阅读说明：本技术 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸 (Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same ) 是由 K.斯塔灵斯 C.安德森 V.P.拉奥 R.塞基亚 V.斯里瓦斯塔瓦 于 2018-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及α-淀粉酶变体,所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代,特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H,其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27。本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及使用所述变体的方法。(The present invention relates to alpha-amylase variants comprising a substitution at a position corresponding to position 188 and at least one further substitution at a position corresponding to position 242 or 279 or 275 of SEQ ID No. 1, in particular one or more combinations of substitutions selected from the group consisting of: e188 + S242, E188 + K279, E188 + N275, and E188 + N275, wherein the variant has at least 60%, at least 65%, at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, or at least 99%, but less than 100% sequence identity to a parent α -amylase selected from the group consisting of: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 18, and SEQ ID NO 27. The invention also relates to polynucleotides encoding the variants; nucleic acid constructs, vectors, and host cells comprising the polynucleotides; and methods of using the variants.)

α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

序列表的引用

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发明背景

技术领域

本发明涉及α-淀粉酶变体、编码所述变体的多核苷酸、产生所述变体的方法以及使用所述变体的方法。

背景技术

α-淀粉酶(α-1,4-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成一组酶，其催化淀粉及其他直链和支链1，4-葡糖苷寡糖和多糖的水解。

α-淀粉酶在商业上用于多种用途，例如在淀粉加工(例如，液化)的初始阶段中；在湿磨过程中；以及在从碳水化合物来源产生醇中。这类酶还用作清洗剂或在洗涤剂基质中的辅助物；在纺织工业中用于淀粉脱浆；用于烘焙应用中；用于饮料行业中；用于油田的钻探过程中；在回收过程中例如用于使纸去墨；以及用于动物饲料中。

发酵产物(例如乙醇)典型地是通过以下产生的：首先在干磨或湿磨过程中研磨含淀粉材料，然后使用酶将材料降解成可发酵糖，并且最后使用发酵生物将糖直接或间接转化为所希望的发酵产物。例如通过从其他液体和/或固体分离所希望的发酵产物的蒸馏，从发酵醪(通常被称为“啤酒醪液”)中回收液体发酵产物。

对于待用于淀粉液化过程中的α-淀粉酶，特别关注的是它是热稳定的并且能够在低pH和低钙浓度下起作用。改变的Ca²⁺稳定性意指在Ca²⁺消耗下的酶稳定性已得到改善，即更高或更低的稳定性。在本发明的上下文中，重要的突变(包括氨基酸取代)是实现改变的Ca²⁺稳定性(特别是在尤其低的pH(即pH 4-6)下改善的Ca²⁺稳定性，即更高稳定性)的突变。对于在洗涤剂中使用，也希望增加的螯合剂稳定性。

在用于食品应用的淀粉加工中，在液化后的DE目标被设置为：当使用葡糖淀粉酶时，在糖化中，实现淀粉阴性液化物而且进行最有效。因此对于糖化中最有效的DX生成的目标，在液化中产生的糊精(DE)的平均长度是非常重要的。优选地，希望DE数在从10-16的范围内。

WO 2000/060059披露了在低Ca²⁺水平下具有增加的稳定性的特妙淀粉酶(Termamyl)样α-淀粉酶变体。WO 2013/057143和WO 2013/057141披露了来自液化芽孢杆菌(Bacillus liquefaciens)的α-淀粉酶变体，所述变体具有改善的特性，例如在低钙浓度下具有增加的稳定性。

来自嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶在WO 99/19467中披露为SEQ ID NO:3，并且其变体已经披露于WO 1996/023873和WO 1999/019467中。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的另外的变体披露于WO 2011/082425中。

WO 2012/088303(诺维信公司(Novozymes))披露了在从4.5-5.0范围的pH下，在从80℃-90℃范围的温度下，使用在pH 4.5、85℃、0.12mM CaCl2下具有至少10的T1/2(min)的α-淀粉酶和具有超过20％的热稳定性值(确定为在80℃/70℃下的相对活性)的蛋白酶的组合，通过液化含淀粉材料随后糖化和发酵来生产发酵产物的方法。

WO 2013/082486(诺维信公司)披露了在高于初始胡话温度的温度下，在范围从高于5.0-7.0的pH下，使用α-淀粉酶变体，通过液化含淀粉材料生产发酵产物的方法。

US 8,084,240披露了嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中的E188P取代导致增加的稳定性。

WO 2009/061381描述了与野生型相比，当S被取代为A、Q、E、D、或M时，在位置242处的取代导致改善的性能，而其他取代导致更小的活性。

本发明提供了与其亲本相比具有改善特性的α-淀粉酶变体。

发明内容

根据本发明，已经出人意料地发现，在对应于位置242、279、或275(使用SEQ IDNO:1进行编号)的位置处的取代，单独使用时将导致下降的性能，但与E188P取代组合时将导致协同改善。

在第一方面，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27。

本发明还涉及编码所述变体的多核苷酸；包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生所述变体的方法。此外，本发明涉及包含本发明的α-淀粉酶变体的组合物。

本发明还涉及产生本发明的α-淀粉酶变体的方法，这些方法包括：

a)在适合于表达所述变体的条件下培养本发明的宿主细胞；以及

b)任选地回收所述变体。

本发明还涉及用于从含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在根据本发明所述的变体α-淀粉酶或根据本发明所述的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及

b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。

在另一方面，本发明涉及用于增加亲本α-淀粉酶的稳定性的方法，所述方法包括引入在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H。

定义

α-淀粉酶变体：α-淀粉酶(E.C.3.2.1.1)是催化淀粉以及其他直链和支链1,4糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。本领域技术人员将知道如何确定α-淀粉酶活性。它可以根据在实例中描述的程序，例如通过PNP-G7测定、酶检(EnzCheck)测定、或Phadebas活性测定确定。在一方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1-18的多肽的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％。在一方面，本申请的变体具有其亲本的α-淀粉酶活性的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少100％。

在另外的实施例中，与亲本α-淀粉酶，特别是如SEQ ID NO:1-18和27披露的亲本相比，本发明的变体α-淀粉酶具有增加的稳定性。特别地，可以使用任何适合的α-淀粉酶或洗净测定来确定增加的稳定性。技术人员将会知道如何选择适合的测定。已经在本文实例中提供了适合的测定和条件的实例。这种增加的稳定性可以包括在pH 4.5下超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，或在模式洗涤剂(model detergent)A中超过亲本α-淀粉酶的螯合剂稳定性。在一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在pH 4.5下，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。

在另一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在模式洗涤剂A中，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。可以使用技术人员已知的任何适合的α-淀粉酶测定，例如本文实例中披露的测定中的任一种，确定残余活性。在一个具体实施例中，可以使用Phadebas活性测定确定残余活性。

在另一个实施例中，本发明的变体α-淀粉酶能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶(特别是SEQ ID NO:1-18和27披露的亲本)产生的DE值的液化物。特别地，所述DE值比由亲本α淀粉酶产生的DE值高至少1.5X、2X。

等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，之后呈现为成熟的剪接的mRNA。

编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，所述多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，所述可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码所述变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。

表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

表达载体：术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，所述分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中所述片段具有α-淀粉酶活性。

高严格条件：术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。

宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

改善的特性：术语“改善的特性”意指与相对于亲本有所改善的变体相关的特征。这种改善的特性可以包括在pH 4.5下超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，或在模式洗涤剂A中超过亲本α-淀粉酶的螯合剂稳定性。在一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在pH 4.5下，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。

在另一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在模式洗涤剂A中，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。可以使用技术人员已知的任何适合的α-淀粉酶测定，例如本文实例中披露的测定中的任一种，确定残余活性。特别地，可以使用Phadebas活性测定确定残余活性。

在其他实施例中，所述改善的特性包括增加的稳定性，所述增加的稳定性被测量为在90℃、pH 4.5、5ppm Ca2⁺下孵育20min后通过酶检测定确定的残余α-淀粉酶活性；和/或所述变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶产生的DE值的液化物，或所述变体能够产生与由亲本α-淀粉酶产生的液化物相比具有降低的粘度的液化物。

分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质；(2)至少部分地从与其在自然界中相关的一种或多种或全部天然存在的组分中去除的任何物质，包括但不局限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的那种物质通过人工手动修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加所述物质的量而修饰的任何物质(例如，编码所述物质的基因的多个拷贝；比与编码所述物质的基因天然相关的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。

低严格条件：术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在50℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面，所述成熟序列是如SEQ ID NO:1-18披露的多肽。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。

成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有葡糖淀粉酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

中严格条件：术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在55℃使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

中-高严格条件：术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在60℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

突变体：术语“突变体”意指编码变体的多核苷酸。

核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，所述核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，所述核酸分子包含一个或多个控制序列。

可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下构型，在所述构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得所述控制序列引导所述编码序列的表达。

亲本或亲本α-淀粉酶：术语“亲本”或“亲本α-淀粉酶”意指对其作出改变以产生本发明的这些酶变体的具有α-淀粉酶活性的任何多肽。

S8A蛋白酶：术语“S8A蛋白酶”意指属于亚家族A的S8蛋白酶。枯草杆菌蛋白酶(EC3.4.21.62)是亚家族S8A中的一个亚组。S8A蛋白酶水解底物Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA。对硝基苯胺(pNA)的释放导致在405nm处的吸光度增加，并且与酶活性成比例。

序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(一致的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,同上)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,同上)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobriefoption)获得)用作同一性百分比并且计算如下：

(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)

变体：术语“变体”意指在一个或多个(例如，若干个)位置处包含改变(即，取代、***和/或缺失)的具有α-淀粉酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而***意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。在一个实施例中，亲本α-淀粉酶选自由以下组成的组：SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17和18的多肽。

非常高严格条件：术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃使用2X SSC、0.2％SDS将运载体材料洗涤三次，每次15分钟。

非常低严格条件：术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃、于5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼***DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在45℃下使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。

野生型α-淀粉酶：术语“野生型”α-淀粉酶意指由天然存在的微生物(例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的α-淀粉酶。

变体命名惯例

出于本发明的目的，除非另外说明，使用在SEQ ID NO:1中披露的成熟多肽来确定另一种α-淀粉酶中的相应氨基酸残基。另一种α-淀粉酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:1中披露的多肽进行比对，并且基于所述比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于如SEQ ID NO:1披露的多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，所述算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版本或更新版本)的尼德尔程序中所实施的。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)取代矩阵。

可以通过使用若干计算机程序，使用其相应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种α-淀粉酶中的对应氨基酸残基的鉴定，所述计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW的EMBOSS EMMA(1.83版或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)，使用它们各自的默认参数。

当其他酶与SEQ ID NO:1的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于所述目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。

对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。

在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。

取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。

缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、^*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。

***.对于氨基酸***，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的***被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***的氨基酸#1、***的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。

在此类情况下，通过将小写字母添加至在所***的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所***的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，所述序列因此会是：

<u>亲本：</u>	<u>变体：</u>
		195	195 195a 195b
G	G-K-A

多种改变.包含多种改变的变体由加号(“+”)分开，例如，“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。

不同改变.在可于一个位置处引入不同改变的情况下，不同的改变由逗号分开，例如，“Arg170Tyr,Glu”代表用酪氨酸或谷氨酸取代在位置170处的精氨酸。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：

“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。

具体实施方式

本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于SEQ ID NO:1的位置188的位置处的至少一个取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代。

嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中的取代E188P先前已经显示了改善稳定性(US 8,084,240)。对于在位置242的取代，当S被取代为A、Q、E、D、或M时，已经显示也是相同的情况，而其他取代C、F、G、H、I、K、L、N、P、R、T、V、W、Y导致与野生型相比，更小的活性(WO2009061381)。

变体

本发明人已经出人意料地发现，在位置242处的取代选自S242Y、F、H、W、P、I、T、L，单独使用时这将导致下降的性能，但与E188P取代组合时这将导致协同改善。

此外，本发明人已经出人意料地发现，在位置279处的取代选自K279Y、F、H、W、I、T、L、D、M、S、N、Q、V、A，单独使用时这将导致下降的性能，但与E188P取代组合时这将导致协同改善。

此外，本发明人已经出人意料地发现，在位置275处的取代选自N275Y、F、H、W，单独使用时这将导致下降的性能，但与E188P取代组合时这将导致协同改善。

在一个实施例中，所述变体与亲本α-淀粉酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:1或SEQ ID NO:27的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:4的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:6的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:7的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:8的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置185的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:2的位置239或276或272的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E185P+S239Y、E185P+S239F、E185P+S239H、E185P+S239W、E185P+S239P、E185P+S239I、E185P+S239T、E185P+S239L、E185P+K276W、E185P+K276Y、E185P+K276F、E185P+K276H、E185P+K276I、E185P+K276L、E185P+K276D、E185P+K276M、E185P+K276S、E185P+K276T、E185P+K276N、E185P+K276Q、E185P+K276V、E185P+K276A、E185P+N272F、E185P+N272Y、E185P+N272W、和E185P+N272H，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含对应于G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+I201Y+A209V+Q264S+K176L+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W和任选地N190F的具体取代，使用SEQ ID NO:2进行编号。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置185的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:2的位置239或276或272的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E185P+S239Y、E185P+S239F、E185P+S239H、E185P+S239W、E185P+S239P、E185P+S239I、E185P+S239T、E185P+S239L、E185P+K276W、E185P+K276Y、E185P+K276F、E185P+K276H、E185P+K276I、E185P+K276L、E185P+K276D、E185P+K276M、E185P+K276S、E185P+K276T、E185P+K276N、E185P+K276Q、E185P+K276V、E185P+K276A、E185P+N272F、E185P+N272Y、E185P+N272W、和E185P+N272H，并且其中所述变体与SEQID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含对应于G48A+T49I+H68W+G107A+T116Q+H156Y+A181T+I201Y+A209V+Q264S+K176L+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W和任选地N190F的具体取代，使用SEQ ID NO:2进行编号。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQID NO:1或SEQ ID NO:27的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含对应于V59A+E129V+E177L+R179E+I181*+G182*+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N的具体取代和任选地N193F，使用SEQ ID NO:1进行编号。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:12的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:13的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:14的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:15的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:16的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:17的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在一个实施例中，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自SEQ ID NO:18的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置185的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:2的位置239或276或272的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E185P+S239Y、E185P+S239F、E185P+S239P、E185P+S239I、E185P+S239T、E185P+S239L、E185P+K276W、E185P+K276Y、E185P+K276F、E185P+K276H、E185P+K276I、E185P+K276L、E185P+K276D、E185P+K276M、E185P+K276S、E185P+K276T、E185P+K276N、E185P+K276Q、E185P+K276V、E185P+K276A、E185P+N272F、E185P+N272Y、E185P+N272W、和E185P+N272H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含对应于G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+I201Y+A209V+Q264S+K176L+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W和任选地N190F的具体取代，使用SEQ ID NO:2进行编号，并且其中与SEQ ID NO:9相比，在90℃、pH4.5、5ppm Ca²⁺下孵育20min后，通过酶检测定确定，所述变体具有增加的残余α-淀粉酶活性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置185的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:2的位置239或276或272的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E185P+S239Y、E185P+S239F、E185P+S239P、E185P+S239I、E185P+S239T、E185P+S239L、E185P+K276W、E185P+K276Y、E185P+K276F、E185P+K276H、E185P+K276I、E185P+K276L、E185P+K276D、E185P+K276M、E185P+K276S、E185P+K276T、E185P+K276N、E185P+K276Q、E185P+K276V、E185P+K276A、E185P+N272F、E185P+N272Y、E185P+N272W、和E185P+N272H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:3的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体包含对应于G48A+T49I+H68W+G107A+T116Q+H156Y+A181T+I201Y+A209V+Q264S+K176L+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W和任选地N190F的具体取代，使用SEQ ID NO:2进行编号，并且其中与SEQ ID NO:10相比，在90℃、pH 4.5、5ppm Ca²⁺下孵育20min后，通过酶检测定确定，所述变体具有增加的残余α-淀粉酶活性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体包含对应于V59A+E129V+E177L+R179E+I181*+G182*+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N的具体取代和任选地N193F，使用SEQ ID NO:1进行编号，并且其中与SEQ ID NO:11相比，在90℃、pH 4.5、5ppm Ca²⁺下孵育20min后，通过酶检测定确定，所述变体具有增加的残余α-淀粉酶活性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:4的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含具体取代R180*+S181*+S243Q+G475K和氨基酸484-583的C-末端缺失，使用SEQ ID NO:4进行编号，并且其中与具有具体取代R180*+S181*+S243Q+G475K和氨基酸484-583的C-末端缺失的SEQ ID NO:4的α-淀粉酶相比，所述变体具有增加的热稳定性和/或增加的螯合剂稳定性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含具体取代R178*+G179*+E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K，使用SEQ ID NO:5进行编号，并且其中与具有具体取代R178*+G179*+E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K的SEQ ID NO:5的α-淀粉酶相比，所述变体具有增加的热稳定性和/或增加的螯合剂稳定性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含具体取代N126Y+E132H+R178*+G179*+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E，使用SEQ ID NO:5进行编号，并且其中与具有具体取代N126Y+E132H+R178*+G179*+T180D+E187P+I203Y+Y303D+G476T+G477E的SEQID NO:5的α-淀粉酶相比，所述变体具有增加的热稳定性和/或增加的螯合剂稳定性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含具体取代N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y，使用SEQ ID NO:5进行编号，并且其中与具有具体取代N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+E187P+I203Y的SEQ ID NO:5的α-淀粉酶相比，所述变体具有增加的热稳定性和/或增加的螯合剂稳定性。

在另一个实施例中，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，并且其中所述变体与SEQ ID NO:5的多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％，例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体进一步包含具体取代N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q，使用SEQ ID NO:5进行编号，并且其中与具有具体取代N126Y+F153W+R178*+G179*+T180H+I203Y+S239Q的SEQ ID NO:5的α-淀粉酶相比，所述变体具有增加的热稳定性和/或增加的螯合剂稳定性。

在另一方面，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242和279的位置处的另外的取代，特别是选自以下的具体组合：

E188P+S242Y+K279I；

E188P+S242L+K279W；

E188P+S242P+K279W；

E188P+S242L+K279I；

E188P+S242Y+K279W；

E188P+S242Y+K279F；

E188P+S242Y+K279H；

E188P+S242Y+K279L；

E188P+S242Y+K279Y；

E188P+S242P+K279I；

E188P+S242F+K279W；

E188P+S242H+K279W；

E188P+S242W+K279W；

其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27的多肽。

在仍另外的方面，本发明涉及α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含对应于E188P和I204Y的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279的位置处的另外的至少一个取代，特别是选自以下的具体组合：

E188P+I204Y+S242Y；

E188P+I204Y+S242F；

E188P+I204Y+K279W；

E188P+I204Y+K279Y；

E188P+I204Y+K279F；

E188P+I204Y+K279H；

E188P+I204Y+K279I；

E188P+I204Y+K279L；并且

其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27的多肽。

在一方面，在本发明的变体中的改变数目是1-20个，例如1-10个和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

这些氨基酸改变可以具有微小性质，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地1至30个氨基酸的小缺失；小段氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],Academic Press[学术出版社],纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。

可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。

可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单丙氨酸突变，并测试所得的突变分子的α-淀粉酶活性以鉴定对分子活性关键的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见，例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

所述变体可以由C-末端截短版本组成，例如所述变体被截短，优选地具有约490个氨基酸，例如从482-493个氨基酸的长度。

在另一个实施例中，所述变体α-淀粉酶优选地在SEQ ID NO:1的位置484之后，特别是在位置485之后、特别是在位置486之后、特别是在位置487之后、特别是在位置488之后、特别是在位置489之后、特别是在位置490之后、特别是在位置491之后、特别是在位置492之后，更特别是在位置493之后被截短。

与亲本α-淀粉酶，特别是如SEQ ID NO:1-18披露的亲本相比，本发明的变体α-淀粉酶具有增加的稳定性。特别地，可以使用任何适合的α-淀粉酶或洗净测定来确定增加的稳定性。技术人员将会知道如何选择适合的测定。已经在本文实例中提供了适合的测定和条件的实例。这种增加的稳定性可以包括在pH 4.5下超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，或在模式洗涤剂A中超过亲本α-淀粉酶的螯合剂稳定性。在一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在pH 4.5下，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。

在另一个具体实施例中，如改善因子(IF)确定，在模式洗涤剂A中，根据本发明所述的变体α-淀粉酶具有超过亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。可以使用技术人员已知的任何适合的α-淀粉酶测定，例如本文实例中披露的测定中的任一种，确定残余活性。在一个具体实施例中，可以使用Phadebas活性测定确定残余活性。

在另一个实施例中，与亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶相比，在90℃、pH 4.5、5ppm Ca²⁺下孵育20min后，通过酶检测定确定，所述变体具有测量为残余α-淀粉酶活性的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11的多肽。

在一个实施例中，所述变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶产生的DE值的液化物：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11的多肽。

在一个实施例中，所述变体能够产生与由不具有要求保护的双取代的亲本α-淀粉酶，特别是选自由以下组成的组的亲本淀粉酶产生的液化物相比具有降低的粘度的液化物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、和SEQ ID NO:11的多肽。

所述变体多肽可以是一种杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

所述变体可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。

融合多肽还可包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，所述位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。

所述亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如本文中与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由所述来源或由其中已经***来自所述来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面，所述亲本是胞外分泌的。

亲本可以是细菌α-淀粉酶。例如，亲本可以是***多肽，例如芽孢杆菌属、土芽孢杆菌属、噬纤维菌属。

在一方面，所述亲本是嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、或苏云金芽孢杆菌α-淀粉酶。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，例如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoor Schimmelcultures，CBS)和美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent Culture Collection,Northern RegionalResearch Center，NRRL)。

可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得所述亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆所述多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。

变体的制备

可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，例如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。

定点诱变是在编码所述亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。

通过涉及使用含有所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包含编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将含有突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和***物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。

还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。

可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。

合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，例如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。

使用已知的诱变、重组和/或改组方法，随后进行相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或***并对其进行测试，所述相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625披露的那些。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的变体的多核苷酸。在一个实施例中，所述多核苷酸是分离的。

核酸构建体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，所述一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。

可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸***载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达所述多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以获得自编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因。

用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和在Sambrook等人,1989,同上。串联启动子的实例披露于WO 99/43835中。

控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。所述终止子序列被可操作地连接至编码所述变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

所述控制序列也可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加所述基因的表达。

适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。

控制序列还可以是编码连接至一个变体的N-末端上的一个信号肽并指导所述变体进入细胞的分泌途径的一个信号肽编码区域。所述多核苷酸的编码序列的5’-末端可以固有地含有信号肽编码序列，所述信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码所述变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可以含有对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。

所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。

还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节系统的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操纵子系统。

表达载体

本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，所述重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处***或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含所述多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中而表达所述多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(例如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。

载体优选地含有允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。

为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，所述载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，所述核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，所述复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸***宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或通过包括一个与所述多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得所述多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择含有选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此所述多核苷酸的另外的拷贝。

用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，所述一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。在一个实施例中，所述一种或多种控制序列与本发明的多核苷酸是异源的。将包含多核苷酸的构建体或载体引入到宿主细胞中，这样使得所述构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所描述。术语“宿主细胞”涵盖因复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。

宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、***链球菌(Streptococcus uberis)和马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus)细胞。

细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。

将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen,1979,Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961，J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829；或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan,1983,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人,1988,Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。可以通过如下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：例如天然感受态(natural competence)(参见，例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

产生方法

本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合于所述变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收所述变体。

使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养培养基中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。

可以使用本领域已知的对所述变体特异的方法检测所述变体。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定所述变体的活性。

可以使用本领域已知的方法回收所述变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收所述变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。

在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。

发酵液配制品或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。所述发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。所述发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，所述发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一个实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在一个具体实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且所述第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

所述细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，所述细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

