行优化。主要考察种子种龄、接种量、最适装液量、发酵温度及培养基初始pH对产酶的影响。

通过试验最终确定LCCC10161地衣芽孢杆菌产酶的最佳培养条件为：温度36℃，种龄为20h，接种量10％(10⁶cfu/ml)，三角瓶装液量为10％，最高产酶时间为4d，最适pH 8.0，200r/min。

菌种活化时所选培养基：

(1)固体菌种采用LB固体培养基。每L含有10g蛋白胨、5g酵母提取物10g氯化钠、琼脂16-20g，pH 7.0-7.2。0.1MPa、121℃，灭菌30min。

培养条件：33±1℃培养24h。

(2)液体菌种采用LB液体培养基，含有蛋白胨1.0g、酵母提取物0.5g、NaCl 1.0g、淀粉0.1g、蒸馏水100mL，pH 7.0-7.2、0.1MPa、121℃、灭菌30min。

培养条件：33±1℃培养20h。

菌种培养时所选培养基：

液体培养基：豆饼粉0.8g、玉米粉2.0g、NaCl 1.0g、K₂HPO₄ 0.01g、KH₂PO₄0.01g、CaCl₂ 0.3、蒸馏水100mL，液体培养基在三角瓶的装量为10％，于0.1MPa、121℃，灭菌30min。

菌种接种：利用火焰圈无菌接种，接种量为10％(10⁶cfu/ml)。

培养条件：36±1℃、摇瓶转速200r/min，培养96h。

为获得较高的酶活，对地衣芽孢杆菌LCCC10161的液体发酵培养基进行优化。主要考察了碳源、氮源、金属离子的选择及浓度确定。通过试验最终确定地衣芽孢杆菌LCCC10161最佳产酶培养基为豆饼粉0.8％、玉米粉2.0％、NaCl 1％、K₂HPO₄ 0.01％、KH₂PO₄0.01％、CaCl₂ 0.3％。

使用最佳培养条件和最佳产酶培养基，发酵上清液的酶活力达到102U/mL。

实施例2α-淀粉酶分离纯化的步骤包括：

(1)硫酸铵沉淀

硫酸铵分级沉淀：每个菌种样品均取20mL上清液，分别加入硫酸铵使硫酸铵的浓度从30％(w/v)，以5％(w/v)递增直至80％(w/v)，摇匀，溶解后静止20min，10000r/min 4℃离心10min，去掉上清液，沉淀用同样的少量的ddH₂O溶解，得到粗酶液；将粗酶液用20mmol/L、pH 6.0的醋酸缓冲液透析12h，以除去酶液中的大量硫酸铵成分，中间更换两次透析缓冲，测其脱盐后的粗酶液活性。

通过此方法测得硫酸铵浓度为40％～60％硫酸铵饱和度时有利于α-淀粉酶的提取。

(2)DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析

将透析后的粗酶液上样到经醋酸缓冲液A(20mmol/L、pH6.0醋酸缓冲液)平衡好的DEAE Sepharose Fast Flow柱(2.6cm×20cm)，酶蛋白先用醋酸缓冲液A洗脱至A₂₈₀不变后，再用含0.1mol/L NaCl的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为1.0mL/min，10min收集l管。对收集的样品进行活性测定，合并有活性的试管收集液。

(3)Sephadex G-75凝胶过滤层析

将上一步收集液进行Sephadex G-75凝胶过滤层析分离(1.6cm×60cm)，用含0.2mol/L NaCl的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为0.3mL/min，5min收集1管。将收集的样品进行活性测定，收集活性部分，透析脱盐后，冻干浓缩。

将地衣芽孢杆菌LCCC10161的发酵上清酶液离心后，经过硫酸铵分级沉淀(40-60％)，DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析三步纯化得到电泳级纯酶，将酶的比活力提高到217.8U/mg，纯化倍数为18倍。

将各步纯化后的酶活部分，进行SDA-PAGE凝胶电泳。α-淀粉酶经过硫酸铵分级盐析、离子交换层析和凝胶过滤层析三步纯化后已达到电泳纯，淀粉酶活性染色结果表明在相应位置出现唯一的反白色条带。证实了分离纯化得到的酶蛋白具有淀粉酶的生物学活性。

实施例3地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161在烟叶发酵中的应用

将地衣芽孢杆菌LCCC10161接种于烟叶，地衣芽孢杆菌LCCC10161的接种量为10⁵～10⁷cfu/g，发酵的温度为20～45℃，湿度为50～70％，时间为5～10d。

或将实施例2得到的地衣芽孢杆菌LCCC10161的发酵上清液，或其粗酶液，或其最终制得的纯化后的α-淀粉酶添加到烟叶中，用于发酵，在烟叶中α-淀粉酶的酶活力为10-20U/mg，发酵条件：温度为20～45℃，湿度为50～70％，时间为5～10d。

本发明以2018重庆B4F原烟作为对照组，以加入10⁶cfu/g的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161作为处理组1，加入15U/mg制得的α-淀粉酶酶粉作为处理组2，来发酵烟叶，发酵的温度为36℃，湿度为55％，时间为8d，发酵后烟叶中各化学成分的变化如表1所示。

由表1可知，加入地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)LCCC10161或α-淀粉酶后，烟叶中淀粉含量明显下降，烟叶中总糖含量增加，能够增加烟香，柔和烟气、增加烟气的爆发性，改善烟气品质。

表1各处理中烟叶的化学成分

以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。