本发明的全培养液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所述的方法来产生。

组合物

本发明还涉及包括本发明的变体α-淀粉酶的组合物。

这些组合物可以包含本发明的变体α-淀粉酶作为主要酶组分，例如，单组分组合物。可替代地，组合物可以包含多种酶活性，例如选自由以下组成的组的一种或多种(例如，若干种)酶：蛋白酶、葡糖淀粉酶、β-淀粉酶、支链淀粉酶。在一个具体实施例中，组合物包含本发明的变体α-淀粉酶和蛋白酶，特别是来自火球菌属物种或嗜热球菌属物种的蛋白酶，或来自橙色嗜热子囊菌的蛋白酶。

在一个实施例中，蛋白酶选自SEQ ID NO:19中所示的来自强烈火球菌的S8蛋白酶或与SEQ ID NO:19的多肽具有至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、或100％序列同一性的蛋白酶。

在另一个实施例中，蛋白酶选自变体橙色嗜热子囊菌蛋白酶，其中所述变体蛋白酶包含以下突变组合之一：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；并且所述蛋白酶变体与SEQID NO:20的多肽具有至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，以及甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。

对于本发明的α-淀粉酶变体在洗涤剂组合物中的用途，下文阐述的组合物组分的非限制性列表适合用于此类用途，例如用以辅助或增强清洁性能，用于处理有待清洁的底物，或用以修饰所述组合物的美感，就像与香料、着色剂、染料或类似物一起的情况。掺入任何组合物中的任何此类组分的水平是除了先前引用的用于掺入的任何材料之外的。这些另外的组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的清洁操作的性质。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。除非另外表明，否则以百分比计的量是按所述组合物的重量计(wt％)。

适合的组分材料包括但不限于表面活性剂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制试剂、分散剂、酶、以及酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、调色染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。除了以下披露内容，此类其他组分的适合的实例以及使用水平发现于US 5576282、US6306812和US6326348中，将其通过引用特此结合。

因此，在某些实施例中，本发明不含有以下附属材料的一种或多种：表面活性剂、皂、助洗剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、分散剂、另外的酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合物分散剂、粘土去除/抗再沉积剂、增亮剂、泡沫抑制剂、染料、香料、香料递送系统、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、加工助剂、溶剂和/或颜料。然而，当一种或多种组分存在时，这样的一种或多种组分可以如下文详述的那样存在：

表面活性剂-根据本发明的组合物可以包含表面活性剂或表面活性剂体系，其中所述表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。当存在时，表面活性剂典型地以从0.1wt％至60wt％、从0.2wt％到40wt％、从0.5wt％至30wt％、从1wt％至50wt％、从1wt％至40wt％、从1wt％至30wt％、从1wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从3wt％至5wt％、从5wt％至40wt％、从5wt％至30wt％、从5wt％至15wt％、从3wt％至20wt％、从3wt％至10wt％、从8wt％至12wt％、从10wt％至12wt％、从20wt％至25wt％或从25wt％-60wt％的水平存在。

适合的阴离子去污表面活性剂包括硫酸盐和磺酸盐去污表面活性剂。

适合的磺酸盐去污表面活性剂包括烷基苯磺酸盐，在一方面为C_10-13烷基苯磺酸盐。适合的烷基苯磺酸盐(LAS)可以通过使可商购的直链烷基苯(LAB)磺化而得到；适合的LAB包括低2-苯基LAB，例如

或其他适合的LAB包括高2-苯基LAB，例如适合的阴离子去污表面活性剂是通过DETAL催化工艺获得的烷基苯磺酸盐，但其他合成路线(例如HF)也可以是适合的。在一方面，使用LAS的镁盐。

适合的硫酸盐去污表面活性剂包括烷基硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基硫酸盐，或主要为C₁₂烷基硫酸盐。

另外的适合的硫酸盐去污表面活性剂是烷基烷氧基化硫酸盐，在一方面为烷基乙氧基化硫酸盐，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化硫酸盐，在另一方面为C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，典型地烷基烷氧基化硫酸盐具有从0.5至20或从0.5至10的平均烷氧基化度，典型地烷基烷氧基化硫酸盐是C_8-18烷基乙氧基化硫酸盐，具有0.5至10、从0.5至7、从0.5至5或从0.5至3的平均乙氧基化度。

烷基硫酸盐、烷基烷氧基化硫酸盐和烷基苯磺酸盐可以是直链或支链的、取代或未取代的。

去污表面活性剂可以是中链分支的去污表面活性剂，在一方面为中链分支的阴离子去污表面活性剂，在一方面为中链分支的烷基硫酸盐和/或中链分支的烷基苯磺酸盐，例如中链分支的烷基硫酸盐。在一方面，中链分支是C_1-4烷基，典型地为甲基和/或乙基。

阴离子型表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(例如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡烃磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺酸基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括磺酸甲酯(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺酸基琥珀酸或皂的二酯和单酯、及其组合。

适合的非离子去污表面活性剂选自由以下组成的组：C₈-C₁₈烷基乙氧基化物，例如

C₆-C₁₂烷基苯酚烷氧基化物，其中所述烷氧基化物单元可以是乙烯氧基单元，丙烯氧基单元或其混合物；C₁₂-C₁₈醇和C₆-C₁₂烷基苯酚与环氧乙烷/环氧丙烷嵌段聚合物的缩合物，例如

C₁₄-C₂₂中链分支的醇；C₁₄-C₂₂中链分支的烷基烷氧基化物，典型地具有从1至30的平均烷氧基化度；烷基多糖，在一方面为烷基多糖苷；多羟基脂肪酸酰胺；醚封端的聚(烷氧基化)醇表面活性剂；及其混合物。

适合的非离子去污表面活性剂包括烷基多糖苷和/或烷基烷氧基化醇。

在一方面，非离子去污表面活性剂包括烷基烷氧基化醇，在一方面为C_8-18烷基烷氧基化醇，例如C_8-18烷基乙氧基化醇，所述烷基烷氧基化醇可以具有从1至50、从1至30、从1至20、或从1至10的平均烷氧基化度。在一方面，烷基烷氧基化醇可以是C_8-18烷基乙氧基化醇，具有从1至10、从1至7，更多是从1至5或从3至7的平均乙氧基化度。烷基烷氧基化醇可以是直链或支链的、以及取代或未取代的。适合的非离子型表面活性剂包括

非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(例如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及可以商品名SPAN和TWEEN获得的产品、及其组合。

适合的阳离子去污表面活性剂包括烷基吡啶化合物、烷基季铵化合物、烷基季鏻化合物、烷基三锍化合物及其混合物。

适合的阳离子去污表面活性剂是具有以下通式的季铵化合物：(R)(R₁)(R₂)(R₃)N⁺X^-，其中R是直链或支链的、取代或未取代的C_6-18烷基或烯基部分，R₁和R₂独立地选自甲基或乙基部分，R₃是羟基、羟甲基或羟乙基部分，X是提供电荷中性的阴离子，适合的阴离子包括卤化物，例如氯化物；硫酸盐；以及磺酸盐。适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_6-18烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。高度适合的阳离子去污表面活性剂是单-C_8-10烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物、单C_10-12烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物以及单-C₁₀烷基单-羟乙基二甲基季铵氯化物。

阳离子型表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。

适合的两性表面活性剂/兼性离子型表面活性剂包括氧化胺和甜菜碱(例如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱)、或其组合。本发明的胺中和的阴离子型表面活性剂-阴离子型表面活性剂以及辅助的阴离子辅助表面活性剂可以按酸形式存在，并且所述酸形式可以被中和以形成希望用于本发明的洗涤剂组合物的表面活性剂盐。典型的用于中和的试剂包括金属反离子碱，例如氢氧化物，例如NaOH或KOH。用于中和本发明的阴离子型表面活性剂和处于其酸形式的辅助阴离子型表面活性剂或助表面活性剂的另外优选的试剂包括氨、胺或烷醇胺。优选烷醇胺。适合的非限制性实例包括单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、以及其他本领域中已知的直链或支链的烷醇胺；例如，高度优选的烷醇胺包括2-氨基-1-丙醇、1-氨基丙醇、单异丙醇胺、或1-氨基-3-丙醇。胺中和可以进行到完全或部分的程度，例如，阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被钠或钾中和，并且阴离子型表面活性剂混合物的部分可以被胺或烷醇胺中和。

半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，例如烷基二甲胺氧化物。

包含一种或多种阴离子型表面活性剂、和另外一种或多种非离子型表面活性剂、以及任选的例如阳离子型表面活性剂的另外表面活性剂的混合物的表面活性剂系统可能是优选的。优选的阴离子与非离子型表面活性剂的重量比是至少2:1、或至少1:1至1:10。

在一方面，表面活性剂系统可以包括由化学式A以及化学式B代表的类异戊二烯表面活性剂的一种混合物：

其中Y是CH₂或无，并且Z可以如此选择以使得所得的表面活性剂是选自以下表面活性剂：烷基羧酸酯表面活性剂、烷基多烷氧基表面活性剂、烷基阴离子型多烷氧基硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯磺酸酯表面活性剂、烷基二甲基氧化胺表面活性剂、基于烷基多羟基的表面活性剂、烷基磷酸酯表面活性剂、烷基甘油磺酸酯表面活性剂、烷基多葡糖酸酯表面活性剂、烷基多磷酸酯表面活性剂、烷基膦酸酯表面活性剂、烷基多糖苷表面活性剂、烷基单糖苷表面活性剂、烷基二糖苷表面活性剂、烷基磺基琥珀酸酯表面活性剂、烷基二硫酸酯表面活性剂、烷基二磺酸酯表面活性剂、烷基磺化琥珀酰胺酸酯表面活性剂、烷基葡萄糖酰胺表面活性剂、烷基牛磺酸酯表面活性剂、烷基肌氨酸酯表面活性剂、烷基甘氨酸酯表面活性剂、烷基羟乙基磺酸酯表面活性剂、烷基二链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺表面活性剂、烷基单链烷醇酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺表面活性剂、烷基二羟基乙酰胺硫酸酯表面活性剂、烷基甘油酯表面活性剂、烷基甘油酯硫酸酯表面活性剂、烷基甘油醚表面活性剂、烷基甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基甲基酯磺酸酯表面活性剂、烷基多甘油醚表面活性剂、烷基多甘油醚硫酸酯表面活性剂、烷基山梨聚糖酯表面活性剂、烷基氨基烷烃磺酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基甜菜碱表面活性剂、基于烷基烯丙基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基单羟基烷基-二-烷基化季铵盐的表面活性剂、基于烷基二-羟基烷基单烷基季铵盐的表面活性剂、烷基化季铵盐表面活性剂、烷基三甲基铵季铵盐表面活性剂、基于烷基多羟基烷基氧基丙基季铵盐的表面活性剂、烷基甘油酯季铵盐表面活性剂、烷基乙二醇胺季铵盐表面活性剂、烷基单甲基二羟基乙基季铵表面活性剂、烷基二甲基单羟基乙基季铵表面活性剂、烷基三甲基铵表面活性剂、基于烷基咪唑啉的表面活性剂、烯烃-2-基-琥珀酸酯表面活性剂、烷基a-磺化羧酸表面活性剂、烷基a-磺化羧酸烷基酯表面活性剂、α烯烃磺酸酯表面活性剂、烷基苯酚乙氧基化物表面活性剂、烷基苯磺酸酯表面活性剂、烷基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基羟基磺基甜菜碱表面活性剂、烷基铵基羧酸甜菜碱表面活性剂、烷基蔗糖酯表面活性剂、烷基烷醇酰胺表面活性剂、烷基二(聚氧化乙烯)单烷基铵表面活性剂、烷基单(聚氧化乙烯)二烷基铵表面活性剂、烷基苄基二甲基铵表面活性剂、烷基氨基丙酸酯表面活性剂、烷基酰胺丙基二甲胺表面活性剂、或其混合物；并且如果Z是带电部分，则Z通过适合的金属或有机反离子被电荷平衡。适合的反离子包括金属反离子、胺、或烷醇胺，例如C1-C6烷醇铵。更确切地说，适合的反离子包括Na+、Ca+、Li+、K+、Mg+，例如单乙醇胺(MEA)、二乙醇胺(DEA)、三乙醇胺(TEA)、2-氨基-l-丙醇、1-氨基丙醇、甲基二乙醇胺、二甲基乙醇胺、单异丙醇胺、三异丙醇胺、l-氨基-3-丙醇、或其混合物。在一个实施例中，所述组合物含有从5％至97％的一种或多种非类异戊二烯表面活性剂，以及一种或多种附属清洁添加剂，其中具有式A的表面活性剂与具有式B的表面活性剂的重量比是50:50至95:5。

皂-本文的组合物可以含有皂。不受理论的限制，可令人希望的是包括皂，因为它部分充当表面活性剂并且部分充当助洗剂，并且可用于抑制泡沫，并且此外，可以有利地与组合物的多种阳离子化合物相互作用以增强用本发明组合物处理的纺织品织物的柔软性。可以利用本领域中已知的用于在衣物洗涤洗涤剂中使用的任何皂。在一个实施例中，这些组合物含有从0wt％至20wt％、从0.5wt％至20wt％、从4wt％至10wt％、或从4wt％至7wt％的皂。

本文有用的皂的实例包括油酸皂、棕榈酸皂、棕榈仁脂肪酸皂及其混合物。典型的皂处于具有不同链长和取代度的脂肪酸皂混合物的形式。一种这样的混合物是拔顶棕榈仁脂肪酸。

在一个实施例中，所述皂选自游离脂肪酸。适合的脂肪酸是饱和的和/或不饱和的并且可以从天然来源如植物或动物酯(例如，棕榈仁油、棕榈油、椰子油、巴巴苏油、红花油、妥尔油、蓖麻油、牛油和鱼油、油脂、及其混合物)中获得，或合成地制备(例如，经由石油的氧化或者经由费托法(Fisher Tropsch process)氢化一氧化碳)。

用于在本发明组合物中使用的适合的饱和脂肪酸的实例包括癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸和山萮酸。适合的不饱和脂肪酸种类包括：棕榈油酸、油酸、亚麻油酸、亚麻酸和蓖麻油酸。优选的脂肪酸的实例是饱和Cn脂肪酸、饱和Ci₂-Ci₄脂肪酸、和饱和或不饱和的Cn至Ci₈脂肪酸及其混合物。

当存在时，织物软化阳离子辅助表面活性剂与脂肪酸的重量比优选地是从约1:3至约3:1，更优选地从约1:1.5至约1.5:1，最优选地约1:1。

本文的皂和非皂阴离子型表面活性剂的水平是以酸式基础指定的按洗涤剂组合物的重量计的百分比。然而，正如本领域中通常理解的，在实践中使用钠、钾或链烷醇铵碱例如氢氧化钠或单乙醇胺中和阴离子型表面活性剂和皂。

水溶助剂-本发明的组合物可以包含一种或多种水溶助剂。水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而水溶助剂的分子结构一般并不有利于自发自聚集，参见例如Hodgdon和Kaler(2007),Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体及界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了含有极性和非极性特征的物质的系统(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，例如相分离或高粘度。

洗涤剂可以含有从0至10wt％，例如从0至5wt％、0.5wt％至5wt％、或从3wt％至5wt％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠及其组合。

助洗剂-本发明的组合物可以包含一种或多种助洗剂、共助洗剂、助洗剂系统或其混合物。当使用助洗剂时，清洁组合物将典型地包含从0至65wt％、至少1wt％、从2wt％至60wt％或从5wt％至10wt％的助洗剂。在洗涤餐具清洁组合物中，助洗剂的水平典型地是40wt％至65wt％或50wt％至65wt％。所述组合物可以是基本上不含助洗剂；基本上不含意指“没有有意添加的”沸石和/或磷酸盐。典型的沸石助洗剂包括沸石A、沸石P和沸石MAP。典型的磷酸盐助洗剂是三聚磷酸钠。

助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合剂。可以使用本领域中已知用于在洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐例如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐例如碳酸钠、可溶性硅酸盐例如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺(例如2-氨基乙-1-醇(MEA)、亚氨基二乙醇(DEA)和2,2’,2”-次氮基三乙醇(TEA))、以及羧甲基菊粉(CMI)、及其组合。

清洁组合物可以单独地包括共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，例如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(例如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和磷酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二琥珀酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二基双(膦酸)(HEDP)、乙二胺四(亚甲基)四(膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基)五(膦酸)(DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、对氨基苯磺酸-N、N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)和磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(羟乙基)-亚乙基二胺三乙酸(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。另外的示例性助洗剂和/或共助洗剂描述于例如WO09/102854、US 5977053中。

螯合试剂和晶体生长抑制剂-本文的组合物可以含有螯合试剂和/或晶体生长抑制剂。适合的分子包括铜、离子和/或锰螯合试剂及其混合物。适合的分子包括DTPA(二亚乙基三胺五乙酸)、HEDP(羟基乙烷二膦酸)、DTPMP(二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸))、1,2-二羟基苯-3,5-二磺酸二钠盐水合物、乙二胺、二亚乙基三胺、乙二胺二琥珀酸(EDDS)、N-羟基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、N-羟基乙基亚氨基二乙酸(HEIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、亚乙基二胺四丙酸(EDTP)、羧甲基菊粉以及2-膦酰基丁烷1,2,4-三羧酸(

AM)及其衍生物。典型地，所述组合物可以包含从0.005wt％至15wt％，或从3.0wt％至10wt％的螯合试剂或晶体生长抑制剂。

漂白组分-适合用于掺入本发明的方法和组合物中的漂白组分包括多于一种漂白组分中的一种或混合物。适合的漂白组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸及其混合物。通常，当使用漂白组分时，本发明的组合物可以包含从0至30wt％、从0.00001wt％至90wt％、0.0001wt％至50wt％、从0.001wt％至25wt％或从1wt％至20wt％。适合的漂白组分的实例包括：

(1)预形成的过酸：适合的预形成的过酸包括但不限于选自由以下组成的组的化合物：预形成的过氧酸或其盐，典型地是过氧羧酸或其盐、或过氧硫酸或其盐。

预形成的过氧酸或其盐优选是过氧羧酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁴选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁴基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；且Y是实现电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Y选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁴是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，过氧酸或其盐选自过氧己酸、过氧庚酸、过氧辛酸、过氧壬酸、过氧癸酸、及其盐，或其任何组合。特别优选的过氧酸是邻苯二甲酰亚胺基-过氧基-链烷酸，特别是ε-邻苯二甲酰亚胺基过氧基己酸(PAP)。优选地，过氧酸或其盐具有从30℃至60℃范围内的熔点。

预成形的过氧酸或其盐还可以是过氧硫酸或其盐，典型地具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：R¹⁵选自烷基、芳烷基、环烷基、芳基或杂环基团；R¹⁵基团可以是直链或支链的、取代或未取代的；并且Z是达到电荷中性的任何适合的反离子，优选地，Z选自氢、钠或钾。优选地，R¹⁵是直链或支链的、取代或未取代的C_6-9烷基。优选地，此类漂白组分可以按从0.01wt％至50wt％或从0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(2)过氧化氢源包括例如无机过氧化氢合物盐，包括碱金属盐，例如过硼酸盐(通常是一水合物或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐的钠盐及其混合物。在本发明的一方面，无机过氧化氢合物盐是例如选自由以下组成的组的那些：过硼酸盐、过碳酸盐的钠盐及其混合物。当使用时，无机过氧化氢合物盐典型地以整体组合物的0.05wt％至40wt％或1wt％至30wt％的量存在并且典型地被掺入此类组合物中作为可以被涂覆的结晶固体。适合的包衣包括：无机盐，例如碱金属硅酸盐、碳酸盐或硼酸盐或其混合物，或有机材料，例如水溶性或水分散性聚合物、蜡、油或脂肪皂。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

(3)术语漂白活化剂本文意指与过氧化氢反应以经由过水解反应形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的漂白活化剂是具有R-(C＝O)-L的那些，其中R是烷基基团(优选是支链的)，当所述漂白活化剂是疏水的时候，具有从6个至14个碳原子或从8个至12个碳原子，并且当所述漂白活化剂是亲水的时，具有小于6个碳原子或小于4个碳原子；并且L是离去基团。适合的离去基团的实例是苯甲酸及其衍生物-尤其是苯磺酸盐。适合的漂白活化剂包括十二酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯磺酸盐、癸酰氧基苯甲酸或其盐、3,5,5-三甲基己酰氧基苯磺酸盐、四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS))、和/或披露于WO 98/17767中的那些。漂白活化剂的家族披露于EP 624154中并且在那个家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白系统可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白系统还可以包含过酸，例如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。适合的漂白活化剂还披露于WO 98/17767中。尽管可采用任何适合的漂白活化剂，但在本发明的一方面，本主题清洁组合物可以包含NOBS、TAED或其混合物。当存在时，基于织物及家居护理组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以0.1wt％至60wt％、0.5wt％至40wt％或0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。优选地，此类漂白组分可以按0.01wt％至50wt％或0.1wt％至20wt％的量存在于本发明的组合物中。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1，或甚至2:1至10:1。

(4)二酰基过氧化物-优选的二酰基过氧化物漂白种类包括选自具有以下通式的二酰基过氧化物的那些：R¹-C(O)-OO-(O)C-R²，其中R¹表示C₆-C₁₈烷基，优选地是含有具有至少5个碳原子的直链并且任选地含有一个或多个取代基(例如-N⁺(CH₃)₃、-COOH或-CN)和/或在烷基的相邻碳原子之间***的一个或多个中断部分(例如-CONH-或-CH＝CH-)的C₆-C₁₂烷基基团，并且R²表示与过氧化物部分可相容的脂肪族基团，以使得R¹和R²一起含有总共8个至30个碳原子。在一个优选方面，R¹和R²是直链的未取代的C₆-C₁₂烷基链。最优选地，R¹和R²是相同的。二酰基过氧化物(其中R¹和R²均是C₆-C₁₂烷基基团)是特别优选的。优选地，R基团(R₁或R₂)中的至少一个、最优选地仅有一个在α位不含有分支环或侧基环，或优选在α位或β位都不含有分支环或侧基环，或最优选在α位或β位或γ位都不含有分支环或侧基环。在一个另外优选的实施例中，DAP可以是不对称的，这样使得R1酰基基团优选地迅速水解以产生过酸，但是R2酰基基团的水解缓慢。

四酰基过氧化物漂白性种类优选地选自以下通式的四酰基过氧化物：R³-C(O)-OO-C(O)-(CH₂)n-C(O)-OO-C(O)-R³，其中R³表示C₁-C₉烷基或C₃-C₇基团，并且n表示从2至12或4至10(包括端值)的整数。

优选地，二酰基和/或四酰基过氧化物漂白种类以足够提供按重量计至少0.5ppm、至少10ppm、或至少50ppm的洗涤液的量存在。在一个优选实施例中，这些漂白种类以足够提供按重量计从0.5ppm至300ppm、从30ppm至150ppm的洗涤液的量存在。

优选地，漂白组分包括漂白催化剂(5和6)。

(5)优选的是有机(非金属)漂白催化剂，包括能够接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子并且将所述氧原子转移至可氧化的底物的漂白催化剂。适合的漂白催化剂包括但不限于：亚胺阳离子和聚离子；亚胺兼性离子；修饰的胺；修饰的氧化胺；N-磺酰基亚胺；N-磷酰基亚胺；N-酰基亚胺；噻二唑二氧化物；全氟亚胺；环状糖酮及其混合物。

适合的亚胺鎓阳离子和聚离子包括但不限于，N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓四氟硼酸盐，如Tetrahedron[四面体](1992)，49(2)，423-38中所述的进行制备(例如化合物4，第433页)；N-甲基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360569所述的进行制备(例如第11栏，实例1)；以及正辛基-3,4-二氢异喹啉鎓对-甲苯磺酸盐，如US 5360568所述的进行制备(例如第10栏，实例3)。

适合的亚胺鎓兼性离子包括但不限于，N-(3-磺丙基)-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5576282中所述的进行制备(例如第31栏，实例II)；N-[2-(磺氧基)十二烷基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如US 5817614中所述的进行制备(例如，第32栏，实例V)；2-[3-[(2-乙基己基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐，如WO 05/047264中所述的进行制备(例如，第18页，实例8)，以及2-[3-[(2-丁基辛基)氧基]-2-(磺氧基)丙基]-3,4-二氢异喹啉鎓，内盐。

适合的修饰的胺氧转移催化剂包括但不限于1,2,3,4-四氢-2-甲基-1-异喹啉醇，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1987),28(48),6061-6064中描述的程序制备。适合的修饰的氧化胺氧气转移催化剂包括但不限于1-羟基-N-氧代-N-[2-(磺氧基)癸基]-1,2,3,4-四氢异喹啉钠。

适合的N-磺酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-1,2-苯并异噻唑1,1-二氧化物，其可根据Journal of Organic Chemistry[有机化学杂志](1990)，55(4),1254-61中描述的程序制备。

适合的N-膦酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于[R-(E)]-N-[(2-氯-5-硝基苯基)亚甲基]-对苯基-对-(2,4,6-三甲基苯基)次膦酸酰胺，其可根据Journal of theChemical Society[化学学会杂志],Chemical Communications[化学通讯](1994),(22),2569-70中描述的程序制备。

适合的N-酰基亚胺氧转移催化剂包括但不限于可以[N(E)]-N-(苯基亚甲基)乙酰胺，其可根据Polish Journal of Chemistry[波兰化学杂志](2003),77(5),577-590中描述的程序制备。

适合的噻二唑二氧化物氧转移催化剂包括但不限于3-甲基-4-苯基-1,2,5-噻二唑1,1-二氧化物，其可根据US 5753599(第9栏，实例2)中描述的程序制备。

适合的全氟亚胺氧转移催化剂包括但不限于(Z)-2,2,3,3,4,4,4-七氟-N-(壬氟丁基)丁酰亚胺氟化物，其可根据Tetrahedron Letters[四面体通讯](1994),35(34),6329-30中描述的程序制备。

适合的环状糖酮氧传递催化剂包括但不限于如在US 6649085(第12栏，实例1)中制备的1,2:4,5-二-O-异亚丙基-D-赤-2,3-己二酮(hexodiuro)-2,6-吡喃糖。

优选地，漂白催化剂包含亚胺离子和/或羰基官能团，并且典型地能够在接受氧原子，尤其是从过氧酸和/或其盐接受氧原子后形成过氧亚胺正离子(oxaziridinium)和/或双环氧乙烷官能团。优选地，漂白催化剂包含过氧亚胺正离子官能团和/或在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成过氧亚胺正离子官能团。优选地，漂白催化剂包含环状亚胺离子官能团，优选其中所述环状部分具有从五个至八个原子(包括氮原子)、优选六个原子的环大小。优选地，漂白催化剂包含芳基亚胺离子官能团，优选二环芳基亚胺官能团，优选是3,4-二氢异喹啉鎓官能团。典型地，亚胺官能团是季亚胺官能团并且典型地在接受氧原子时，尤其是在接受来自过氧酸和/或其盐的氧原子时能够形成季过氧亚胺正离子官能团。在另一方面，所述洗涤剂组合物包括具有不大于0、不大于-0.5、不大于-1.0、不大于-1.5、不大于-2.0、不大于-2.5、不大于-3.0、或不大于-3.5的logP_o/w的漂白组分。下面更加详细地描述用于确定logP_o/w的方法。

典型地，漂白成分能够产生具有从0.01至0.30、从0.05至0.25或从0.10至0.20的X_SO的漂白种类。下面更加详细地描述用于确定X_SO的方法。例如，具有异喹啉鎓结构的漂白成分能够产生具有过氧亚胺正离子结构的漂白种类。在此实例中，X_SO是过氧亚胺正离子漂白种类的X_SO。

优选地，漂白催化剂具有对应于以下化学式的化学结构：

其中：n和m独立地为0至4，优选n和m均为0；每个R¹独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团选自由以下组成的组：氢、烷基、环烷基、芳基、稠合芳基、杂环、稠合杂环、硝基、卤基、氰基、磺酸根、烷氧基、酮基、羧基以及烷氧羰基；并且任何两个连位的R¹取代基可以合并以形成稠合芳基、稠合碳环或稠合杂环；每个R²独立地选自取代的或未取代的基团，所述基团独立地选自由以下组成的组：氢、羟基、烷基、环烷基、烷芳基、芳基、芳烷基、亚烷基、杂环、烷氧基、芳基羰基、羧基烷基以及酰胺基团；任何R²可以与任何其他的R²结合在一起以形成常见环的一部分；任何偕R²可以合并以形成羰基；并且任何两个R²可以合并以形成取代的或未取代的稠合的不饱和部分；R³是C₁至C₂₀取代的或未取代的烷基；R⁴是氢或Q_t-A部分，其中：Q是分支或未分支的烯烃，t＝0或1，并且A是选自由以下组成的组的阴离子基团：OSO₃ ^-、SO₃ ^-、CO₂ ^-、OCO₂ ^-、OPO₃ ^2-、OPO₃H^-和OPO₂ ^-；R⁵是氢或部分-CR¹¹R¹²-Y-G_b-Y_c-[(CR⁹R¹⁰)_y-O]_k-R⁸，其中：每个Y独立地选自由以下组成的组：O、S、N-H或N-R⁸；并且每个R⁸独立地选自由以下组成的组：烷基、芳基和杂芳基，所述部分是取代或未取代的，并且无论是取代的还是未取代的，所述部分具有少于21个碳；每个G独立地选自由以下组成的组：CO、SO₂、SO、PO和PO₂；R⁹和R¹⁰独立地选自由以下组成的组：H和C₁-C₄烷基；R¹¹和R¹²独立地选自由以下组成的组：H和烷基，或者当放一起时可以结合形成羰基；b＝0或1；c可以＝0或1，但是如果b＝0，c必须＝0；y是从1至6的整数；k是从0至20的整数；R⁶是H，或是烷基、芳基或杂芳基部分；所述部分是取代或未取代的；并且如果X存在的话，它是适合的电荷平衡反离子，当R⁴为氢时X优选存在，适合的X包括但不限于：氯化物、溴化物、硫酸盐、甲硫酸盐、磺酸盐、对甲苯磺酸盐、四氟化硼合磷酸盐。

在本发明的一个实施例中，漂白催化剂具有对应于以下通式的结构：

其中R¹³是含有从三个至24个碳原子(包括分支的碳原子)的支链烷基或含有从一个至24个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³是含有从八个至18个碳原子的支链烷基或含有从八个至十八个碳原子的直链烷基；优选地，R¹³选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、正十二烷基、正十四烷基、正十六烷基、正十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基和异十五烷基；优选地，R¹³选自由以下组成的组：2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、异-十三烷基和异-十五烷基。

优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸的来源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过碳酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；以及(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬质表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。

当存在时，基于所述组合物，过酸和/或漂白活化剂通常以从0.1wt％至60wt％、从0.5wt％至40wt％或从0.6wt％至10wt％的量存在于组合物中。可以将一种或多种疏水性过酸或其前体与一种或多种亲水性过酸或其前体组合使用。

可以对过氧化氢源和过酸或漂白活化剂的量进行选择，以使得可用氧(来自过氧化物源)与过酸的摩尔比是从1:1至35:1、或2:1至10:1。

(6)包含金属的漂白催化剂-可以由催化金属络合物提供漂白组分。一种类型的含有金属的漂白催化剂是以下催化系统，所述催化系统包含具有限定的漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)，具有很少或不具有漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如锌或铝阳离子)，以及对于催化性和辅助性金属阳离子具有限定的稳定性常数的隔离物，特别是乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)及其水溶性盐。此类催化剂披露于US 4430243中。优选的催化剂描述于WO 09/839406、US 6218351和WO 00/012667中。特别优选的是过渡金属催化剂或因此作为交联桥多齿N-供体配体的配体。

如果希望的话，可以借助锰化合物催化本文的组合物。此类化合物以及使用水平在本领域中是熟知的并且包括例如披露于US 5576282中的基于锰的催化剂。

本文有用的钴漂白催化剂是已知的并且例如描述于US 5597936；US 5595967中。通过已知的程序可容易地制备此类钴催化剂，像例如US 5597936和US 5595967中传授的程序。

本文的组合物还可以适合地包括配体的过渡金属络合物，例如双哌啶酮(bispidone)(US 7501389)和/或大多环刚性配体-缩写为“MRL”。作为一个实际问题而并不作为限制之用，可以调节本文的组合物和方法，以在水性洗涤介质中提供大约至少一亿分之一的活性MRL种类，并且将典型地在洗涤液中提供从0.005ppm至25ppm、从0.05ppm至10ppm、或从0.1ppm至5ppm的MRL。

本发明的过渡金属漂白催化剂中的适合的过渡金属包括例如锰、铁和铬。适合的MRL包括5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷。通过已知的程序可容易地制备适合的过渡金属MRL，像例如US 6225464和WO 00/32601中传授的程序。

(7)光漂白剂-适合的光漂白剂包括例如磺化的酞菁锌、磺化的酞菁铝、呫吨染料及其混合物。用于在本发明的组合物中使用的优选漂白组分包含过氧化氢源、漂白活化剂和/或有机过氧酸，任选地通过过氧化氢源和漂白活化剂与漂白催化剂相组合的反应而原位产生。优选的漂白组分包含漂白催化剂，优选如上文所述的有机漂白催化剂。

特别优选的漂白组分是漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂。

示例性漂白系统还描述于例如WO 2007/087258、WO 2007/087244、WO 2007/087259以及WO 2007/087242中。

织物调色剂-组合物可以包含织物调色剂。适合的织物调色剂包括染料、染料-粘***轭物、以及颜料。适合的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自由属于以下比色指数(C.I.)分类的染料组成的组的小分子染料：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红或其混合物。

在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会(Society of Dyers and Colorists)，布拉德福德，英国)编号直接紫9、直接紫35、直接紫48、直接紫51、直接紫66、直接紫99、直接蓝1、直接蓝71、直接蓝80、直接蓝279、酸性红17、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性紫15、酸性紫17、酸性紫24、酸性紫43、酸性红52、酸性紫49、酸性紫50、酸性蓝15、酸性蓝17、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝40、酸性蓝45、酸性蓝75、酸性蓝80、酸性蓝83、酸性蓝90和酸性蓝113、酸性黑1、碱性紫1、碱性紫3、碱性紫4、碱性紫10、碱性紫35、碱性蓝3、碱性蓝16、碱性蓝22、碱性蓝47、碱性蓝66、碱性蓝75、碱性蓝159及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、酸性紫43、酸性红52、酸性红73、酸性红88、酸性红150、酸性蓝25、酸性蓝29、酸性蓝45、酸性蓝113、酸性黑1、直接蓝1、直接蓝71、直接紫51及其混合物。在另一方面，适合的小分子染料包括选自由以下组成的组的小分子染料：比色指数(染工和着色师学会，布拉德福德，英国)编号酸性紫17、直接蓝71、直接紫51、直接蓝1、酸性红88、酸性红150、酸性蓝29、酸性蓝113或其混合物。

适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：含有共轭色原体的聚合物(染料-聚合物共轭物)以及色原体共聚到聚合物主链中的聚合物，及其混合物。

在另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：在(美利肯(Milliken))名称之下出售的织物实质性着色剂，从至少一种反应性染料和选自由以下组成的组的聚合物形成的染料-聚合物轭合物：包含选自由羟基部分、一级胺部分、二级胺部分、硫醇部分及其混合物组成的组的部分的聚合物。在再另一方面，适合的聚合物染料包括选自由以下组成的组的聚合物染料：

紫色CT，与活性蓝、活性紫或活性红染料轭合的羧甲基纤维素(CMC)，例如与C.I.活性蓝19(由麦格酶公司(Megazyme)，威克洛，爱尔兰，在产品名AZO-CM-CELLULOSE产品代码S-ACMC下出售)轭合的CMC，烷氧基化的三苯基-甲烷聚合物着色剂，烷氧基化的噻吩聚合物着色剂，及其混合物。

优选的调色染料包括发现于WO08/87497中的增白剂。这些增白剂可以由以下结构(I)表征：

其中R₁和R₂可以独立地选自：

a)[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

b)R₁＝烷基、芳基或芳基烷基，并且R₂＝[(CH₂CR'HO)_x(CH₂CR"HO)_yH]

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤10；其中y≥1；并且其中z＝0至5；

c)R₁＝[CH₂CH₂(OR₃)CH₂OR₄]并且R₂＝[CH₂CH₂(O R₃)CH₂O R₄]

其中R₃选自由以下组成的组：H、(CH₂CH₂O)_zH及其混合物；并且其中z＝0至10；

其中R₄选自由以下组成的组：(C₁-C₁₆)烷基、芳基基团、及其混合物；并且

d)其中R1和R2可以独立地选自氧化苯乙烯、缩水甘油甲醚、异丁基缩水甘油醚、异丙基缩水甘油醚、叔丁基缩水甘油醚、2-乙基己基缩水甘油醚、以及缩水甘油十六烷基醚的氨基加成产物，随后为从1至10个环氧烷单位的加成。

本发明的优选增白剂可以由以下结构(II)表征：

其中R’选自由以下组成的组：H、CH₃、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中R”选自由以下组成的组：H、CH₂O(CH₂CH₂O)_zH、及其混合物；其中x+y≤5；其中y≥1；并且其中z＝0至5。

本发明的另外优选的增白剂可以由以下结构(III)表征：

典型地包含具有一共5个EO基团的混合物。适合的优选分子是在结构I中的具有在上文中“部分a”中的以下侧基的那些。

R1

R2

R’

R”

X

y

R’

R”

x

y

A

H

H

3

1

H

H

0

1

B

H

H

2

1

H

H

1

1

c＝b

H

H

1

1

H

H

2

1

d＝a

H

H

0

1

H

H

3

1

使用的另外的增白剂包括描述于US 2008/34511(联合利华(Unilever))中的那些。优选的试剂是“紫色13”。

适合的染料粘***轭物包括选自下组的染料粘***轭物，所述组包含至少一种阳离子/碱性染料和绿土及其混合物。在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自由以下组成的组的染料粘土轭合物：选自由以下组成的组的一种阳离子/碱性染料：C.I.碱性黄1至108、C.I.碱性橙1至69、C.I.碱性红1至118、C.I.碱性紫1至51、C.I.碱性蓝1至164、C.I.碱性绿1至14、C.I.碱性棕1至23、CI碱性黑1至11，和选自由以下组成的组的一种粘土：蒙脱石粘土、水辉石粘土、皂石粘土及其混合物。仍在另一方面，适合的染料粘土轭合物包括选自由以下组成的组的染料粘土轭合物：蒙脱石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，蒙脱石碱性蓝B9C.I.52015共轭物，蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B7C.I.42595共轭物，锂蒙脱石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，锂蒙脱石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，锂蒙脱石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，锂蒙脱石碱性红R1 C.I.45160共轭物，锂蒙脱石C.I.碱性黑2共轭物，皂石碱性蓝B7 C.I.42595共轭物，皂石碱性蓝B9 C.I.52015共轭物，皂石碱性紫V3 C.I.42555共轭物，皂石碱性绿G1 C.I.42040共轭物，皂石碱性红R1C.I.45160共轭物，皂石C.I.碱性黑2共轭物及其混合物。

适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：黄士酮、阴丹酮、含有从1至4个氯原子的含氯阴丹酮、皮蒽酮、二氯皮蒽酮、单溴二氯皮蒽酮、二溴二氯皮蒽酮、四溴皮蒽酮、二萘嵌苯-3,4,9,10-四羧酸二酰亚胺(其中所述酰亚胺基团可以是未取代的或被C1-C3-烷基或苯基或杂环基团取代的，并且其中所述苯基和杂环基团可以另外地带有不赋予在水中的溶解性的取代基)、蒽素嘧啶羧酸酰胺、蒽酮紫、异蒽酮紫、二噁嗪颜料、每个分子可以含有高达2个氯原子的酞菁铜、多氯-酞菁铜或每个分子含有高达14个溴原子的多溴氯-酞菁铜，及其混合物。

在另一方面，适合的颜料包括选自由以下组成的组的颜料：群青蓝(C.I.颜料蓝29)、群青紫罗兰(C.I.颜料紫罗兰15)以及其混合物。

上述织物调色剂可以组合使用(可以使用织物调色剂的任何混合物)。适合的调色剂更详细地描述于US 7208459中。染料在本发明的组合物中的优选水平是0.00001wt％至0.5wt％、或0.0001wt％至0.25wt％。优选在水中用于处理和/或清洁步骤的染料的浓度是从1ppb至5ppm、10ppb至5ppm或20ppb至5ppm。在优选的组合物中，表面活性剂的浓度将是从0.2至3g/l。

胶囊化物-组合物可以包含胶囊化物。在一方面，胶囊化物包含核心、具有内表面和外表面的包壳，所述包壳封装所述核心。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含选自由以下组成的组的材料：香料增亮剂；染料；驱虫剂；硅酮；蜡；调味剂；维生素；织物软化剂；护肤剂；在一方面，石蜡；酶；抗细菌剂；漂白剂；感受剂(sensate)；及其混合物；并且所述包壳可以包含选自由以下组成的组的材料：聚乙烯；聚酰胺；聚乙烯醇，任选地含有其他共聚单体；聚苯乙烯；聚异戊二烯；聚碳酸酯；聚酯；聚丙烯酸酯；氨基塑料，在一方面，所述氨基塑料可以包含聚脲、聚氨酯和/或聚脲聚氨酯，在一方面，所述聚脲可以包含聚氧基亚甲基脲和/或三聚氰胺甲醛；聚烯烃；多糖，在一方面，所述多糖可以包含藻朊酸盐和/或壳聚糖；明胶；虫胶；环氧树脂；乙烯基聚合物水不溶性无机物；硅酮；及其混合物。

在所述胶囊化物的一方面，所述核心可以包含香料。

在所述胶囊化物的一方面，所述包壳可以包含三聚氰胺甲醛和/或交联的三聚氰胺甲醛。

在一方面，披露了适合的胶囊化物可以包含核心材料和包壳，所述包壳至少部分地包围所述核心材料。所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从0.2MPa至10MPa、从0.4MPa至5MPa、从0.6MPa至3.5MPa或从0.7MPa至3MPa的抗断强度；并且具有从0％至30％、从0％至20％或从0％至5％的有益试剂泄露。

在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从1微米至80微米、从5微米至60微米、从10微米至50微米或从15微米至40微米的粒度。

在一方面，所述胶囊化物的至少75％、85％或90％可以具有从30至250nm、从80至180nm、或从100至160nm的颗粒壁厚。

在一方面，所述胶囊化物的核心材料可以包括一种选自由香料原材料组成的组的材料，和/或任选地包括一种选自由以下组成的组的材料：植物油，包括纯净植物油和/或共混植物油，包括蓖麻油、椰子油、棉籽油、葡萄籽油、油菜籽、大豆油、玉米油、棕榈油、亚麻籽油、红花油、橄榄油、花生油、椰子油、棕榈仁油、蓖麻油、柠檬油及其混合物；植物油的酯，酯，包括己二酸二丁酯、酞酸二丁酯、己二酸丁基苄酯、己二酸辛基苄酯、磷酸三甲苯酯、磷酸三辛酯及其混合物；直链或支链烃，包括具有高于约80℃的沸点的那些直链或支链烃；部分氢化的三联苯、二烷基邻苯二甲酸酯、烷基联苯(包括单异丙基联苯)、烷基化的萘(包括二丙基萘)、石油精(包括煤油)、矿物油及其混合物；芳香族溶剂，包括苯、甲苯及其混合物；硅酮油；及其混合物。

在一方面，所述胶囊化物的壁材料可以包括适合的树脂，所述树脂包括醛和胺的反应产物，适合的醛包括甲醛。适合的胺包括三聚氰胺、脲、苯并胍胺、甘脲及其混合物。适合的三聚氰胺包括羟甲基三聚氰胺、甲基化的羟甲基三聚氰胺、亚氨基三聚氰胺及其混合物。适合的脲包括二羟甲基脲、甲基化的二羟甲基脲、脲-间苯二酚及其混合物。

在一方面，在将胶囊化物添加至组合物之前、期间或之后，适合的甲醛清除剂可以与例如处于胶囊浆料中的胶囊化物一起使用和/或添加至这种组合物中。适合的胶囊可以通过US 2008/0305982、和/或US 2009/0247449的以下教导来制成。

在优选的方面，所述组合物还可以包含沉积助剂，优选由下组组成，所述组包含阳离子或非离子聚合物。适合的聚合物包括阳离子淀粉、阳离子羟基乙基纤维素、聚乙烯甲醛、槐树豆胶、甘露聚糖、木葡聚糖、罗望子胶、聚乙二醇对苯二甲酸酯，以及含有甲基丙烯酸二甲胺乙酯的聚合物，任选地具有一种或多种选自包含丙烯酸和丙烯酰胺的组的单体。

香料-在一方面，所述组合物包括含有选自下组的一种或多种香料原材料的香料，所述组由以下各项组成：1,1'-氧基双-2-丙醇；1,4-环己烷二羧酸，二乙基酯；(乙氧基甲氧基)环十二烷；1,3-壬二醇，单乙酸酯；(3-甲基丁氧基)乙酸，2-丙烯基酯；β-甲基环十二烷乙醇；2-甲基-3-[(1,7,7-三甲基二环[2.2.1]庚-2-基)氧基]-1-丙醇；氧杂环十六-2-酮；α-甲基-苯甲醇乙酸盐；反式-3-乙氧基-1,1,5-三甲基环己烷；4-(1,1-二甲基乙基)环己醇乙酸酯；十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；β-甲基苯丙醛；β-甲基-3-(1-甲基乙基)苯丙醛；4-苯基-2-丁酮；2-甲基丁酸，乙基酯；苯甲醛；2-甲基丁酸，1-甲基乙基酯；二氢-5-戊基-2(3H)呋喃酮；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；十二醛；十一醛；2-乙基-α,α-二甲基苯丙醛；癸醛；α,α-二甲基苯乙醇乙酸酯；2-(苯基亚甲基)辛醛；2-[[3-[4-(1,1-二甲基乙基)苯基]-2-甲基亚丙基]氨基]苯甲酸，甲基酯；1-(2,6,6-三甲基-3-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；2-戊基环戊酮；3-氧代-2-戊基环戊烷乙酸，甲基酯；4-羟基-3-甲氧基苯甲醛；3-乙氧基-4-羟基苯甲醛；2-庚基环戊酮；1-(4-甲基苯基)乙酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；(3E)-4-(2,6,6-三甲基-2-环己烯-1-基)-3-丁烯-2-酮；苯乙醇；2H-1-苯并吡喃-2-酮；4-甲氧基苯甲醛；10-十一烯醛；丙酸，苯基甲基酯；β-甲基苯戊醇；1,1-二乙氧基-3,7-二甲基-2,6-辛二烯；α,α-二甲基苯乙醇；(2E)-1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；乙酸，苯基甲基酯；环己烷丙酸，2-丙烯基酯；己酸，2-丙烯基酯；1,2-二甲氧基-4-(2-丙烯基)苯；1,5-二甲基-二环[3.2.1]辛-8-酮肟；4-(4-羟基-4-甲基戊烷基)-3-环己烯-1-甲醛；3-丁烯-2-醇；2-[[[2,4(或3,5)-二甲基-3-环己烯基-1-基]亚甲基]氨基]苯甲酸，甲基酯；8-环十六-1-酮；甲基紫罗酮；2,6-二甲基-7-辛烯-2-醇；2-甲氧基-4-(2-丙烯基)苯酚；(2E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯-1-醇；2-羟基-苯甲酸，(3Z)-3-己烯基酯；2-十三烯腈；4-(2,2-二甲基-6-亚甲基环己基)-3-甲基-3-丁烯-2-酮；四氢-4-甲基-2-(2-甲基-1-丙烯基)-2H-吡喃；乙酸，(2-甲基丁氧基)-，2-丙烯基酯；苯甲酸，2-羟基-，3-甲基丁基酯；2-丁烯-1-酮，1-(2,6,6-三甲基-1-环己烯-1-基)-，(Z)-；环戊烷羧酸，2-己基-3-氧代-，甲基酯；苯丙醛，4-乙基-α，α-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，3-(4-羟基-4-甲基戊基)-；乙酮，1-(2,3,4,7,8,8a-六氢-3,6,8,8-四甲基-1H-3a,7-甲醇甘菊蓝-5-基-，[3R-(3.α.,3a.β.,7.β.,8a.α.)]-；十一醛，2-甲基-2H-吡喃-2-酮，6-丁基四氢-；苯丙醛、4-(1,1-二甲基乙基)-.α.-甲基-；2(3H)-呋喃酮、5-庚基二氢-；苯甲酸，2-[(7-羟基-3，7-二甲基亚辛基)氨基]-、甲基；苯甲酸，2-羟基-，苯基甲基酯；萘，2-甲氧基-；2-环戊烯-1-酮，2-己基-；2(3H)-呋喃酮、5-己基二氢-；氧杂环丙烷羧酸，3-甲基-3-苯基-，乙基酯；2-氧杂二环[2.2.2]辛烷，1,3,3-三甲基-；苯戊醇，.γ.-甲基-；3-辛醇，3,7-二甲基-；3,7-二甲基-2,6-辛二烯腈；3,7-二甲基-6-辛烯-1-醇；萜品醇乙酸酯；2-甲基-6-亚甲基-7-辛烯-2-醇，二氢衍生物；3a,4,5,6,7,7a-六氢-4,7-甲醇-1H-茚-6-酚丙酸酯；3-甲基-2-丁烯-1-醇乙酸酯；(Z)-3-己烯-1-醇乙酸酯；2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇；4-(八氢-4,7-甲醇-5H-亚茚-5-基)-丁醛；3-2,4-二甲基-环己烯-1-甲醛；1-(1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘基)-乙酮；2-羟基-苯甲酸，甲基酯；2-羟基-苯甲酸，己基酯；2-苯氧基-乙醇；2-羟基-苯甲酸，戊基酯；2,3-庚烷二酮；2-己烯-1-醇；6-辛烯-2-醇、2,6-二甲基-；突厥酮(α、β、γ或δ或其混合物)，4,7-甲醇-1H-茚-6-酚，3a,4,5,6,7,7a-六氢-，乙酸酯；9-十一烯醛；8-十一烯醛；异环柠檬醛；乙酮，1-(1,2,3,5,6,7,8,8a-八氢-2,3,8,8-四甲基-2-萘基)-；3-环己烯-1-甲醛，3,5-二甲基-；3-环己烯-1-甲醛，2,4-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-；1,6-辛二烯-3-醇，3,7-二甲基-，乙酸酯；铃兰醛(p-t-Bucinal)，以及环戊酮、2-[2-(4-甲基-3-环己烯-1-基)丙基]-以及1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯及其混合物。

在一方面，所述组合物可以包含胶囊化的香料颗粒，所述颗粒包含水溶性羟基化合物或三聚氰胺-甲醛或改性的聚乙烯醇。在一方面，胶囊化物包含(a)至少部分水溶的固体基质，所述基质包含一种或多种水溶性羟基化合物，优选淀粉；以及(b)由所述固体基质包封的香料油。

在另一方面，所述香料可以是与多胺(优选聚乙烯亚胺)预复合的，以形成席夫碱(Schiff base)。

聚合物-组合物可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯(例如聚丙烯酸酯)、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。

组合物可以包含一种或多种两亲清洁聚合物，例如具有以下一般结构的化合物：双((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)(CH₃)-N⁺-C_xH_2x-N⁺-(CH₃)-bis((C₂H₅O)(C₂H₄O)n)，其中n＝从20至30，并且x＝从3至8，或其硫酸化的或磺化的变体。

组合物可以包含两亲烷氧基化油脂清洁聚合物，所述聚合物具有平衡的亲水和疏水特性，这样使得它们从织物和表面去除油脂颗粒。本发明的两亲烷氧基化油脂清洁聚合物的具体实施例包含一个核心结构和与那个核心结构连接的多个烷氧基化基团。这些可以包含烷氧基化的聚烯属烃亚胺(polyalkylenimine)，优选具有内聚环氧乙烷嵌段和外聚环氧丙烷嵌段。

烷氧基化的聚羧酸酯(例如从聚丙烯酸酯制备的那些)可在本文用于提供另外的油脂去除性能。此类材料描述于WO 91/08281和PCT 90/01815中。在化学上，这些材料包括每7-8个丙烯酸酯单元具有一条乙氧基侧链的聚丙烯酸酯。侧链具有式-(CH₂CH₂O)_m(CH₂)_nCH₃，其中m是2-3并且n是6-12。侧链是酯连接至聚丙烯酸酯“主链”，以提供“梳子状”聚合物类型结构。分子量可以不同，但典型地处于2000至50,000的范围内。此类烷氧基化的聚羧酸酯可以包含本文的组合物的从0.05wt％至10wt％。

本发明的类异戊二烯衍生的表面活性剂，以及与其他辅助表面活性剂和其他佐剂成分一起形成的混合物特别适合与两亲接枝共聚物使用，优选地所述两亲接枝共聚物包含(i)聚乙二醇主链；以及(ii)和至少一个侧基部分，所述侧基部分选自聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇及其混合物。优选的两亲接枝共聚物是由巴斯夫公司(BASF)供应的Sokalan HP22。适合的聚合物包括随机接枝共聚物，优选聚乙酸乙烯酯接枝的聚环氧乙烷共聚物，具有聚环氧乙烷主链和多重聚乙酸乙烯酯侧链。聚环氧乙烷主链的分子量优选是6000，并且聚环氧乙烷与聚乙酸乙烯酯的重量比是40比60，并且每50个环氧乙烷单位有不多于1个接枝点。

羧酸酯聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种羧酸酯聚合物，例如马来酸酯/丙烯酸酯随机共聚物或聚丙烯酸酯均聚物。在一方面，羧酸酯聚合物是具有从4,000Da至9,000Da或从6,000Da至9,000Da的分子量的聚丙烯酸酯均聚物。

去污聚合物-本发明的组合物还可以包括一种或多种去污聚合物，所述聚合物具有如由以下结构(I)、(II)或(III)之一所定义的结构：

(I)-[(OCHR¹-CHR²)_a-O-OC-Ar-CO-]_d

(II)-[(OCHR³-CHR⁴)_b-O-OC-sAr-CO-]_e

(III)-[(OCHR⁵-CHR⁶)_c-OR⁷]_f

其中：

a、b和c是从1至200；

d、e和f是从1至50；

Ar是1,4-取代的亚苯基；

sAr是1,3-取代的亚苯基，所述亚苯基在5位上被SO₃Me取代；

Me是Li、K、Mg/2、Ca/2、Al/3、铵、单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵或四烷基铵，其中烷基基团是C₁-C₁₈烷基或C₂-C₁₀羟基烷基，或其混合物；

R¹、R²、R³、R⁴、R⁵和R⁶独立地选自H或C₁-C₁₈正烷基或异烷基；并且

R⁷是直链或支链的C₁-C₁₈烷基，或直链或支链的C₂-C₃₀烯基，或具有5至9个碳原子的环烷基，或C₈-C₃₀芳基，或C₆-C₃₀芳基烷基。

适合的去污聚合物是聚酯去污聚合物，例如Repel-o-tex聚合物，包括Repel-o-tex、SF-2和SRP6，由罗地亚(Rhodia)供应。其他适合的去污聚合物包括Texcare聚合物，包括Texcare SRA100、SRA300、SRN100、SRN170、SRN240、SRN300和SRN325，由科莱恩(Clariant)供应。其他适合的去污聚合物是Marloquest聚合物，例如Marloquest SL，由萨索尔公司(Sasol)供应。

纤维素聚合物-本发明的组合物还可以包含一种或多种纤维素聚合物，包括选自烷基纤维素、烷基烷氧基烷基纤维素、羧基烷基纤维素、烷基羧基烷基纤维素的那些。在一方面，纤维素聚合物选自包含以下的组：羧甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟基乙基纤维素、甲基羧甲基纤维素及其混合物。在一方面，羧甲基纤维素具有从0.5至0.9的羧甲基取代度以及从100,000Da至300,000Da的分子量。

可以根据本领域中已知的方法来制备组合物，并且所述组合物可以处于液体或干组合物的形式。可以根据本领域中已知的方法将组合物稳定化。

使用本发明所述的变体α-淀粉酶的方法-工业应用

本发明所述的变体α-淀粉酶具有允许各种工业应用的有价值特性。特别地，所述α-淀粉酶可以用于乙醇生产以及淀粉转化过程中。

此外，本发明的α-淀粉酶特别适用于从淀粉或全谷粒中生产甜味剂/糖浆以及乙醇(参见，例如，美国专利号5,231,017，所述专利通过引用结合在此)，例如燃料乙醇、饮用乙醇以及工业乙醇。

在一个实施例中，本发明涉及根据本发明所述的α-淀粉酶在液化过程中的用途。产生的液化物可以进一步加工成糖浆和/或发酵产物。

淀粉加工

天然淀粉由室温下不溶于水的微观颗粒组成。当加热水性淀粉浆料时，颗粒膨胀并且最后破裂，将淀粉分子分散至溶液中。在高达约50℃至75℃的温度下，膨胀可以是可逆的。然而，在更高温度，开始不可逆膨胀，称为“糊化”。在此“糊化”方法中，粘度有显著地增加。有待加工的颗粒状淀粉可以具有高度精制的淀粉质量，优选地至少90％、至少95％、至少97％或至少99.5％纯，或它可以为更粗糙的含淀粉材料，这些材料包含(例如，经碾磨的)全谷物，全谷物包括非淀粉部分，例如胚芽残留物和纤维。所述原材料(例如全谷物)可以例如经过碾磨减少粒度，以便展开结构并且允许进一步加工。在干式碾磨中，整个谷粒被碾磨并且使用。湿磨使胚芽与粗粉(淀粉颗粒和蛋白质)很好分离并且时常应用于在例如糖浆的生产中使用淀粉水解物的场所。干式和湿式碾磨两者是本领域中熟知的淀粉加工法并且可以用于本发明的方法中。用于减少所述含淀粉材料的粒度的方法为本领域技术人员所熟知的。

由于典型工业方法中的固体水平为30％-40％，因此不得不稀释或“液化”淀粉以使其能够被适当加工。在当前商业实践中，这种粘度的降低主要通过酶促降解来实现。

在α-淀粉酶，优选细菌α-淀粉酶和/或酸性真菌α-淀粉酶的存在下进行液化。在一个实施例中，在液化期间还存在蛋白酶。在一个实施例中，在液化期间还存在植酸酶。在一个实施例中，在液化期间还存在降低粘度的酶例如木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶。

在液化过程中，通过α-淀粉酶将长链淀粉降解为支链以及直链的较短单元(麦芽糊精)。液化可以作为一个三步热浆料方法进行。将浆料加热至60℃-95℃之间(例如70℃-90℃，例如77℃-86℃、80℃-85℃、83℃-85℃)并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。

在一个实施例中，可以将浆料在95℃-140℃(例如，105℃-125℃)之间喷射蒸煮持续约1-15分钟，例如约3-10分钟，尤其是约5分钟。然后，将浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多的α-淀粉酶，以获得最终水解(二次液化)。在pH 4.5-6.5下，典型地在5与6之间的pH下进行喷射蒸煮方法。可以例如在喷射蒸煮之前，将α-淀粉酶以单一剂量添加。

在70℃-95℃之间，例如80℃-90℃，例如约85℃，进行液化过程持续约10分钟至5小时，典型地是1-2小时。pH在4与7之间，例如在5.5与6.2之间。为了确保在这些条件下最佳的酶稳定性，可以任选地添加钙(以提供1-60ppm游离钙离子，例如约40ppm游离钙离子)。如此处理之后，液化淀粉将典型地具有10-16的“右旋糖当量”(DE)。

通常，液化和液化条件是本领域中熟知的。

可以使用本领域中熟知的条件，用糖源生成酶，特别是葡糖淀粉酶或β-淀粉酶以及任选地去分支酶(例如异淀粉酶或支链淀粉酶)进行糖化。例如，全部糖化步骤可以持续从约24至约72小时。然而，常见地在30℃-65℃之间的温度(典型地约60℃)进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵(SSF)方法中，在发酵期间进行完全糖化。典型地在20℃-75℃的范围内的温度(例如，25℃-65℃和40℃-70℃，典型地约60℃)，并且在约4与5之间的pH，一般在约pH 4.5下进行糖化。

糖化步骤和发酵步骤可以依次或同时进行。在一个实施例中，糖化和发酵是同时进行的(称为“SSF”)。然而，通常，在30℃至65℃、典型地约60℃的温度处执行一个预糖化步骤持续约30分钟至2小时(例如，30至90分钟)，随后在被称为同时糖化和发酵(SSF)的发酵期间进行完全糖化。pH通常在4.2-4.8之间，例如，pH 4.5。在同时糖化和发酵(SSF)过程中，没有糖化的保持阶段，而实际上是，酵母和酶是一起添加的。

在典型糖化过程中，通过添加葡糖淀粉酶以及任选地去分支酶，例如异淀粉酶(美国专利号4,335,208)或支链淀粉酶，来将液化期间产生的麦芽糊精转化成右旋糖。添加葡糖淀粉酶以及去分支酶之前使温度降低至60℃。糖化过程进行24-72小时。在添加糖化酶之前，使pH降低至低于4.5，同时维持高温(高于95℃)，以便使液化α-淀粉酶失活。此过程减少了称为“潘糖前体”的短低聚糖的形成，这种短低聚糖不能通过去分支酶来适当水解。正常地，约0.2％-0.5％的糖化产物是分支三糖潘糖(Glc pα1-6Glc pα1-4Glc)，它不能由支链淀粉酶降解。如果糖化过程中仍然存在来自液化步骤的活性淀粉酶(即未变性)，潘糖的量可以高至1％-2％，这是高度不希望的，因为它显著降低了糖化产率。

其他发酵产物可以在本领域技术人员熟知的、适于所讨论的发酵生物的条件和温度下发酵。

可以通过本领域熟知的方法(例如，通过蒸馏)回收发酵产物。

在一个具体实施例中，本发明的方法在将含淀粉材料转化为糖/糊精之前进一步包括以下步骤：

(x)减少所述含淀粉材料的粒度；以及

(y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。

在一个实施例中，将所述含淀粉材料碾磨，以减少粒度。在一个实施例中，所述粒度被减少至0.05-3.0mm、优选0.1-0.5mm之间，或使得至少30％、优选至少50％、更优选至少70％、甚至更优选至少90％的含淀粉材料适合通过一个具有0.05-3.0mm筛网、优选0.1-0.5mm筛网的筛。

所述水性浆料可以含有含淀粉材料的10-55wt.％干固体(DS)，优选25-45wt.％干固体(DS)，更优选30-40wt.％干固体(DS)。

常规淀粉转化过程如液化以及糖化过程描述于例如美国专利号3,912,590、EP252730以及EP 063909中，这些专利通过引用结合在此。

在一个实施例中，转化方法将淀粉降解为较低分子量的碳水化合物成分，例如糖或脂肪替代物，所述方法包括一个脱支步骤。

当将淀粉转化为糖时，淀粉被解聚。这类解聚过程由例如预处理步骤以及两个或三个连续过程步骤组成，即，液化过程、糖化过程并且取决于所需最终产物，任选的异构化过程。

当所希望的最终糖产物是例如高果糖糖浆时，右旋糖糖浆可以被转化为果糖。糖化过程之后，将pH值增加至6-8范围内的值，例如pH 7.5，并且通过离子交换去除钙。然后，使用例如固定化葡萄糖异构酶将右旋糖糖浆转化成高果糖糖浆。

发酵产物的生产

可发酵的糖类(例如，糊精类、单糖类，特别是葡萄糖)由酶法糖化产生。这些可发酵的糖类可以进一步纯化和/或转化成有用的糖产物。另外，这些糖可以在微生物发酵过程中用作发酵进料来产生最终产物，例如醇(例如，乙醇以及丁醇)、有机酸(例如，丁二酸，3-HP以及乳酸)、糖醇(例如，甘油)、抗坏血酸中间物(例如，葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸)、氨基酸(例如，赖氨酸)、蛋白质(例如，抗体及其片段)。

在一个实施例中，将液化过程步骤期间获得的可发酵的糖用于产生醇，并且特别是乙醇。在乙醇生产中，通常使用SSF过程，其中糖化酶以及发酵生物(例如，酵母)一起添加，并且然后在30℃-40℃温度下执行。

发酵中所使用的生物取决于所需最终产物。典型地，如果乙醇是所需最终产物，则将酵母用作发酵生物。在一些优选实施例中，产乙醇微生物是酵母，并且尤其是酵母属例如酿酒酵母菌株(美国专利号4,316,956)。各种酿酒酵母是可商购的并且这些包括但不局限于FALI(弗莱希曼酵母公司(Fleischmann's Yeast))、SUPERSTART(奥泰公司(Alltech))、FERMIOL(帝斯曼公司食品配料部(DSM Specialties))、RED STAR(乐斯福公司(Lesaffre))以及Angel醇酵母(天使酵母公司(Angel Yeast Company)，中国)，Ethanol Red(乐斯福公司(Lesaffre))、Innova Drive(诺维信公司(Novozymes A/S))、Innova Lift(诺维信公司)。这些方法中所使用的起始酵母的量是在适合时间内有效产生商业上有效量乙醇的量(例如，在小于72小时内从具有25％-40％之间DS的底物产生至少10％乙醇)。酵母细胞通常以约10⁴至约10¹²、并且优选地从约10⁷至约10¹⁰活酵母计数/mL发酵液的量来供应。在将酵母添加至醪液之后，使它典型地经受发酵约24-96小时，例如，35-60小时。温度在约26℃-34℃之间，典型地约32℃，并且pH是从pH 3-6，例如，pH 4-5左右。

除了发酵微生物(例如，酵母)以外，发酵还可以包括营养物以及额外酶，这些另外的酶包括植酸酶。酵母在发酵中的使用在本领域中是熟知的。

在另外的实施例中，如本领域中已知的，适当发酵微生物的使用可产生发酵最终产物，包括例如甘油、1,3-丙二醇、葡萄糖酸盐、2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐、2-酮基-L-古洛糖酸、丁二酸、乳酸、氨基酸及其衍生物。更具体地说，当乳酸是所需最终产物时，可以使用乳酸杆菌物种(干酪乳杆菌(L.casei))；当甘油或1,3-丙二醇是所需最终产物时，可以使用大肠杆菌；并且当2-酮基-D-葡萄糖酸盐、2,5-二酮基-D-葡萄糖酸盐以及2-酮基-L-古洛糖酸是所需最终产物时，柠檬泛菌可以用作发酵微生物。以上列举的列表只是实例并且本领域技术人员知道可以用于获得所需最终产物的许多发酵微生物。

由含经糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法

在这一方面，本发明涉及由含淀粉材料生产发酵产物、尤其是乙醇的方法，这些方法包括：液化步骤，以及依次或同时进行的糖化和发酵步骤。因此，本发明涉及从含淀粉材料生产发酵产物的方法，这些方法包括以下步骤：

(a)在本发明的变体α-淀粉酶存在下使含淀粉材料液化；

(b)使用葡糖淀粉酶使在步骤(a)中获得的液化材料糖化；

(c)使用发酵生物发酵步骤b)的产物。

在一个实施例中，在液化之前、期间和/或之后，添加蛋白酶，例如酸性真菌蛋白酶或金属蛋白酶。在一个实施例中，金属蛋白酶源自嗜热子囊菌属(Thermoascus)菌株，例如，橙色嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670。在另一个实施例中，蛋白酶是细菌蛋白酶，特别是丝氨酸蛋白酶，更特别是S8蛋白酶，特别是源自火球菌属的菌株的蛋白酶，更特别是来自披露于US 6,358,726中的强烈火球菌。

在糖化步骤中添加/存在葡糖淀粉酶。葡糖淀粉酶可以源自曲霉属的菌株，例如，黑曲霉或泡盛曲霉；踝节菌属的菌株，尤其是埃默森踝节菌；或阿太菌属的菌株，尤其是罗氏阿太菌；栓菌属的菌株，例如，瓣环栓菌；粘褶菌属的菌株，尤其是密粘褶菌或篱边黏褶菌；或其混合物。还可以使用其他适合的葡糖淀粉酶，参见部分“在糖化和/或发酵中存在的 和/或添加的葡糖淀粉酶”。

糖化步骤(b)和发酵步骤(c)可以依次或同时进行。当所述方法作为依次糖化和发酵过程来进行时，支链淀粉酶和/或蛋白酶可以在糖化和/或发酵期间添加，并且当步骤(b)与(c)同时进行时(SSF过程)，在发酵之前或期间添加。支链淀粉酶和/或蛋白酶还可以有利地在液化之前(预液化处理)(即在步骤(a)之前或期间)和/或在液化之后(液化后处理)(即在步骤(a)之后添加)。支链淀粉酶最有利地是在液化之前或期间(即在步骤(a)之前或期间)添加。发酵产物，例如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。发酵生物优选地是酵母，优选地是酿酒酵母菌株。在一个优选实施例中，酵母表达本发明的变体葡糖淀粉酶。在一个具体实施例中，本发明的方法在步骤(a)之前进一步包括以下步骤：

x)优选地通过碾磨(例如，使用锤磨机)来减小含淀粉材料的粒度；

y)形成包含所述含淀粉材料和水的浆料。

在一个实施例中，粒度是小于7号筛网，例如6号筛网。7号筛网通常用于传统现有技术方法中。水性浆料可以含有从10-55，例如25-45以及30-40w/w％干固体(DS)的含淀粉材料。将浆料加热至高于糊化温度并且可以添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀化)。在一个实施例中，所述浆料在步骤(a)中经受α-淀粉酶之前可以进行喷射蒸煮以进一步使所述浆料糊化。在一个实施例中，液化可以作为三步骤热浆料方法来执行。在pH 4-6、优选地4.5-5.5下，将浆料加热至60℃-95℃之间、优选地70℃-90℃之间、例如优选地80℃-85℃之间，并且任选地连同支链淀粉酶和/或蛋白酶、优选地金属蛋白酶一起添加α-淀粉酶变体以开始液化(稀释)。在一个实施例中，然后，可以将浆料在95℃-140℃、优选地100℃-135℃、例如105℃-125℃之间的温度处喷射蒸煮约1-15分钟、优选地约3-10分钟、尤其是约5分钟。浆料冷却至60℃-95℃并且添加更多α-淀粉酶以及任选地支链淀粉酶和/或蛋白酶，以完成水解(二次液化)。通常在pH 4.0-6、特别是在从4.5至5.5之间的pH下进行液化过程。可以使用本领域熟知的条件来进行糖化步骤(b)。例如，完全糖化过程可以持续从约24到约72小时，然而，通常仅在30℃到65℃之间的温度处，典型地约60℃处进行典型地40-90分钟的预糖化，随后在同时糖化和发酵过程(SSF过程)中，在发酵期间进行完全糖化。糖化典型地在从20℃-75℃、优选地从40℃-70℃，典型地约60℃的温度处并且在4与5之间的pH下、一般在约pH 4.5下进行。在发酵产物，尤其是乙醇的生产中最广泛使用的方法是同时糖化和发酵(SSF)方法，在所述方法中，所述糖化不存在保持阶段，意味着发酵生物(例如酵母)和酶可以一起添加。SSF可以典型地在从25℃至40℃、例如从28℃至35℃、例如从30℃至34℃、优选地约32℃的温度处执行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。

用于由含糊化淀粉的材料生产糖浆的方法

在这一方面，发酵步骤被省略，条件通常如以上对“用于由含糊化淀粉的材料生产发酵产物的方法”的描述。因此，在这一方面，本发明涉及用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：

a)本发明的变体α-淀粉酶或本发明的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及

b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。

在一个实施例中，步骤b)在葡糖淀粉酶以及：

i)真菌α-淀粉酶；

ii)异淀粉酶；

iii)真菌α-淀粉酶和异淀粉酶的存在下进行。

在一个具体实施例中，支链淀粉酶存在于步骤a)和/或b)中。

液化过程中存在的和/或添加的蛋白酶

根据本发明，在一个实施例中，热稳定的蛋白酶，连同α-淀粉酶，例如热稳定的α-淀粉酶，以及任选的产碳水化合物源的酶，特别是一种热稳定的葡糖淀粉酶，或热稳定的支链淀粉酶可以是在液化过程中存在的和/或添加的。

蛋白酶根据其催化机制分为以下几组：丝氨酸蛋白酶(S)、半胱氨酸蛋白酶(C)、天冬氨酸蛋白酶(A)、金属蛋白酶(M)以及未知或还未分类的蛋白酶(U)，参见Handbook ofProteolytic Enzymes[蛋白水解酶手册],A.J.Barrett,N.D.Rawlings,J.F.Woessner(编辑),Academic Press[学术出版社](1998)，特别是概述部分。

在一个优选的实施例中，根据本发明使用的热稳定的蛋白酶是“金属蛋白酶”，其定义为属于EC 3.4.24(金属内肽酶)；优选EC 3.4.24.39(酸性金属蛋白酶)。

为了确定给定的蛋白酶是否是金属蛋白酶，参照上述“Handbook of ProteolyticEnzymes[蛋白水解酶手册]”以及其中指示的原则。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的确定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。

可以使用任何适合的测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，所述底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。测定pH值和测定温度同样适用于所讨论的蛋白酶。测定pH值的实例是pH 6、7、8、9、10或11。测定温度的实例是30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃或80℃。

蛋白酶底物的实例为酪蛋白，例如Azurine-Crosslinked Casein(天青精-交联的酪蛋白，AZCL-酪蛋白)。在下文“材料与方法”部分中描述了两种蛋白酶测定，其中所谓的“AZCL-酪蛋白测定”是优选的测定。

对于在本发明的方法中使用的蛋白酶的来源没有限制，只要其满足下文定义的热稳定性特性。

蛋白酶可以是例如野生型蛋白酶的变体，只要所述蛋白酶具有本文定义的热稳定性特性。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有高于60％，例如高于90％，例如高于100％，例如高于110％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，蛋白酶在85℃具有在60％-120％之间，例如在70％-120％之间，例如在80％-120％之间，例如在90％-120％之间，例如在100％-120％之间，例如110％-120％的热稳定性，如使用Zein-BCA测定确定的。

在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶是如上定义的金属蛋白酶的变体。在一个实施例中，在本发明的方法中使用的热稳定的蛋白酶是真菌来源的，例如真菌金属蛋白酶，例如源自嗜热子囊菌属的菌株，优选橙色嗜热子囊菌的菌株，尤其是橙色嗜热子囊菌CGMCCNo.0670(分类为EC 3.4.24.39)。

在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO 2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或W2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文作为SEQ ID NO:20所示的，进一步具有选自以下列表的突变：

-S5*+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-S5*+N26R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-N26R+T46R+D79L+S87P+A112P+D142L；

-T46R+D79L+S87P+T116V+D142L；

-D79L+P81R+S87P+A112P+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+T124V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+T124V+A126V+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+D142L；

-S38T+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+Y82F+S87P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+A126V+D142L；

-D79L+S87P+N98C+A112P+G135C+D142L；

-D79L+S87P+A112P+D142L+T141C+M161C；

-S36P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-A37P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S49P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-S50P+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+Y97W+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+Y97W+D104P+A112P+D142L；

-S70V+D79L+Y82F+S87G+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+D142L；

-D79L+Y82F+S87G+A112P+A126V+D142L；

-Y82F+S87G+S70V+D79L+D104P+A112P+D142L；

-Y82F+S87G+D79L+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+Y82F+D104P+A112P+A126V+D142L；

-A27K+D79L+S87P+A112P+D142L；

-D79L+S87P+D142L。

在一个优选实施例中，所述热稳定的蛋白酶是披露于以下的变体：WO2003/048353中披露的SEQ ID NO:2中所示的金属蛋白酶的成熟部分或WO2010/008841中的SEQ ID NO:1的成熟部分以及本文的SEQ ID NO:20中所示的，进一步具有选自以下列表的突变：

D79L+S87P+A112P+D142L；

D79L+S87P+D142L；或

A27K+D79L+Y82F+S87G+D104P+A112P+A126V+D142L。

在一个实施例中，蛋白酶变体与披露于WO 2003/048353中的SEQ ID NO:2的多肽的成熟部分或披露于WO 2010/008841中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:20的成熟部分具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％但小于100％的同一性。

热稳定的蛋白酶还可以源自细菌，特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属物种或嗜热球菌属物种的S8蛋白酶。

在一个实施例中，所述热稳定的蛋白酶源自细菌火球菌属的菌株，例如强烈火球菌的菌株(pfu蛋白酶)。

在一个实施例中，所述蛋白酶是如美国专利号6,358,726-B1(宝酒造公司(TakaraShuzo Company))的SEQ ID NO:1、和本文的SEQ ID NO:19所示的一种。

在另一个实施例中，热稳定的蛋白酶是披露于本文的SEQ ID NO:19中的蛋白酶或是与美国专利号6,358,726-B1中的SEQ ID NO:1或本文的SEQ ID NO:19具有至少80％同一性，例如至少85％、如至少90％、如至少95％、如至少96％、如至少97％、如至少98％、如至少99％同一性的蛋白酶。

在液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶

在一个实施例中，在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中的液化步骤a)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。

在一个优选的实施例中，在液化步骤a)中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶源自青霉属菌株，尤其是如WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2或本文的SEQ ID NO:21披露的草酸青霉菌菌株。

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶与WO 2011/127802中的SEQ ID NO:2中所示的成熟多肽或本文的SEQ ID NO:21具有至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。

在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶是示出在WO 2011/127802中的SEQ IDNO:2的或本文的SEQ ID NO:21中的草酸青霉菌葡糖淀粉酶的、具有K79V取代(使用SEQ IDNO:21中所示的成熟序列进行编号)的一种变体，例如WO 2013/053801中披露的变体。

在一个实施例中，所述草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代(使用SEQ ID NO:21进行编号)，并且优选进一步具有以下取代之一：

T65A；或

Q327F；或

E501V；或

Y504T；或

Y504*；或

T65A+Q327F；或

T65A+E501V；或

T65A+Y504T；或

T65A+Y504*；或

Q327F+E501V；或

Q327F+Y504T；或

Q327F+Y504*；或

E501V+Y504T；或

E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V；或

T65A+Q327F+Y504T；或

T65A+E501V+Y504T；或

Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+Y504*；或

T65A+E501V+Y504*；或

Q327F+E501V+Y504*；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504*；

E501V+Y504T；或

T65A+K161S；或

T65A+Q405T；或

T65A+Q327W；或

T65A+Q327F；或

T65A+Q327Y；或

P11F+T65A+Q327F；或

R1K+D3W+K5Q+G7V+N8S+T10K+P11S+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F；或

P11F+D26C+K33C+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

R1E+D3N+P4G+G6R+G7A+N8A+T10D+P11D+T65A+Q327F；或

P11F+T65A+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P11F+T65A+Q327W+E501V+Y504T；或

T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

T65A+S105P+Q327W；或

T65A+S105P+Q327F；或

T65A+Q327W+S364P；或

T65A+Q327F+S364P；或

T65A+S103N+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+N502T+P563S+K571E；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+N564D+K571S；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+V325T+Q327W；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+I172V+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S377T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+I375A+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K218A+K221D+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10D+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+F12Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+T10E+E18N+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T568N；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+K34Y+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+R31S+K33V+T65A+Q327F+D445N+V447S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+D26N+K34Y+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+F80*+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K112S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+N502T+Y504*；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+S103N+Q327F+E501V+Y504T；或

K5A+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+E501V+Y504T+T516P+K524T+G526A；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79A+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79G+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79I+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79L+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+K79S+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+L72V+Q327F+E501V+Y504T；或

S255N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+E74N+V79K+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+G220N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Y245N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q253N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+D279N+Q327F+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S359N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+D370N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460S+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+V460T+P468T+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T463N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+S465N+E501V+Y504T；或

P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F+T477N+E501V+Y504T。

在一个优选的实施例中，在液化中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是草酸青霉菌葡糖淀粉酶，所述草酸青霉菌葡糖淀粉酶具有K79V取代并且优选进一步具有以下取代中的一个：

-P11F+T65A+Q327F；

-P2N+P4S+P11F+T65A+Q327F(使用SEQ ID NO:21进行编号)。

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:21的多肽具有至少75％同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％同一性。

所述葡糖淀粉酶可以从0.1至100微克EP/g，例如0.5至50微克EP/g，例如1至25微克EP/g，例如2至12微克EP/g DS的量添加。

在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶

在本发明的方法(即，油回收方法和发酵产物生产过程)中，在糖化和/或发酵，优选同时糖化和发酵(SSF)中，存在和/或添加葡糖淀粉酶。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的葡糖淀粉酶是真菌来源的，优选地来自曲霉属的菌株，优选黑曲霉、泡盛曲霉(A.awamori)或米曲霉；或木霉属的菌株，优选里氏木霉；或篮状菌属的菌株，优选埃默森篮状菌；或栓菌属的菌株，优选瓣环栓菌(T.cingulata)；或密孔菌属的菌株；或粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌；或黑层孔属(Nigrofomes)的菌株。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶是源自篮状菌属，例如埃默森篮状菌的菌株，例如在本文的SEQ ID NO:22中所示的菌株，

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:22的多肽的葡糖淀粉酶；

(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:22的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶源自密孔菌属的菌株，特别是描述于WO2011/066576中的血红密孔菌的菌株(SEQ ID NO 2、4或6)，例如示为WO2011/066576中的SEQ ID NO:4或本文的SEQ ID NO:23的菌株。

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:23的多肽的葡糖淀粉酶；

(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:23的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自粘褶菌属的菌株，例如篱边粘褶菌或密粘褶菌的菌株，特别是如在WO 2011/068803中描述的粘褶菌属的菌株(SEQ ID NO:2、4、6、8、10、12、14或16)。在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶是在WO 2011/068803中的SEQ IDNO:2或本文的SEQ ID NO:24中所示的篱边粘褶菌。

在一个优选的实施例中，所述葡糖淀粉酶源自篱边粘褶菌，例如在本文的SEQ IDNO:24中所示的篱边粘褶菌。在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:24的多肽的葡糖淀粉酶；

(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:24的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在另一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自密粘褶菌，例如在本文的SEQ ID NO:25中所示的密粘褶菌。在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:25的多肽的葡糖淀粉酶；

(ii)包含以下氨基酸序列的葡糖淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:25的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在一个实施例中，所述葡糖淀粉酶源自黑层孔属的菌株，特别是披露于WO 2012/064351中的黑层孔属物种的菌株。

在一个实施例中，葡糖淀粉酶可以如下量添加到糖化和/或发酵中：0.0001-20AGU/g DS，优选0.001-10AGU/g DS，尤其是在0.01-5AGU/g DS之间，例如0.1-2AGU/g DS。

包含葡糖淀粉酶的可商购组合物包括AMG 200L；AMG 300L；SAN^TM SUPER，SAN^TMEXTRA L，SPIRIZYME^TM PLUS，SPIRIZYME^TM FUEL，SPIRIZYME^TM B4U，SPIRIZYME^TM ULTRA，SPIRIZYME^TM EXCEL和AMG^TM E(来自诺维信公司)；OPTIDEX^TM 300，GC480，GC417(来自杜邦公司(DuPont))；AMIGASE^TM和AMIGASE^TM PLUS(来自DSM)；G-ZYME^TM G900，G-ZYME^TM和G990 ZR(来自杜邦公司)。

根据本发明的一个优选的实施例，在糖化和/或发酵中，葡糖淀粉酶是与α-淀粉酶相结合存在的和/或添加的。下面描述了适合的α-淀粉酶的实例。

在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶

在一个实施例中，在本发明的方法中，在糖化和/或发酵中存在和/或添加α-淀粉酶。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌或细菌来源的。在一个优选的实施例中，α-淀粉酶是真菌酸性稳定的α-淀粉酶。真菌酸性稳定的α-淀粉酶是在3.0至7.0的pH范围内并且优选地在3.5至6.5的pH范围内具有活性，包括在约4.0、4.5、5.0、5.5、和6.0的pH下的活性的α-淀粉酶。

在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶源自根毛霉属的菌株，优选菌株微小根毛霉，例如示于WO 2013/006756中的SEQ ID NO:3中的菌株，例如具有黑曲霉接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶杂合体，例如示于本文的SEQ ID NO:26中的杂合体或其变体。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶选自由以下组成的组：

(i)包含本文的SEQ ID NO:26的多肽的α-淀粉酶；

(ii)包含以下氨基酸序列的α-淀粉酶，所述氨基酸序列与本文的SEQ ID NO:26的多肽具有至少60％、至少70％，例如至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。

在一个优选的实施例中，所述α-淀粉酶是示于SEQ ID NO:26中的具有以下取代或取代的组合中的至少一个的α-淀粉酶的变体：D165M；Y141W；Y141R；K136F；K192R；P224A；P224R；S123H+Y141W；G20S+Y141W；A76G+Y141W；G128D+Y141W；G128D+D143N；P219C+Y141W；N142D+D143N；Y141W+K192R；Y141W+D143N；Y141W+N383R；Y141W+P219C+A265C；Y141W+N142D+D143N；Y141W+K192RV410A；G128D+Y141W+D143N；Y141W+D143N+P219C；Y141W+D143N+K192R；G128D+D143N+K192R；Y141W+D143N+K192R+P219C；G128D+Y141W+D143N+K192R；或G128D+Y141W+D143N+K192R+P219C(使用SEQ ID NO:26进行编号)。

在一个实施例中，所述α-淀粉酶源自具有黑曲霉葡糖淀粉酶接头和淀粉结合域(SBD)的微小根毛霉，优选披露为本文的SEQ ID NO:26，优选具有以下取代中的一个或多个：G128D、D143N，优选G128D+D143N(使用SEQ ID NO:19进行编号)。

在一个实施例中，在糖化和/或发酵中存在的和/或添加的α-淀粉酶变体与本文的SEQ ID NO:26的多肽具有至少75％的同一性，优选至少80％，更优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少91％，更优选至少92％，甚至更优选至少93％，最优选至少94％，并且甚至最优选至少95％，例如甚至至少96％、至少97％、至少98％、至少99％，但小于100％的同一性。

在一个优选的实施例中，在糖化和/或发酵期间存在的和/或添加的葡糖淀粉酶与α-淀粉酶之间的比率优选地可以在500:1至1:1，例如从250:1至1:1、如从100:1至1:1、如从100:2至100:50、如从100:3至100:70的范围内。

在液化和/或糖化和/或发酵中存在的和/或添加的支链淀粉酶。

在液化步骤a)和/或糖化步骤b)或发酵步骤c)或同时糖化和发酵期间可以存在和/或添加支链淀粉酶。

支链淀粉酶(E.C3.2.1.41，支链淀粉6-葡聚糖水解酶)，是以其水解(例如)支链淀粉(amylopectin)和支链淀粉(pullulan)中的α-1,6-葡糖苷键的能力为特征的脱支酶(debranching enzyme)。

根据本发明考虑的支链淀粉酶包括来自美国专利号4,560,651(特此通过引用结合)中披露的淀粉脱支芽孢杆菌(Bacillus amyloderamificans)的支链淀粉酶、WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:2的支链淀粉酶、WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:4的脱支芽孢杆菌(Bacillus deramificans)的支链淀粉酶，以及来自WO 01/51620(特此通过引用结合)中披露为SEQ ID NO:6的嗜酸性普鲁兰芽孢杆菌的支链淀粉酶，以及还有描述于FEMS微生物学通讯(FEMS Mic.Let.)(1994)115,97-106中的支链淀粉酶。

根据本发明，所述支链淀粉酶可以有效量添加，包括约0.0001-10mg酶蛋白/克DS的优选量，优选0.0001-0.10mg酶蛋白/克DS，更优选0.0001-0.010mg酶蛋白/克DS。支链淀粉酶活性可以确定为NPUN。用于确定NPUN的测定描述于下文的“材料与方法”-部分中。

适合的可商购支链淀粉酶产品包括PROMOZYME D、PROMOZYME^TMD2(诺维信公司，丹麦)、OPTIMAX L-300(杰能科公司(Genencor Int.)，美国)、以及AMANO 8(安能满公司(Amano)，日本)。

发酵产物，例如尤其是乙醇，可以可任选地在发酵之后，例如通过蒸馏来回收。在以下“含淀粉材料”部分中列出了多种适合的含淀粉的起始材料。在一个实施例中，所述含淀粉材料是玉米或小麦。

所述发酵生物优选地是酵母，优选地是酵母属菌株，尤其是酿酒酵母菌株。在以上“发酵生物”部分中列出了多种适合的发酵生物。在一个优选的实施例中，依次或同时进行步骤ii)和iii)(即，作为SSF过程)。所述水性浆料可以含有含淀粉材料的从10-55wt.％干固体，优选25-45wt.％干固体，更优选30-40wt.％干固体。将所述浆料加热至高于初始糊化温度。可以将α-淀粉酶，优选地细菌性α-淀粉酶添加到所述浆料中。在一个实施例中，在液化步骤i)中经受α-淀粉酶之前，还将所述浆料喷射蒸煮以进一步使所述浆料糊化。

在步骤(i)期间的温度高于初始糊化温度，例如在80℃-90℃之间，例如85℃左右。

在一个实施例中，液化以三步热浆料工艺进行。所述浆料被加热到介于60℃到95℃，优选地80℃到90℃之间，并且添加α-淀粉酶以开始液化(稀释)。然后，所述浆料在介于95℃到140℃，优选地105℃到125℃之间的温度下进行喷射烹饪1-15分钟，优选地3-10分钟，尤其是约5分钟。所述浆料被冷却到60℃-95℃，优选地80℃-90℃，并且再添加α-淀粉酶以结束水解(二次液化)。通常在pH 4.5-6.5，例如约4.8，或5.0-6.2的pH，例如5.0-6.0，例如5.0-5.5，例如约5.2，例如约5.4，例如约5.6，例如约5.8下进行所述液化过程。研磨并且液化的淀粉称为“醪液(mash)”。

可以使用本领域熟知的条件来进行步骤ii)中的糖化。例如，全部糖化工艺可以持续长达从约24小时至约72小时。在一个实施例中，在30℃-65℃之间的温度下，典型地约60℃，在40-90分钟完成了预糖化步骤，随后在同时糖化发酵步骤(SSF)中的发酵过程中进行完全的糖化。糖化典型地在从30℃-70℃、例如55℃-65℃，典型地60℃左右的温度下，并且在4与5之间的pH下，一般在约pH 4.5下进行。

发酵产物生产，特别是乙醇生产中最广泛使用的工艺为同时糖化发酵(SSF)工艺，其中没有糖化的保持阶段。

当所述发酵生物是酵母，例如酿酒酵母的菌株，并且所述所希望的发酵产物是乙醇时，SSF典型地可以在25℃和40℃之间，例如28℃和36℃之间，例如在30℃和34℃之间的温度，例如约32℃下进行。在一个实施例中，发酵进行6至120小时，特别是24至96小时。

其它发酵产物可以在本领域技术人员熟知的、适合于所讨论的发酵生物的条件和温度发酵。

发酵培养基

进行发酵的环境通常称为“发酵培养基(fermentation media或fermentationmedium)”。发酵培养基包括发酵底物，即被发酵生物代谢的碳水化合物源。根据本发明，发酵培养基可以包含用于一种或多种发酵生物的一种或多种营养素和生长刺激剂。营养素和生长刺激剂在发酵领域中广泛使用，且包括氮源例如氨；尿素、维生素和矿物质或其组合。

发酵生物

术语“发酵生物”是指适用于发酵过程中并且能够生产所希望的发酵产物的任何生物，包括细菌和真菌生物，尤其是酵母。尤其适合的发酵生物能够使糖(例如葡萄糖或麦芽糖)直接或间接发酵成(即，转化成)所希望的发酵产物(例如乙醇)。发酵生物的实例包括真菌生物，例如酵母。优选的酵母包括酵母属物种的菌株，特别是酿酒酵母。

在发酵(例如SSF)期间，有活力的发酵生物的适合的浓度在本领域是熟知的，或可以由本领域技术人员容易地确定。在一个实施例中，将发酵生物(如乙醇发酵酵母(例如，酿酒酵母))添加至发酵培养基中，使得每mL的发酵培养基的有活力的发酵生物(如酵母)计数在从10⁵至10¹²，优选从10⁷至10¹⁰的范围内，尤其是约5x10⁷个。

可商购的酵母的实例包括例如RED STAR^TM和ETHANOL RED^TM酵母(可获得自富酶泰斯公司/乐斯福公司(Fermentis/Lesaffre)，美国)、FALI(可获得自弗莱希曼酵母公司(Fleischmann’s Yeast)，美国)、SUPERSTART和THERMOSACC^TM新鲜酵母(可获得自乙醇技术公司(Ethanol Technology)，威斯康星州，美国)、BIOFERM AFT和XR(可获得自NABC-北美生物制品公司(North American Bioproducts Corporation)，佐治亚州，美国)、GERT STRAND(可获得自格特·斯特兰德公司(Gert Strand AB)，瑞典)，FERMIOL(可获得自帝斯曼特殊产品公司(DSM Specialties))、

Drive(诺维信公司)、Lift(诺维信公司)。

含淀粉材料

根据本发明可以使用任何适合的含淀粉材料。通常基于所希望的发酵产物来选择起始材料。适用于本发明的方法中的含淀粉材料的实例包括全谷物、玉米、小麦、大麦、黑麦、蜀黍、西米、木薯、木薯淀粉、高粱、稻、豌豆、豆类或甜薯或其混合物或者由其衍生的淀粉，或谷类。还考虑了糯型(waxy type)与非糯型(non-waxy type)的玉米与大麦。在一个优选的实施例中，用于根据本发明的乙醇生产的含淀粉材料是玉米或小麦。

发酵产物

术语“发酵产物”意指通过包括使用发酵生物进行的发酵步骤在内的方法生产的产物。根据本发明考虑的发酵产物包括醇类(例如乙醇、甲醇、丁醇；多元醇例如甘油、山梨醇和肌醇)；有机酸(例如柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、丁二酸、葡糖酸)；酮类(例如丙酮)；氨基酸类(例如谷氨酸)；气体类(例如H₂和CO₂)；抗生素类(例如青霉素和四环素)；酶类；维生素类(例如核黄素、B₁₂、β-胡萝卜素)；及激素类。在一个优选的实施例中，发酵产物是乙醇，例如，燃料乙醇；饮用乙醇，即中性饮用酒精；或用于消费性醇工业(例如，啤酒和酒)、乳品工业(例如，发酵的乳制品)、皮革工业和烟草工业的工业乙醇或产物。优选的啤酒类型包含爱尔啤酒(ale)、烈性黑啤酒(stout)、波特啤酒(porter)、拉格啤酒(lager)、苦啤酒(bitter)、麦芽酒(malt liquor)、低麦芽啤酒(happoushu)、高醇啤酒、低醇啤酒、低热量啤酒或清淡啤酒。优选地，本发明的方法是用于生产醇，例如乙醇。根据本发明获得的发酵产物(例如乙醇)可以用作典型地与汽油共混的燃料。然而，在乙醇的情况下，它还可以用作饮用乙醇。

发酵产物的回收

发酵或SSF之后，可以将发酵产物与发酵培养基分开。可以蒸馏浆料以提取所希望的发酵产物(例如，乙醇)。可替代地，可以通过微滤或膜过滤技术从发酵培养基中提取所希望的发酵产物。还可以通过汽提或本领域熟知的其他方法来回收发酵产物。

在以下编号的实施例中进一步阐述本发明。

实施例1.一种α-淀粉酶变体，所述α-淀粉酶变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H，其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:27。

实施例2.根据实施例1所述的变体α-淀粉酶，其中所述变体在pH 4.5下，具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性。

实施例3.根据实施例1所述的变体，其中所述变体在模式洗涤剂A中，具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性。

实施例4.根据实施例1所述的变体，其中所述变体能够产生具有右旋糖当量(DE)值高于由亲本α-淀粉酶产生的DE值的液化物。

实施例5.根据实施例1所述的变体，其中所述变体能够产生与由亲本α-淀粉酶产生的液化物相比具有降低的粘度的液化物。

实施例6.根据实施例1所述的变体α-淀粉酶，其中如改善因子(IF)确定，在pH 4.5下，所述变体具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。

实施例7.根据实施例1所述的变体，其中如改善因子(IF)确定，在模式洗涤剂A中，所述变体具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性，特别是增加的稳定性，其中IF被确定为：变体的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)对比亲本α-淀粉酶的残余活性(在热应激样品中的活性对比在4℃下孵育的样品中的活性的比率)，特别是所述变体具有至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0的IF。

实施例8.根据以上实施例中任一项所述的变体，其中所述变体进一步包含在对应于位置179-182的区域中的两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:1进行编号。

实施例9.根据实施例8所述的变体，其中所述缺失选自由以下组成的组：179*+180*、179*+181*、179*+182*、180*+181*、180*+182*、和181*+182*、特别是181*+182*。

实施例10.根据实施例1-9中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是SEQ IDNO:3，并且其中所述变体包含对应于以下的具体取代：

G48A+T49I+H68W+G107A+H156Y+A181T+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:2进行编号；或

G48A+T49I+H68W+G107A+T116Q+H156Y+A181T+A209V+Q264S+K176L+F201Y+H205Y+K213T+E255P+Q360S+D416V+R437W，使用SEQ ID NO:2进行编号；并且其中所述变体与SEQID NO:3具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％序列同一性。

实施例11.根据实施例10所述的变体，所述变体进一步包含N190F，使用SEQ IDNO:2进行编号。

实施例12.根据实施例1-9中任一项所述的变体，其中所述亲本α-淀粉酶是SEQ IDNO:1，并且其中所述变体进一步包含对应于以下的具体取代：

V59A+E129V+E177L+R179E+Q254S+M284V+V212T+Y268G+N293Y+T297N，和任选地在对应于位置179-182、特别是181*+182*的区域中的两个氨基酸的缺失，使用SEQ ID NO:1进行编号，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。

实施例13.根据实施例12所述的变体，所述变体进一步包含N193F，使用SEQ IDNO:1进行编号。

实施例14.根据以上实施例中任一项所述的变体，所述变体包含在对应于位置188的位置处的取代和在对应于位置242和279的位置处的另外的取代，特别是选自以下的具体组合：

E188P+S242Y+K279I；

E188P+S242L+K279W；

E188P+S242P+K279W；

E188P+S242L+K279I；

E188P+S242Y+K279W；

E188P+S242Y+K279F；

E188P+S242Y+K279H；

E188P+S242Y+K279L；

E188P+S242Y+K279Y；

E188P+S242P+K279I；

E188P+S242F+K279W；

E188P+S242H+K279W；

E188P+S242W+K279W。

实施例15.根据实施例1所述的变体，所述变体包含对应于I204Y的取代，使用SEQID NO:1进行编号，特别是选自以下的具体组合：

E188P+I204Y+S242Y；

E188P+I204Y+S242F；

E188P+I204Y+K279W；

E188P+I204Y+K279Y；

E188P+I204Y+K279F；

E188P+I204Y+K279H；

E188P+I204Y+K279I；

E188P+I204Y+K279L。

实施例16.根据实施例1-15中任一项所述的变体，其中所述变体α-淀粉酶是分离的。

实施例17.根据实施例1-16中任一项所述的变体，其中改变的数目是1-20个，例如1-10和1-5个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个改变。

实施例18.一种组合物，所述组合物包含根据实施例1-17中任一项所述的变体α-淀粉酶。

实施例19.根据实施例18所述的组合物，所述组合物进一步包含表面活性剂。

实施例20.根据实施例18或19中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂或表面活性剂系统，其中所述表面活性剂可以选自非离子型表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、兼性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂、及其混合物。

实施例21.根据实施例20所述的组合物，其中所述组合物包含阴离子表面活性剂，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)和/或醇乙氧基硫酸盐(AEOS)。

实施例22.根据实施例20所述的组合物，其中所述组合物包含非离子表面活性剂，例如醇乙氧基化物(AEO)。

实施例23.根据实施例19-22中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种阴离子和/或一种或多种非离子表面活性剂。

实施例24.根据实施例18-23中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂中的一种或多种，特别是直链烷基苯磺酸(LAS)、月桂醇聚醚硫酸钠(SLES)和/或醇乙氧基化物(AEO)。

实施例25.根据实施例18所述的组合物，所述组合物进一步包含蛋白酶，特别是S8蛋白酶，更特别是来自火球菌属或嗜热球菌属的S8蛋白酶。

实施例26.根据实施例25所述的组合物，其中所述蛋白酶与SEQ ID NO:19具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。

实施例27.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码根据实施例1-17中任一项所述的变体。

实施例28.一种核酸构建体，所述核酸构建体包含根据实施例27所述的多核苷酸。

实施例29.一种表达载体，所述表达载体包含根据实施例27所述的多核苷酸。

实施例30.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据实施例27所述的多核苷酸。

实施例31.一种产生根据实施例1-17所述的α-淀粉酶变体的方法，所述方法包括：

a)在适合于表达所述变体的条件下培养根据实施例30所述的宿主细胞；以及

b)任选地回收所述变体。

实施例32.根据实施例1-17所述的变体或根据实施例18或25-26所述的组合物用于液化含淀粉材料的用途。

实施例33.根据实施例1-17所述的变体在洗涤剂中的用途。

实施例34.一种用于由含淀粉材料生产糖浆的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在根据实施例1-17所述的变体α-淀粉酶或根据实施例18或25-26所述的组合物的存在下，在高于初始糊化温度的温度下，液化所述含淀粉材料；以及

b)在葡糖淀粉酶的存在下糖化步骤a)的产物。

实施例35.根据实施例34所述的方法，其中步骤b)在葡糖淀粉酶以及：

i)真菌α-淀粉酶；

ii)异淀粉酶；或

iii)真菌α-淀粉酶和异淀粉酶的存在下进行。

实施例36.根据实施例34-35所述的方法，其中所述支链淀粉酶存在于步骤a)和/或b)中。

实施例37.根据实施例34-36中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：

c)使用发酵生物发酵步骤b)的产物以生产发酵产物。

实施例38.根据实施例37所述的方法，其中所述发酵生物是酵母，并且所述发酵产物是醇。

实施例39.根据实施例38所述的方法，其中所述酵母是酿酒酵母，并且所述醇是乙醇。

实施例40.根据实施例37所述的方法，其中同时进行步骤b)和步骤c)。

实施例41.一种用于增加亲本α-淀粉酶的稳定性的方法，所述方法包括引入在对应于位置188的位置处的取代和在对应于SEQ ID NO:1的位置242或279或275的位置处的至少一个另外的取代，特别是选自由以下组成的组的取代中的一个或多个组合：E188P+S242Y、E188P+S242F、E188P+S242H、E188P+S242W、E188P+S242P、E188P+S242I、E188P+S242T、E188P+S242L、E188P+K279W、E188P+K279Y、E188P+K279F、E188P+K279H、E188P+K279I、E188P+K279L、E188P+K279D、E188P+K279M、E188P+K279S、E188P+K279T、E188P+K279N、E188P+K279Q、E188P+K279V、E188P+K279A、E188P+N275F、E188P+N275Y、E188P+N275W、和E188P+N275H。

实施例42.根据实施例41所述的方法，其中所述变体与选自由以下组成的组的亲本α-淀粉酶具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18。

实施例43.根据实施例41-42中任一项所述的方法，其中所述变体在pH4.5下，具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的热稳定性。

实施例44.根据实施例41-42中任一项所述的方法，其中所述变体在模式洗涤剂A中，具有超过所述亲本α-淀粉酶的增加的螯合剂稳定性。

通过以下实例进一步描述本发明，所述实例不应理解为对本发明的范围进行限制。

实例

方法&试剂

α-淀粉酶活性的测定

pNP-G7测定法

可以通过使用G7-pNP底物的方法确定α-淀粉酶活性。缩写为4,6-亚乙基(G7)-对硝基苯基(G1)-α,D-麦芽庚糖苷的G7-pNP是一种可以由内切淀粉酶(例如α-淀粉酶)切割的嵌段低聚糖。裂解之后，试剂盒中所包括的α-葡糖苷酶进一步消化水解底物以释放游离PNP分子，所述分子具有黄颜色并且因而可通过可见分光光度法在λ＝405nm(400-420nm)处测量。含有G7-pNP底物和α-葡糖苷酶的试剂盒由罗氏公司/日立公司(Roche/Hitachi)制造(目录号11876473)。

试剂：

来自这个试剂盒的G7-pNP底物含有22mM 4,6-亚乙基-G7-pNP和52.4mM HEPES(2-[4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基]-乙磺酸)，pH 7.0。

α-葡糖苷酶试剂含有52.4mM HEPES、87mM NaCl、12.6mM MgCl2、0.075mM CaCl2、>4kU/Lα-葡糖苷酶。

通过将1mLα-葡糖苷酶试剂与0.2mL G7-pNP底物混合，制成底物工作溶液。此底物工作溶液在使用之前立即制成。

稀释缓冲液：50mM MOPS、0.05％(w/v)Triton X100(聚乙二醇对-(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚(C14H22O(C2H4O)n(n＝9-10)))、1mM CaCl2，pH 8.0。

程序：

将待分析的淀粉酶样品稀释于稀释缓冲液中以确保稀释样品中的pH是7。通过将20μl稀释的酶样品转移至96孔微量滴定板中并添加80μl底物工作溶液来进行测定。将溶液混合并在室温预孵育1分钟并且在OD 405nm经5分钟每20秒测量吸收。

在给定的一组条件下，时间依赖性吸收曲线的斜率(每分钟的吸光度)与所讨论的α-淀粉酶的比活性(活性/mg酶)成正比。淀粉酶样品应稀释至其中斜率为0.4吸光度单位/分钟以下的水平。

Phadebas活性测定：

α-淀粉酶活性还可以通过使用Phadebas底物(例如来自瑞典隆德麦戈尔生命科学(Magle Life Sciences,Lund,Sweden))的方法来确定。Phadebas片剂包括互联淀粉聚合物，这些聚合物呈不溶于水的球状微球形式。将蓝色染料共价结合至这些微球。微球中的互联淀粉聚合物以与α-淀粉酶活性成比例的速度降解。当α-淀粉酶降解了淀粉聚合物时，释放的蓝色染料是可溶于水的并且染料浓度可通过在620nm下测量吸光度来确定。蓝色的浓度与样品中的α-淀粉酶活性成比例。

将有待分析的淀粉酶样品稀释于具有所希望的pH的活性缓冲液中。将一个底物片剂悬浮于5mL活性缓冲液中并在磁力搅拌器上混合。在混合底物期间，将150μl转移至微量滴定板(MTP)或PCR-MTP。将30μl稀释的淀粉酶样品添加至150μl底物并混合。在37℃孵育15分钟。通过添加30μl1M NaOH并且混合来停止反应。在4000xg离心MTP 5分钟。将100μl转移至新的MTP并且测量620nm的吸光度。

淀粉酶样品应稀释成使得620nm处的吸光度在0与2.2之间，并且在活性测定的线性范围内。

测定法：

为了确定残余淀粉酶活性，可以使用

Ultr淀粉酶测定试剂盒(E33651，英杰公司(Invitrogen)，拉霍亚(La Jolla)，加利福尼亚州，美国)。

底物是一种玉米淀粉衍生物，DQTM淀粉，它是用FL染料标记以使得荧光被淬灭的玉米淀粉。将含有大约1mg冻干底物的一个小瓶溶解于100微升的50mM乙酸钠(pH 4.0)中。将小瓶涡旋20秒并且在室温下在黑暗中放置，并偶尔混合直到溶解为止。然后添加900微升100mM乙酸盐、0.01％(w/v)X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5，充分涡旋并且在室温下、黑暗中储存直到准备使用为止。通过以10倍稀释于残余活性缓冲液(100mM乙酸盐、0.01％(w/v)

X100、0.125mM CaCl2，pH 5.5)中来制备储备底物工作溶液。孵育之后立即将酶在100mM乙酸盐、0.01％(W/v)X100、0.125mMCaCl2，pH 5.5中稀释至10-20ng酶蛋白/ml的浓度。

为了测定，在黑色384孔微量滴定板中，将25微升的底物工作溶液与25微升稀释的酶混合10秒。在每个孔中在25℃于15分钟内每分钟测量一次荧光强度(激发：485nm，发射：555nm)并且计算荧光强度相对于时间的曲线的斜率作为V_最大。曲线应是线性的，并且调节了残余活性测定使得稀释的参考酶溶液在活性测定的线性范围内。

在模式洗涤剂组合物中，变体的增加的稳定性

在模式洗涤剂A中，通过Phadebas测定评估，如所述产生的并且列出在实例中的变体具有增加的稳定性。制备以下洗涤剂组合物；

制备模式A(0.33％)：

模式洗涤剂A

化合物	化合物的含量(％w/w)	活性组分％(％w/w)
			LAS	12.00	11.60
AEOS，SLES	17.63	4.90
			大豆脂肪酸	2.75	2.48
可可脂肪酸	2.75	2.80
			AEO	11.00	11.00
氢氧化钠	1.75	1.80
			乙醇/丙-2-醇	3.00	2.70/0.30
MPG	6.00	6.00
			甘油	1.71	1.70
TEA	3.33	3.30
			甲酸钠	1.00	1.00
柠檬酸钠	2.00	2.00
			DTMPA	0.48	0.20
PCA	0.46	0.18
			苯氧基乙醇	0.50	0.50
H<sub>2</sub>O，离子交换	33.64	33.64

将水硬度调节至15°dH，通过添加CaCl2、MgCl2和NaHCO3

(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝4:1:7.5)至测试系统中。在洗涤之后，将纺织品用自来水沖洗并干燥。

4:1摩尔比的CaCl2和MgCl2储备溶液，具有6000dH(水硬度)

称取125.8g的CaCl2.2H2O至1升瓶中，并向其中添加500ml I型水并充分搅拌。向其中称取并添加43.8g的MgCl2.6H2O，并充分溶解，并且最终体积用I型水补至1000ml。

NaHCO3的0.535M溶液

将44.9g的碳酸氢钠溶解在100ml的I型水中。

模式A洗涤剂，水硬度为15(15°dH)

称取3.335g的模式A洗涤剂并转移到1升瓶中，并向其中添加865ml的I型水并充分混合。向其中添加7.5ml的0.535M NaHCO₃，充分混合，并且体积用1型水补至1升。为了将水硬度调节至15°dH，添加2.5ml的4:1摩尔比的CaCl₂.2H₂O和MgCl₂.6H₂O储备溶液(6000°dH)，并将混合物搅拌15min。

实例1：通过右旋糖当量(DE)和粘度评估在淀粉液化期间的淀粉酶性能

进行研究来评估在5克规模上进行的在淀粉液化期间的α-淀粉酶性能。根据下表，将至少具有E185P取代(使用SEQ ID NO:2进行编号)并且示出在SEQ ID NO:10中的对照α-淀粉酶与另外具有在位置239或276或两者的取代的α-淀粉酶变体(使用SEQ ID NO:2进行编号)进行比较。用氢氧化钾将含有10ppm钠和5ppm钙的40％总固体的淀粉浆料调节至pH4.3，并且等分到20mL玻璃小瓶中。将4.69μg酶蛋白/克干淀粉给予到5克淀粉浆料中，并且使用涡旋搅拌器混合。将含有淀粉浆料和α-淀粉酶的玻璃小瓶用含有硅隔板的螺纹盖封盖，并且转移到12小瓶加热器块中，以便在98℃下，在恒定振荡下，孵育120分钟。一式三份在30和120分钟时评估样品，从而在失活后，测量样品的右旋糖当量(DE)。对于DE确定，使用冰浴进行酶活化，并且对于粘度，使用5M HCl进行酶活化。

通过在液化后，测量2x稀释的麦芽糊精的电导率、折射率、和渗透压，获得DE值(来源：Y.Rong，M.Sillick，C.M.Gregson“Determination of Dextrose Equivalent Valueand Average Molecular Weight of Maltodextrin By Osmometry[通过渗透压，麦芽糊精的右旋糖当量值和平均分子量的确定]”；Journal of Food Science[食品科学杂志]，2009)。

使用Vipr技术(Vipr Technology)在室温下，使用Brand Tips 0-200uL进行粘度测量(速度3；200uL的体积)。通常通过流变仪测量粘度，例如博力飞(Brookfield)粘度仪。溶液粘度是当暴露于切应力(产生液体流所需的力)时变形速率的测量。ViPr技术是基于在恒定速率下产生液体流所需的压降。在吸入和排出期间，通过测量自动移液管(mViPr)的顶部的压力来实现。因此，这项技术提供了一种确定流体中酶活性的方法，其中随着时间的活性提供了流体中的粘度变化，通过使用配备有压力传感器的装置以确定流体粘度随着时间的变化，作为酶活性的测量。这项技术已详细描述于WO 2011/107472中。

所有结果都是三次评估的平均值。以下结果显示，与仅具有E185P取代的对照α-淀粉酶相比，具有E185P与在位置S239X或K276X处的取代的组合的变体导致更高DE数和更低粘度(SEQ ID NO:2进行编号)。

表1.与对照(包含E185P的SEQ ID NO:10)相比，组合取代E185P+S239X的效果

表2.与对照(包含E185P的SEQ ID NO:10)相比，组合取代E185P+K276X的效果

实例2：使用热应力条件的α-淀粉酶变体的稳定性测试

根据下表，将至少具有E185P取代(使用SEQ ID NO:2进行编号)并且示出在SEQ IDNO:10中的对照α-淀粉酶与另外具有在位置239或276或两者的取代的α-淀粉酶变体(使用SEQ ID NO:2进行编号)进行比较。

样品制备和孵育：

将纯化的蛋白质样品在含有0.12mM氯化钙(5ppm Ca²⁺)、0.01％Triton X-100的10mM K-乙酸盐缓冲液pH 4.5中标准化至0.1mg/ml(100ppm)的浓度。

应激条件：

为了向蛋白质施加应力，将标准化的蛋白质样品(10μl，终浓度5ppm)与应激缓冲液(190μl含有100mM K-乙酸盐(pH 4.3)、5ppm钙、15ppm钠、Triton X-100和1.0％经蒸煮Cargill淀粉)混合。混合(在Tecan中16+16个循环)后，将50μl样品转移至PCR板上并在80℃/83℃/85℃/87℃/90℃下孵育20min，并将保持在25℃下持续20min的50μl样品(蛋白质+应激缓冲液)视为非应激样品。

活性测定

孵育期后，将来自应激和非应激板的样品稀释5X(20μl样品+80μl含有100mM MOPS缓冲液(pH 7.0)、5ppm钙、15ppm钠和0.01％Triton X-100的活性缓冲液)。为了测量活性，将来自稀释样品的各10μl转移至384孔板，并添加至所述40ul的G-7pNP底物溶液(20ml R1溶液和5ml R2溶液，按供应商提供的试剂盒中提及的制备)中，然后在405nm下在10min内以1min的间隔测量动力学。确定非应激和应激样品的活性，并通过下式计算残余活性％：

残余活性％＝(应激样品的吸光度/非应激样品的吸光度)*100

按以下所示计算改善因子(IF)：

变体的改善因子(IF)＝(变体的残余活性％/主链残余活性％)

使用以下公式计算半衰期(T1/2(以min计))：

T1/2(变体)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-变体/100))*时间

T1/2(野生型)＝(Ln(0.5)/Ln(RA-野生型/100))*时间

表3.与S239X或K276X组合的取代E185P的效果

表4.与S239X和K276X组合的E185P取代的效果

与示于SEQ ID NO:10中的对照淀粉酶相比，在测试的温度下，所有列出的组合都显示了增加的稳定性。

实例3.α-淀粉酶变体在pH 5.0下的热稳定性测定

测定原理

确定参考α-淀粉酶(SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:1和27的衍生物)及其α-淀粉酶变体的热稳定性，方法是通过将参考α-淀粉酶以及变体在pH 5.0以及95℃的温度下，在0.9％w/v玉米淀粉、0.12mM CaCl₂和2.mM NaCl存在下一起孵育，随后使用

底物(Ultra淀粉酶测定试剂盒，E33651，分子探针(Molecular Probes))来确定残余活性。在低的钠和淀粉浓度下，在室温下孵育，相对于对照样品确定残余活性。

材料

12和24ng/mL最终酶浓度的程序实例

在两个最终酶浓度下确定残余活性(8ng/mL和16ng/mL或12ng/mL和24ng/mL)。从残余活性的计算中排除具有线性范围外的活性的样品。在线性范围内，使用平均残余活性。

·在酶稀释缓冲液中，将纯化的酶样品稀释至2.4ppm(微克/ml)的工作浓度。

·将15μL酶和135μL稳定性缓冲液转移至96孔PCR微量滴定板中并且一式两份混合(板1)。在混合后，酶浓度是240ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是92mM乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl₂、1mM NaCl、和0.9％淀粉

·来自板1，将16μL的整分试样连同144μL残余活性缓冲液一起转移到新板(板2)中，稀释后的酶浓度为24ng/mL，并且缓冲液组分的浓度是99％乙酸钾、0.01％Triton X-100、0.12％CaCl₂、0.1mM NaCl和0.09％淀粉。

·将板2储存在室温下并且用作对照样品。

·通过在PCR仪(Bio-Rad T100热循环仪)中，在95℃下孵育15或30分钟，对板1中的样品的剩余部分施加热应力。

·孵育后，将板1上的样品稀释10倍(16μL样品+144μL残余活性缓冲液)至24ng/mL的最终酶浓度。

·将孵育的样品和对照样品进一步稀释2倍(67μL样品+67μL残余活性缓冲液)至12ng/mL的最终酶浓度

·对于活性测量，将25μL稀释的酶(12ng/mL和24ng/mL样品两者)转移到黑色384孔微量滴定板中。

·通过添加25μL底物工作溶液开始反应。

·就在添加底物后，在25℃下，每分钟读取荧光持续10分钟(Ex：485nm，Em：555nm)。从测量的荧光对比时间的斜率确定活性。

·将残余活性(％RA)计算为热应力的样品中的活性/对照样品中的活性*100。在计算残余活性前，确保热应力的样品中和对照样品中的活性都在活性测定的线性范围内。可以通过测量参考淀粉酶的标准(典型地0-100ng/mL)的范围的活性，确定线性范围。

假定对数式衰减，那么使用以下方程来计算半衰期时间(T1/2(min))：

其中T是以分钟为单位的测定孵育时间，并且％RA是在测定中确定的％残余活性。

使用此测定设置，半衰期时间被确定作为参考α-淀粉酶及其变体的热稳定性的度量，如表5中所示。

表5.基于残余活性测量，在热休克后的半衰期改善因子(HIF)

与示于SEQ ID NO:11中的对照淀粉酶相比，在测试的温度下，所有列出的组合都显示了增加的稳定性。

实例4：本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:2。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)与0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。所有测量都是进行一式三份。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)的半衰期和改善因子。

表6：在pH 4.5，45℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)
				WT-参考	34	19	1,00
S239W	27	16	0,79
				S239Y	24	15	0,71
S239F	37	21	1,08
				S239H	35	20	1,02
S239Q	69	57	2,02
				K276W	4	7	0,13
K276Y	4	6	0,11
				K276F	2	5	0,06
K276H	8	8	0,23
				K276I	3	6	0,10
K276L	2	5	0,05

此实例证实在S239或K276处具有单取代的α-淀粉酶变体都没有显示在低pH下的增加的稳定性，除了S239Q具有大约2的IF。

实例5：本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入在位置185处具有脯氨酸的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ IDNO:2。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在60℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在60℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。

表7：在pH 4.5，60℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				E185P	46	27	1,00
E185P S239W	56	36	1,21
				E185P S239Y	71	60	1,53
E185P S239F	55	35	1,19
				E185P S239H	71	61	1,54
E185P S239Q	7	8	0,16
				E185P K276W	73	66	1,58
E185P K276Y	57	37	1,23
				E185P K276F	61	42	1,32
E185P K276H	58	38	1,25
				E185P K276i	93	273	2,00
E185P K276L	59	40	1,28
				E185P S239Y K276W	52	32	1,13
E185P S239F K276W	89	180	1,93
				E185P S239Y K276Y	83	115	1,80
E185P S239Y K276F	87	153	1,89
				E185P S239Y K276H	88	157	1,89
E185P S239Y K276I	88	168	1,91
				E185P S239Y K276L	85	132	1,85

此实例证实在位置185处具有脯氨酸的淀粉酶参考(SEQ ID NO:2)中引入在S239至W、Y、F或H和/或在K276至W、Y、F、H、L或I的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，对于与E185P组合的取代S239Q，观察到不稳定作用。

实例6：本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有修饰E185P I201Y的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:2。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在80℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在80℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。表8：在pH4.5，80℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				E185P I201Y	15	11	1,00
E185P I201Y S239Q	3	6	0,24
				E185P I201Y S239Y	41	23	2,81
E185P I201Y K276W	23	14	1,57
				E185P I201Y K276Y	34	19	2,36
E185P I201Y K276F	37	21	2,53
				E185P I201Y K276H	28	16	1,95
E185P I201Y K276I	42	24	2,92
				E185P I201Y K276L	20	13	1,36
E185P I201Y S239F	45	26	3,07

此实例证实在位置185处具有脯氨酸和在位置201处具有酪氨酸的淀粉酶参考(使用SEQ ID NO:2进行编号)中引入在S239至Y或F和在K276至W、Y、F、H、I或L的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，对于与E185P和I201Y组合的取代S239Q，观察到不稳定作用。

实例7：本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:2。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育60分钟。紧接着，将这些样品在100mM测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)的半衰期和改善因子。

表9：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育60min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)
				WT-参考	56	72	1,00
S239W	14	21	0,26
				S239Y	79	181	1,41
S239F	82	208	1,46
				S239H	88	329	1,57
S239Q	57	75	1,02
				K276W	0	-	-
K276Y	0	-	-
				K276F	0	-	-
K276H	0	-	-
				K276i	0	-	-
K276L	0	-	-

此实例证实在S239至Y、F或H处具有单取代的α-淀粉酶变体相对于野生型参考，显著增加了稳定性。

实例8：本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有修饰E185P的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:2)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:2。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育18小时。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(同上)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于E187P变体的半衰期和改善因子。

表10：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育18小时后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(小时)	IF
				E185P	36	12	1,00
E185P S239W	86	85	2,37
				E185P S239Y	82	63	2,25
E185P S239H	63	27	1,71
				E185P S239Q	3	4	0,08
E185P K276W	90	121	2,47
				E185P K276Y	75	44	2,06
E185P K276F	82	64	2,26
				E185P K276i	52	19	1,43
E185P K276L	47	17	1,29
				E185P S239F K276W	95	223	2,59
E185P S239H K276W	51	19	1,40
				E185P S239Y K276Y	69	34	1,90
E185P S239Y K276F	75	44	2,06
				E185P S239Y K276H	85	77	2,33
E185P S239Y K276L	74	41	2,03

此实例证实在位置185处具有脯氨酸的淀粉酶参考(使用SEQ ID NO:2进行编号)中引入在S239至W、Y或H和/或在K276至W、Y、F、L或I处的取代的α-淀粉酶变体具有在具有EDTA的洗涤剂中的增加的稳定性。出人意料地，对于与E185P组合的取代S239Q，观察到不稳定作用。

实例9：本发明的噬纤维菌属α-淀粉酶变体的低pH稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:5。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在40℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)与0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。所有测量都是进行一式三份。将残余活性计算为已经在40℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)和相对于E187P(IF-E187P)变体的半衰期和改善因子。

表11：在pH 4.5，40℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)	IF(E187P)
					WT-参考	20	13	1,00
S241Q	60	41	2,93
					S241W	16	11	0,79
S241Y	15	11	0,73
					S241F	17	12	0,85
S241H	8	8	0,41
					K278W	8	8	0,41
K278F	1	4	0,03
					K278H	0	4	0,02
K278I	0	3	0,01
					E187P	7	8	0,35	1,00
E187P S241Q	1	5	0,06	0,17
					E187P S241Y	57	37	2,77	7,92
E187P S241F	47	28	2,31	6,61
					E187P S241H	57	37	2,80	8,00
E187P K278W	13	10	0,65	1,87
					E187P K278F	17	12	0,81	2,32
E187P K278I	27	16	1,31	3,74

此实例证实在S241至W、Y、F、H或K278W、F、H、I处具有单取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的减少的稳定性。但是，当引入在位置187处具有脯氨酸(P)的淀粉酶(根据SEQ IDNo:5的编号)时，这些取代显著增加了在低pH下的稳定性。出人意料地，发现与E187P组合，取代S241Q示出为不稳定。

实例10：本发明的噬纤维菌属α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有修饰R178*+G179*+E187P的噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ IDNO:5。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在60℃下孵育60分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在60℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。

表12：在pH 4.5，60℃下孵育60min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				R178*G179*E187P	40	46	1,00
R178*G179*E187P S241Q	1	9	0,02
				R178*G179*E187P S241Y	59	80	1,47
R178*G179*E187P S241F	55	69	1,36
				R178*G179*E187P K278W	57	73	1,40
R178*G179*E187P K278Y	86	276	2,13
				R178*G179*E187P K278F	69	112	1,70
R178*G179*E187P K278I	79	179	1,96
				R178*G179*E187P S241Y K278W	68	109	1,69
R178*G179*E187P S241W K278I	72	127	1,78

此实例证实在S241至W、Y、F和在K278至W、Y、F或I处具有取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，发现与E187P组合，S241Q取代显示显著的不稳定作用。

实例11：本发明的噬纤维菌属α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:5。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育60分钟。紧接着，将这些样品在100mM测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)和相对于E187P(IF-E187P)变体的半衰期和改善因子。

表13：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育60min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)	IF(E187P)
					WT-参考	1,8	10	1,00
S241Q	8,6	17	4,88
					S241W	0	-	-
S241Y	0	-	-
					S241F	1,3	10	0,76
S241H	3,4	12	1,94
					K278Q	0	-	-
K278W	0	-	-
					K278F	0	-	-
K278H	0	-	-
					K278I	0	-	-
E187P	16,5	23	9,43	1,00
					E187P S241Q	0	-	-	-
E187P S241Y	54,0	68	30,81	3,27
					E187P S241F	32,1	37	18,29	1,94
E187P S241H	72,2	128	41,14	4,36
					E187P K278F	27,1	32	15,43	1,64
E187P K278I	21,8	27	12,41	1,32

此实例证实尽管在S241或K278处具有单取代的α-淀粉酶变体在具有EDTA螯合剂的洗涤剂中没有或甚至不稳定。但是，当引入在位置187处具有脯氨酸(P)的淀粉酶(根据SEQ ID No:5的编号)时，相对于野生型参考，并且在多数情况下也相对于E187P变体，S241至Y、F或H和K278至F或I取代显著增加稳定性。出人意料地，对于取代S241Q，观察到相反的效果，在E187P存在下，它变得高度不稳定。

实例12：本发明的噬纤维菌属α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有修饰R178*G179*E187P的噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ IDNO:5。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育240分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(同上)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于E187P变体的半衰期和改善因子。

表14：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育240min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				R178*G179*E187P	8,2	72	1,00
R178*G179*E187P S241Q	7,4	69	0,90
				R178*G179*E187P S241Y	9,5	77	1,15
R178*G179*E187P S241F	18,9	108	2,29
				R178*G179*E187P S241H	19,3	110	2,34
R178*G179*E187P K278W	66,7	444	8,09
				R178*G179*E187P K278Y	88,8	1.510	10,77
R178*G179*E187P K278F	70,6	517	8,56
				R178*G179*E187P K278I	69,7	499	8,45

此实例证实在S241至Y、F或H和在K278至W、Y、F或I处具有取代的α-淀粉酶变体具有在具有EDTA的洗涤剂中的增加的稳定性。出人意料地，对于与E187P组合的取代S241Q，观察到小的不稳定作用。

实例13：本发明的噬纤维菌属α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有多个修饰(N126Y E132H R178*G179*T180D E187P I203Y)的噬纤维菌属α-淀粉酶(SEQ ID NO:5)的变体(它被称为参考淀粉酶)中。下表中指示了引入的取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:5。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育18小时。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(同上)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考淀粉酶的半衰期和改善因子。

表15：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育18小时后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(小时)	IF
				参考	48	17	1,00
+S241Q	27	9	0,56
				+S241W	59	23	1,22
+S241Y	74	42	1,54
				+S241F	73	39	1,51
+S241H	74	42	1,54
				+K278W	71	36	1,47
+K278Y	61	26	1,27
				+K278I	50	18	1,04
+S241Y K278Y	85	77	1,76
				+S241Y K278F	55	21	1,14

此实例证实在S241至W、Y、F或H和/或K278至W、Y、或I处的取代增加了在具有EDTA的洗涤剂中的稳定性。

实例14：本发明的盐敏芽孢杆菌α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有修饰D183*G184*E190P的盐敏芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ IDNO:6。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育60分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(同上)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于E190P变体的半衰期和改善因子。

表16：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育60min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				D183*G184*E190P	12	20	1,00
D183*G184*E190P S244Q	11	18	0,85
				D183*G184*E190P S244W	25	30	2,00
D183*G184*E190P S244F	68	107	5,48
				D183*G184*E190P K281W	34	39	2,77
D183*G184*E190P K281Y	23	28	1,82
				D183*G184*E190P K281I	19	25	1,57
D183*G184*E190P S244Y K281W	60	80	4,81
				D183*G184*E190P S244F K281W	29	34	2,38
D183*G184*E190P S244Y K281F	28	32	2,22
				D183*G184*E190P S244Y K281I	69	112	5,58

此实例证实在S244至W、或F和在K281至W、Y、或I处具有取代的α-淀粉酶变体具有在具有EDTA的洗涤剂中的增加的稳定性。

实例15：本发明的盐敏芽孢杆菌α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有多个修饰(H1*G7A G109AW140YG182*D183*E190P V206Y Y243F E260G F267Y N280S G304R E391AG476K)的盐敏芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID NO:6)的变体(它被称为参考淀粉酶)中。下表中指示了引入的取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:6。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在45℃下孵育18小时。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(同上)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在45℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考淀粉酶的半衰期和改善因子。

表17：在45℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育18小时后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(小时)	IF
				参考	27	10	1,00
+S244Q	18	7	0,67
				+S244W	39	13	1,46
+S244F	47	16	1,73
				+S244H	61	25	2,25
+K281I	69	34	2,57
				+K281F	74	42	2,75
+S244Y K281I	37	13	1,38
				+S244H K281W	48	17	1,77
+S244W K281W	56	22	2,09

此实例证实在S244至W、F、或H和K281至F或I处的取代增加了在具有EDTA的洗涤剂中的稳定性。

实例16：本发明的芽孢杆菌属物种AAI10α-淀粉酶变体的低pH稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入芽孢杆菌属物种AAI10α-淀粉酶(SEQID NO:7)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:7。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在50℃下孵育60分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)与0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。所有测量都是进行一式三份。将残余活性计算为已经在50℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)的半衰期和改善因子。

表18：在pH 4.5，50℃下孵育60min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)
				WT-参考	19	25	1,00
E190P	0
				S244Q	0
S244W	0
				S244Y	0
S244F	0
				S244H	0
S244Q	0
				K281W	0
K281Y	0
				K281F	0
K281I	0
				E190P S244W	96	996	5,09
E190P S244Y	59	78	3,11
				E190P S244H	43	49	2,28
E190P K281W	35	40	1,88
				E190P K281F	58	76	3,07

此实例证实在S244或K281处具有单取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的减少的稳定性。但是，当引入在位置190处具有脯氨酸(P)的淀粉酶(根据SEQ ID No:7的编号)时，这些取代显著增加了在低pH下的稳定性。

实例17：本发明的芽孢杆菌属物种AAI10α-淀粉酶变体的螯合剂稳定性

通过标准定向位点方法，将氨基酸取代引入芽孢杆菌属物种AAI10α-淀粉酶(SEQID NO:7)。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:7。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂A中稀释10倍，所以多的浓度是90％洗涤剂和0.45％EDTA。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在50℃下孵育90分钟。紧接着，将这些样品在100mM测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在50℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于WT(IF-WT)的半衰期和改善因子。

表19：在50℃下，在具有EDTA的模式洗涤剂A中孵育90min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF(WT)
				WT-参考	25	45	1,00
E190P	0
				S244Q	0
S244W	12	29	0,48
				S244Y	0
S244F	0
				S244H	0
S244Q	0
				K281W	0
K281Y	0
				K281F	0
K281I	0
				E190P S244W	86	425	3,47
E190P S244Y	73	195	2,92
				E190P S244F	75	222	3,04
E190P S244H	35	59	1,40
				E190P S244Q	82	314	3,30
E190P K281W	26	46	1,04
				E190P K281Y	35	59	1,41
E190P K281I	38	65	1,53

此实例证实尽管在S244或K281处具有单取代的α-淀粉酶变体具有在具有EDTA的洗涤剂中的不稳定作用。但是，当引入在位置190处具有脯氨酸(P)的淀粉酶(根据SEQ IDNo:7的编号)时，相对于野生型参考，S244至Q、W、Y、F或H和K281至W、Y或I取代显著增加稳定性。

实例18：本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入在位置188处具有脯氨酸(E188P)的嗜热脂肪芽孢杆菌野生型α-淀粉酶(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:27)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:1。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在60℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在60℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。

表20：在pH 4.5，60℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				E188P(参考)	31	18	1,0
S242Q	2	5	0,3
				S242Y	45	26	1,5
S242F	54	34	1,9
				K279W	44	26	1,4
K279Y	49	29	1,7
				S242Y K279i	60	41	2,3

此实例证实在位置188处具有脯氨酸的淀粉酶参考中引入在S242至Y或F和/或在K279至W、Y、或I处的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，对于与E188P组合的取代S242Q，观察到不稳定作用。

实例19：本发明的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有在位置180和181处的两个氨基酸缺失和在位置188处的脯氨酸(E188P)的嗜热脂肪芽孢杆菌野生型α-淀粉酶(SEQ ID NO:1或27)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:1。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在70℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在70℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。

表21：在pH 4.5，70℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

淀粉酶变体	RA	半衰期(min)	IF
				I181*G182*E188P	47	27	1,0
S242Q	30	17	0,6
				S242F	58	38	1,4
K279W	67	52	1,9
				K279Y	63	45	1,6
K279F	64	46	1,7
				S242F K279W	92	263	9,6
S242H K279W	79	88	3,2
				S242W K279W	67	53	1,9
S242Y K279i	90	192	7,0
				S242Y K279l	85	130	4,7
S242Y K279F	70	57	2,1
				S242Y K279H	77	82	3,0

此实例证实在具有在位置180和181处的缺失和在位置188处的脯氨酸的淀粉酶参考中引入在S242至Y、W或F和在K279至W、Y、F、H、I或L的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，对于与在位置180和181处的双缺失和在位置188处的脯氨酸组合的取代S242Q，观察到不稳定作用。

实例20：本发明的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶变体的低pH稳定性

使用标准定向位点方法，将氨基酸取代引入具有在位置180和181处的两个氨基酸缺失、在位置189处的脯氨酸(E189P)和在对应于SEQ ID NO.4中的氨基酸485至583的CBM20结构域的缺失的芽孢杆菌属物种TS-23α-淀粉酶(SEQ ID NO:4)的变体中。下表中指示了取代并且位置编号是根据SEQ ID NO:4。将修饰的淀粉酶基因转化枯草芽孢杆菌中到并且在枯草芽孢杆菌中进行表达。将枯草芽孢杆菌肉汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液分离并且在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中稀释10倍。然后将这些样品分为两个样品；将一个在4℃下储存，并且另一个在50℃下孵育30分钟。紧接着，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)+0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。将残余活性计算为已经在50℃下孵育的样品中的活性相对于已经在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。此外，计算相对于参考的半衰期和改善因子。

表22：在pH 4.5，50℃下孵育30min后，α-淀粉酶变体的残余活性(RA)。

此实例证实在具有在位置180和181处的缺失、在位置189处的脯氨酸和CBM20结构域(SEQ ID NO.4)的缺失的淀粉酶参考中引入在S243至Y、W、F或H和在K280至W、Y、F或H的取代的α-淀粉酶变体具有在低pH下的增加的稳定性。出人意料地，对于与在位置180和181处的双缺失和在位置189处的脯氨酸组合的取代S243Q，观察到不稳定作用。

实例21：本发明的α-淀粉酶变体的增加的稳定性

在以上实例中，与SEQ.ID.NO.2中的E185P取代和其他淀粉酶中的对应取代组合的S239和/或K276的取代已经显示增加了淀粉酶的稳定性。可以通过使用例如Crystal X软件包或类似蛋白质序列比对软件的序列比对，或通过使用例如Pymol软件包或类似蛋白质结构显示软件的结构比对，鉴定其他淀粉酶中(特别是属于CAZY家族GH13_5的淀粉酶中)的对应氨基酸。这些位置中的至少一个被取代为与在对应于SEQ.ID.NO.2中的E185P的位置处的脯氨酸引入组合的W、Y、F、H、I或L，从而产生具有增加的稳定性的α-淀粉酶。

例如，在SEQ ID NO:12中，引入了与D191P组合的G245W、Y、F、H、I或L取代，和/或与D191P组合的R282W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:13中，引入了与D185P组合的G239W、Y、F、H、I或L取代，和/或与D185P组合的R276W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:14中，引入了与E186P组合的D240W、Y、F、H、I或L取代，和/或与E186P组合的K277W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:15中，引入了与N187P组合的D241W、Y、F、H、I或L取代，和/或与N187P组合的V278W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:16中，引入了与E190P组合的D244W、Y、F、H、I或L取代，和/或与E190P组合的K282W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:17中，引入了与E185P组合的S239W、Y、F、H、I或L取代，和/或与E185P组合的K276W、Y、F、H、I或L取代。

在SEQ ID NO:18中，引入了与G186P组合的A240W、Y、F、H、I或L取代，和/或与G186P组合的S277W、Y、F、H、I或L取代。

将参考淀粉酶和修饰的淀粉酶基因转化到枯草芽孢杆菌中并且在其中表达，将汤进行离心，并且将含有淀粉酶的上清液用于确定在应力条件(例如在具有5ppm CaCl₂的100mM K-乙酸盐，pH 4.5中，或例如在具有0.5％EDTA的模式洗涤剂中)下的稳定性。孵育后，将这些样品在测定缓冲液(100mM伯瑞坦-罗宾森(Britton-Robinson)缓冲液(100mM乙酸+100mM磷酸+100mM硼酸)与0.12mM CaCl₂+0.01％Brij，pH调节至pH 7.3)中稀释10倍，并且如在方法下所描述的使用Phadebas淀粉酶测定测量淀粉酶活性。所有测量都是进行一式三份。将残余活性计算为在应力温度下孵育的样品中的活性相对于在4℃下孵育的样品中的活性之间的比率。从残余活性，计算相对于参考淀粉酶(即具体修饰的起点)的半衰期和改善因子。

本文描述和要求保护的本发明不限于本文披露的具体方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸

<130> 14643-WO-PCT

<160> 27

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 484

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌

<400> 1

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn

20 25 30

Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys

35 40 45

Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp

50 55 60

Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met

85 90 95

Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly

100 105 110

Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln

115 120 125

Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe

130 135 140

Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His

145 150 155 160

Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr

165 170 175

Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu

180 185 190

Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Leu Asp Met Asp His

195 200 205

Pro Glu Val Val Thr Glu Leu Lys Asn Trp Gly Lys Trp Tyr Val Asn

210 215 220

Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys

225 230 235 240

Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly

245 250 255

Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys

260 265 270

Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp

275 280 285

Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala

290 295 300

Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro

305 310 315 320

Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln

325 330 335

Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala

340 345 350

Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp

355 360 365

Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile

370 375 380

Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His

385 390 395 400

Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val

405 410 415

Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val

435 440 445

Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Asn Ser

450 455 460

Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

465 470 475 480

Val Pro Arg Lys

<210> 2

<211> 483

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 2

Ala Asn Leu Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Met Pro

1 5 10 15

Asn Asp Gly Gln His Trp Arg Arg Leu Gln Asn Asp Ser Ala Tyr Leu

20 25 30

Ala Glu His Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly

35 40 45

Thr Ser Gln Ala Asp Val Gly Tyr Gly Ala Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu

50 55 60

Gly Glu Phe His Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr Lys

65 70 75 80

Gly Glu Leu Gln Ser Ala Ile Lys Ser Leu His Ser Arg Asp Ile Asn

85 90 95

Val Tyr Gly Asp Val Val Ile Asn His Lys Gly Gly Ala Asp Ala Thr

100 105 110

Glu Asp Val Thr Ala Val Glu Val Asp Pro Ala Asp Arg Asn Arg Val

115 120 125

Ile Ser Gly Glu His Leu Ile Lys Ala Trp Thr His Phe His Phe Pro

130 135 140

Gly Arg Gly Ser Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe

145 150 155 160

Asp Gly Thr Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Asn Arg Ile Tyr Lys

165 170 175

Phe Gln Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Ser Asn Glu Asn Gly Asn

180 185 190

Tyr Asp Tyr Leu Met Tyr Ala Asp Ile Asp Tyr Asp His Pro Asp Val

195 200 205

Ala Ala Glu Ile Lys Arg Trp Gly Thr Trp Tyr Ala Asn Glu Leu Gln

210 215 220

Leu Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys Phe Ser Phe

225 230 235 240

Leu Arg Asp Trp Val Asn His Val Arg Glu Lys Thr Gly Lys Glu Met

245 250 255

Phe Thr Val Ala Glu Tyr Trp Gln Asn Asp Leu Gly Ala Leu Glu Asn

260 265 270

Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Phe Asn His Ser Val Phe Asp Val Pro Leu

275 280 285

His Tyr Gln Phe His Ala Ala Ser Thr Gln Gly Gly Gly Tyr Asp Met

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Ser Ser Val Ala Asn Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

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<212> PRT

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<220>

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210 215 220

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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Arg

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<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

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275 280 285

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Lys Ala Val Thr Leu Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser

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Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Leu Asn Lys Thr Asn Trp Asn His Ser Val

275 280 285

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290 295 300

Gly Asn Tyr Asp Met Ala Lys Leu Leu Asn Gly Thr Val Val Gln Lys

305 310 315 320

His Pro Met His Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro

325 330 335

Gly Glu Ser Leu Glu Ser Phe Val Gln Glu Trp Phe Lys Pro Leu Ala

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355 360 365

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<211> 485

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种

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<211> 485

<212> PRT

<213> 芽孢杆菌属物种

<400> 8

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Leu Pro Asn Asp Gly Asn His Trp Asn Arg Leu Arg Ser Asp Ala Ser

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Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Thr His Gly Val Pro Ala Met Lys Ser

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Gly Ala Gly Gly Asn Lys Trp Met Phe Val Gly Arg Asn Lys Ala Gly

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<223> 基于SEQ ID NO: 3的变体

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<213> 人工的

<220>

<223> 基于SEQ ID NO: 1的变体

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<213> 乙酰微小杆菌

<400> 12

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485

<210> 13

<211> 483

<212> PRT

<213> 西伯利亚微小杆菌

<400> 13

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Arg Gln Gln

<210> 14

<211> 480

<212> PRT

<213> 解凝乳类芽孢杆菌（Paenibacillus curdlanilyticus）

<400> 14

Ala Asp Asn Gly Thr Ile Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu Pro Asn

1 5 10 15

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Thr Ser Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Gln Tyr Asp Phe Pro Gly

130 135 140

Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His Phe Asp

145 150 155 160

Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gly Leu Asn Arg Ile Tyr Lys Leu

165 170 175

Arg Gly Asp Gly Lys Asp Trp Asp Trp Glu Val Asp Ser Glu Tyr Gly

180 185 190

Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Leu Asp Phe Asn His Pro Asp

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Trp Gly Asn Phe Trp Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp Ala Lys

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<210> 15

<211> 483

<212> PRT

<213> 巨大芽孢杆菌

<400> 15

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1 5 10 15

Ala Asp Gly Glu His Trp Gln Arg Leu Lys Glu Leu Ala Pro Gln Leu

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130 135 140

Gly Arg Gly Asp Lys Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Asn Phe Asn His Phe

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Asn Gly Thr Asp Tyr Asp Asp Lys Asn Gly Lys Glu Gly Val Phe Arg

165 170 175

Ile Ala Gly Glu Asn Lys Ser Trp Asn Glu Asn Val Asp Gln Glu Phe

180 185 190

Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asn Ile Asp Tyr Asp His Pro

195 200 205

Glu Val Arg Glu Glu Met Ile Asn Trp Gly Lys Trp Leu Ala Asp Thr

210 215 220

Leu Gln Cys Asp Gly Tyr Arg Leu Asp Ala Ile Lys His Ile Asn His

225 230 235 240

Asp Phe Ile Lys Glu Phe Ala His Glu Leu Ser Ser Ser Gln Glu Lys

245 250 255

Pro Phe Tyr Phe Val Gly Glu Phe Trp Asn Pro Glu Leu Thr Ala Cys

260 265 270

Gln Glu Phe Leu Asp Val Ile Asp Tyr Gln Ile Asp Leu Phe Asp Val

275 280 285

Ser Leu His Tyr Lys Leu His Glu Ala Ser Gln Gln Gly Arg Asp Phe

290 295 300

Asp Leu Thr Thr Ile Phe Asp Asp Thr Leu Val Lys Thr His Pro Leu

305 310 315 320

Asn Val Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Gln Pro Asn Glu Ser

325 330 335

Leu Glu Ser Trp Val Glu Asp Trp Phe Lys Gln Ser Ala Tyr Ala Leu

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Ile Leu Leu Arg Glu Asp Gly Tyr Pro Cys Val Phe Tyr Gly Asp Tyr

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Phe Gly Ile Gly Gly Glu His Pro Ile Glu Gly Lys Glu Lys Asp Ile

370 375 380

Ser Ala Leu Leu His Val Arg Tyr Asp Lys Ala Tyr Gly Gln Gln Asp

385 390 395 400

Asp Tyr Phe Asp His Pro Asn Thr Ile Gly Trp Val Arg His Gly Val

405 410 415

Glu Glu Phe Glu Lys Ser Gly Cys Ala Val Val Met Ser Asn Gly Glu

420 425 430

Asp Gly Glu Lys Arg Met Phe Val Gly Glu His Arg Ser Gly Gln Thr

435 440 445

Trp Ile Asp Phe Thr Asn Asn Arg Glu Asp Gln Val Val Ile Glu Glu

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Asp Gly Tyr Gly Gln Phe Pro Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp

465 470 475 480

Ala Glu Ala

<210> 16

<211> 486

<212> PRT

<213> 脂环酸芽孢杆菌属物种18711

<400> 16

Ala Phe Ala Gly Asp Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr

1 5 10 15

Leu Pro Asn Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Met Gly Ser Asp Ala Ser

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His Leu Lys Ser Ile Gly Ile Thr Gly Val Trp Phe Pro Pro Ala Tyr

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Asp Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly

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Phe Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp His Ser Tyr

145 150 155 160

Tyr Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Gln Ser Arg Gln Leu Ser Gly Lys

165 170 175

Ile Tyr Gln Ile Gln Gly Thr Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp

180 185 190

Ser Glu Asn Gly Asn Tyr Asp Tyr Leu Met Gly Ala Asp Ile Asp Tyr

195 200 205

Asp His Pro Asp Val Gln Thr Glu Val Lys Asn Trp Gly Lys Trp Phe

210 215 220

Val Asn Thr Leu Asn Leu Asp Gly Val Arg Leu Asp Ala Val Lys His

225 230 235 240

Ile Lys Phe Asp Tyr Met Ser Ser Trp Leu Ser Ser Val Lys Ser Thr

245 250 255

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260 265 270

Leu Gly Ala Leu Glu Asn Tyr Glu Asn Lys Thr Asn Trp Ser Met Ser

275 280 285

Leu Phe Asp Val Pro Leu His Met Asn Phe Gln Ala Ala Ala Asn Gly

290 295 300

Gly Gly Tyr Tyr Asp Met Arg Asn Leu Leu Asn Asn Thr Met Met Lys

305 310 315 320

Asn His Pro Ile Gln Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu

325 330 335

Pro Gly Gln Ala Leu Gln Ser Trp Val Ser Asp Trp Phe Lys Pro Leu

340 345 350

Ala Tyr Ala Thr Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Cys Val Phe

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Tyr Gly Asp Tyr Tyr Gly Ile Pro Ser Gln Ser Val Ser Ala Lys Ser

370 375 380

Thr Trp Leu Asp Lys Gln Leu Ser Ala Arg Lys Ser Tyr Ala Tyr Gly

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Thr Gln His Asp Tyr Leu Asp Asn Gln Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg

405 410 415

Glu Gly Asp Ser Ala His Ala Gly Ser Gly Leu Ala Thr Val Met Ser

420 425 430

Asp Gly Pro Gly Gly Ser Lys Thr Met Tyr Val Gly Thr Ala His Ala

435 440 445

Gly Gln Val Phe Lys Asp Ile Thr Gly Asn Arg Thr Asp Thr Val Thr

450 455 460

Ile Asn Ser Ala Gly Asn Gly Thr Phe Pro Cys Asn Gly Gly Ser Val

465 470 475 480

Ser Ile Trp Val Lys Gln

485

<210> 17

<211> 483

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌

<400> 17

Val Asn Gly Thr Leu Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Thr Pro Asn Asp

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Gly Gln His Trp Lys Arg Leu Gln Asn Asp Ala Glu His Leu Ser Asp

20 25 30

Ile Gly Ile Thr Ala Val Trp Ile Pro Pro Ala Tyr Lys Gly Leu Ser

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Gln Ser Asp Asn Gly Tyr Gly Pro Tyr Asp Leu Tyr Asp Leu Gly Glu

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Val Thr Ala Val Glu Val Asn Pro Ala Asn Arg Asn Gln Val Thr Ser

115 120 125

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Gly Asn Thr Tyr Ser Asp Phe Lys Trp His Trp Tyr His Phe Asp Gly

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275 280 285

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Arg Arg Leu Leu Asp Gly Thr Val Val Ser Arg His Pro Glu Lys Ala

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Val Thr Phe Val Glu Asn His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Ser Leu Glu

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Ser Thr Val Gln Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Phe Ile Leu

340 345 350

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355 360 365

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Asp Tyr Ile Asp His Pro Asp Val Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Asp

405 410 415

Ser Ser Ala Ala Lys Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro

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Gly Gly Ser Lys Arg Met Tyr Ala Gly Leu Lys Asn Ala Gly Glu Thr

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Trp Tyr Asp Ile Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Lys Ile Gly Ser

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Asp Gly Trp Gly Glu Phe His Val Asn Asp Gly Ser Val Ser Ile Tyr

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Val Gln Lys

<210> 18

<211> 486

<212> PRT

<213> 梭菌属物种

<400> 18

Met Asp Asn Gly Leu Met Phe Gln Gly Phe Glu Trp Tyr Met Pro Asp

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65 70 75 80

Glu Leu Leu Asp Leu Ile Lys Ala Ile His Asp Glu Gly Met Tyr Val

85 90 95

Tyr Ala Asp Val Val Leu Asn His Lys Ala Gly Ala Asp Phe Glu Glu

100 105 110

Glu Phe Met Ala Val Lys Val Asp Asn Asn Asn Arg Thr Lys Glu Ile

115 120 125

Glu Lys Gln Arg Asn Ile Lys Ala Trp Thr Gly Phe Asn Phe Pro Gly

130 135 140

Arg Asn Gly Lys Tyr Ser Asp Phe Thr Trp Asn Tyr Asn His Phe Ser

145 150 155 160

Gly Val Asp Tyr Asp Ala Ser Thr Gly Asp Lys Gly Ile Phe Arg Ile

165 170 175

Ile Gly Glu Asn Lys Gly Trp Asn Trp Gly Val Ser His Asp Asn Gly

180 185 190

Asn Phe Asp Tyr Leu Met Phe Ala Asp Ile Asp His Ala Asn Thr Glu

195 200 205

Val Lys Glu Glu Leu Lys Arg Trp Val Asp Trp Phe Ile Glu Glu Leu

210 215 220

Asn Leu Asp Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Ile Asp Ser Ala

225 230 235 240

Phe Leu Glu Glu Phe Thr Ser His Ile Lys Glu Lys Met Gly Asp Glu

245 250 255

Phe Tyr Phe Leu Gly Glu Tyr Trp Asp His Asp Val Lys Asn Lys Ile

260 265 270

Lys Phe Met Lys Ser Thr Lys Tyr Ser Met Asp Leu Phe Asp Val Gly

275 280 285

Leu His Phe Asn Met Tyr Ala Ala Ser Gln Asn Ser Ala Asn Tyr Asp

290 295 300

Leu Arg Lys Leu Phe Asp Asn Thr Val Thr Lys Thr Asp Pro Ala Met

305 310 315 320

Ser Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Ser Glu Pro Gly Gln Ser Leu

325 330 335

Glu Ser Phe Val Lys Glu Trp Phe Lys Glu Ile Ala Tyr Gly Ile Ile

340 345 350

Leu Leu Arg Lys Asp Gly Tyr Pro Cys Ile Phe Tyr Gly Asp Tyr Tyr

355 360 365

Gly Ile Gly Gly Glu Phe Met Ile Lys Pro Leu Lys Glu Lys Ile Asp

370 375 380

Val Leu Ser Leu Ile Arg Lys Asn His Ala Tyr Gly Ala Gln Asp Asp

385 390 395 400

Tyr Phe Lys Glu Lys Asp Leu Ile Gly Trp Val Arg Gln Gly Thr Glu

405 410 415

Asp His Pro Gly Lys Cys Ala Val Val Ile Ser Thr Arg Glu Lys Lys

420 425 430

Thr Ile Ser Met Phe Ile Asp Lys Tyr His Ser Gly Lys Val Tyr Ala

435 440 445

Asp Phe Thr Gly Asn Cys Ala Asp Lys Val Lys Val Asp Glu Glu Gly

450 455 460

Tyr Gly Glu Phe Thr Ala Glu Ala Gly Ser Ile Ser Val Trp Leu Glu

465 470 475 480

Glu Glu Ile Val Leu Gly

485

<210> 19

<211> 413

<212> PRT

<213> 强烈火球菌

<400> 19

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gln Val Met Ala Thr

1 5 10 15

Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Ile Thr Ile Gly Ile

20 25 30

Ile Asp Thr Gly Ile Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gln Gly Lys Val

35 40 45

Ile Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp Asp

50 55 60

His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser Ile Ala Ala Gly Thr Gly Ala

65 70 75 80

Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala Lys Leu Ala

85 90 95

Gly Ile Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser Ile Ser Thr Ile

100 105 110

Ile Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly Ile

115 120 125

Lys Val Ile Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser Gln Ser Ser Asp Gly Thr

130 135 140

Asp Ala Leu Ser Gln Ala Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val

145 150 155 160

Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr Ile Gly

165 170 175

Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys Val Ile Thr Val Gly Ala Val Asp Lys

180 185 190

Tyr Asp Val Ile Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly

195 200 205

Arg Leu Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp Ile Ile Ala Ala

210 215 220

Arg Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gln Pro Ile Asn Asp Tyr Tyr Thr

225 230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ile Ala

245 250 255

Ala Leu Leu Leu Gln Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys Val Lys

260 265 270

Thr Ala Leu Ile Glu Thr Ala Asp Ile Val Lys Pro Asp Glu Ile Ala

275 280 285

Asp Ile Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala Ile Asn

290 295 300

Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala Asn Lys

305 310 315 320

Gly Ser Gln Thr His Gln Phe Val Ile Ser Gly Ala Ser Phe Val Thr

325 330 335

Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu

340 345 350

Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gln Val Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr

355 360 365

Asp Phe Glu Lys Val Gly Tyr Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr

370 375 380

Ile Lys Val Val Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gln Val Asp Val

385 390 395 400

Val Ser Asp Gly Ser Leu Ser Gln Pro Gly Ser Ser Pro

405 410

<210> 20

<211> 177

<212> PRT

<213> 橙色嗜热子囊菌

<400> 20

Thr Arg Ile Ser Ser Cys Ser Gly Ser Arg Gln Ser Ala Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ala Leu Arg Asn Ala Ala Ser Leu Ala Asn Ala Ala Ala Asp Ala Ala

20 25 30

Gln Ser Gly Ser Ala Ser Lys Phe Ser Glu Tyr Phe Lys Thr Thr Ser

35 40 45

Ser Ser Thr Arg Gln Thr Val Ala Ala Arg Leu Arg Ala Val Ala Arg

50 55 60

Glu Ala Ser Ser Ser Ser Ser Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Cys Asp Asp

65 70 75 80

Pro Tyr Gly Tyr Cys Ser Ser Asn Val Leu Ala Tyr Thr Leu Pro Ser

85 90 95

Tyr Asn Ile Ile Ala Asn Cys Asp Ile Phe Tyr Thr Tyr Leu Pro Ala

100 105 110

Leu Thr Ser Thr Cys His Ala Gln Asp Gln Ala Thr Thr Ala Leu His

115 120 125

Glu Phe Thr His Ala Pro Gly Val Tyr Ser Pro Gly Thr Asp Asp Leu

130 135 140

Ala Tyr Gly Tyr Gln Ala Ala Met Gly Leu Ser Ser Ser Gln Ala Val

145 150 155 160

Met Asn Ala Asp Thr Tyr Ala Leu Tyr Ala Asn Ala Ile Tyr Leu Gly

165 170 175

Cys

<210> 21

<211> 595

<212> PRT

<213> 草酸青霉菌

<400> 21

Arg Pro Asp Pro Lys Gly Gly Asn Leu Thr Pro Phe Ile His Lys Glu

1 5 10 15

Gly Glu Arg Ser Leu Gln Gly Ile Leu Asp Asn Leu Gly Gly Arg Gly

20 25 30

Lys Lys Thr Pro Gly Thr Ala Ala Gly Leu Phe Ile Ala Ser Pro Asn

35 40 45

Thr Glu Asn Pro Asn Tyr Tyr Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ala Leu

50 55 60

Thr Ala Lys Cys Leu Ile Asp Leu Phe Glu Asp Ser Arg Ala Lys Phe

65 70 75 80

Pro Ile Asp Arg Lys Tyr Leu Glu Thr Gly Ile Arg Asp Tyr Lys Ser

85 90 95

Ser Gln Ala Ile Leu Gln Ser Val Ser Asn Pro Ser Gly Thr Leu Lys

100 105 110

Asp Gly Ser Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Glu Ile Asp Leu Asn Pro

115 120 125

Phe Ser Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg

130 135 140

Ala Thr Ala Met Ile Thr Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Ser His Gly Gln

145 150 155 160

Lys Ser Asp Val Ser Gln Val Met Trp Pro Ile Ile Ala Asn Asp Leu

165 170 175

Ala Tyr Val Gly Gln Tyr Trp Asn Asn Thr Gly Phe Asp Leu Trp Glu

180 185 190

Glu Val Asp Gly Ser Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala

195 200 205

Leu Val Glu Gly Ser Gln Leu Ala Lys Lys Leu Gly Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Ala Cys Asp Ser Gln Pro Pro Gln Ile Leu Cys Phe Leu Gln Ser Phe

225 230 235 240

Trp Asn Gly Lys Tyr Ile Thr Ser Asn Ile Asn Thr Gln Ala Ser Arg

245 250 255

Ser Gly Ile Asp Leu Asp Ser Val Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp

260 265 270

Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp Ala Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg

275 280 285

Ala Leu Ala Asn His Lys Val Tyr Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr

290 295 300

Lys Ile Asn Ala Gly Leu Ala Glu Gly Ser Ala Ala Asn Val Gly Arg

305 310 315 320

Tyr Pro Glu Asp Val Tyr Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr

325 330 335

Leu Gly Ala Ser Glu Leu Leu Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Arg

340 345 350

Leu Gly Lys Leu Glu Val Ser Glu Thr Ser Leu Ser Phe Phe Lys Asp

355 360 365

Phe Asp Ala Thr Val Lys Ile Gly Ser Tyr Ser Arg Asn Ser Lys Thr

370 375 380

Tyr Lys Lys Leu Thr Gln Ser Ile Lys Ser Tyr Ala Asp Gly Phe Ile

385 390 395 400

Gln Leu Val Gln Gln Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Ser Leu Ala Glu Gln

405 410 415

Tyr Asp Arg Asn Thr Ala Ala Pro Leu Ser Ala Asn Asp Leu Thr Trp

420 425 430

Ser Phe Ala Ser Phe Leu Thr Ala Thr Gln Arg Arg Asp Ala Val Val

435 440 445

Pro Pro Ser Trp Gly Ala Lys Ser Ala Asn Lys Val Pro Thr Thr Cys

450 455 460

Ser Ala Ser Pro Val Val Gly Thr Tyr Lys Ala Pro Thr Ala Thr Phe

465 470 475 480

Ser Ser Lys Thr Lys Cys Val Pro Ala Lys Asp Ile Val Pro Ile Thr

485 490 495

Phe Tyr Leu Ile Glu Asn Thr Tyr Tyr Gly Glu Asn Val Phe Met Ser

500 505 510

Gly Asn Ile Thr Ala Leu Gly Asn Trp Asp Ala Lys Lys Gly Phe Pro

515 520 525

Leu Thr Ala Asn Leu Tyr Thr Gln Asp Gln Asn Leu Trp Phe Ala Ser

530 535 540

Val Glu Phe Ile Pro Ala Gly Thr Pro Phe Glu Tyr Lys Tyr Tyr Lys

545 550 555 560

Val Glu Pro Asn Gly Asp Ile Thr Trp Glu Lys Gly Pro Asn Arg Val

565 570 575

Phe Val Ala Pro Thr Gly Cys Pro Val Gln Pro His Ser Asn Asp Val

580 585 590

Trp Gln Phe

595

<210> 22

<211> 598

<212> PRT

<213> 埃默森篮状菌

<400> 22

Arg Ala Pro Val Ala Ala Arg Ala Thr Gly Ser Leu Asp Ser Phe Leu

1 5 10 15

Ala Thr Glu Thr Pro Ile Ala Leu Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly

20 25 30

Pro Asn Gly Ala Asp Val Ala Gly Ala Ser Ala Gly Ile Val Val Ala

35 40 45

Ser Pro Ser Arg Ser Asp Pro Asn Tyr Phe Tyr Ser Trp Thr Arg Asp

50 55 60

Ala Ala Leu Thr Ala Lys Tyr Leu Val Asp Ala Phe Ile Ala Gly Asn

65 70 75 80

Lys Asp Leu Glu Gln Thr Ile Gln Gln Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Lys

85 90 95

Val Gln Thr Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Thr Gly Gly Leu

100 105 110

Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asn Glu Thr Ala Phe Thr Gly Pro Trp

115 120 125

Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile

130 135 140

Ala Tyr Ala Asn Tyr Leu Ile Asp Asn Gly Glu Ala Ser Thr Ala Asp

145 150 155 160

Glu Ile Ile Trp Pro Ile Val Gln Asn Asp Leu Ser Tyr Ile Thr Gln

165 170 175

Tyr Trp Asn Ser Ser Thr Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Glu Gly Ser

180 185 190

Ser Phe Phe Thr Thr Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Asn

195 200 205

Ala Leu Ala Thr Arg Leu Asn His Thr Cys Ser Asn Cys Val Ser Gln

210 215 220

Ala Pro Gln Val Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Thr Gly Ser Tyr

225 230 235 240

Val Leu Ala Asn Phe Gly Gly Ser Gly Arg Ser Gly Lys Asp Val Asn

245 250 255

Ser Ile Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Gly Gly Cys Asp

260 265 270

Asp Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Ala Arg Ala Leu Ala Asn His Lys

275 280 285

Val Val Thr Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Ala Ile Asn Ser Gly Ile

290 295 300

Ala Glu Gly Ser Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Val Tyr

305 310 315 320

Gln Gly Gly Asn Pro Trp Tyr Leu Ala Thr Ala Ala Ala Ala Glu Gln

325 330 335

Leu Tyr Asp Ala Ile Tyr Gln Trp Lys Lys Ile Gly Ser Ile Ser Ile

340 345 350

Thr Asp Val Ser Leu Pro Phe Phe Gln Asp Ile Tyr Pro Ser Ala Ala

355 360 365

Val Gly Thr Tyr Asn Ser Gly Ser Thr Thr Phe Asn Asp Ile Ile Ser

370 375 380

Ala Val Gln Thr Tyr Gly Asp Gly Tyr Leu Ser Ile Val Glu Lys Tyr

385 390 395 400

Thr Pro Ser Asp Gly Ser Leu Thr Glu Gln Phe Ser Arg Thr Asp Gly

405 410 415

Thr Pro Leu Ser Ala Ser Ala Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Leu Leu

420 425 430

Thr Ala Ser Ala Arg Arg Gln Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu

435 440 445

Ser Ser Ala Ser Ser Val Pro Ala Val Cys Ser Ala Thr Ser Ala Thr

450 455 460

Gly Pro Tyr Ser Thr Ala Thr Asn Thr Val Trp Pro Ser Ser Gly Ser

465 470 475 480

Gly Ser Ser Thr Thr Thr Ser Ser Ala Pro Cys Thr Thr Pro Thr Ser

485 490 495

Val Ala Val Thr Phe Asp Glu Ile Val Ser Thr Ser Tyr Gly Glu Thr

500 505 510

Ile Tyr Leu Ala Gly Ser Ile Pro Glu Leu Gly Asn Trp Ser Thr Ala

515 520 525

Ser Ala Ile Pro Leu Arg Ala Asp Ala Tyr Thr Asn Ser Asn Pro Leu

530 535 540

Trp Tyr Val Thr Val Asn Leu Pro Pro Gly Thr Ser Phe Glu Tyr Lys

545 550 555 560

Phe Phe Lys Asn Gln Thr Asp Gly Thr Ile Val Trp Glu Asp Asp Pro

565 570 575

Asn Arg Ser Tyr Thr Val Pro Ala Tyr Cys Gly Gln Thr Thr Ala Ile

580 585 590

Leu Asp Asp Ser Trp Gln

595

<210> 23

<211> 555

<212> PRT

<213> 血红密孔菌

<400> 23

Gln Ser Ser Ala Val Asp Ala Tyr Val Ala Ser Glu Ser Pro Ile Ala

1 5 10 15

Lys Gln Gly Val Leu Asn Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala His

20 25 30

Gly Ala Lys Ala Gly Ile Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Glu Asn Pro

35 40 45

Asp Tyr Leu Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Leu

50 55 60

Leu Ile Asp Gln Phe Thr Ser Gly Asp Asp Thr Ser Leu Arg Gly Leu

65 70 75 80

Ile Asp Asp Phe Thr Ser Ala Glu Ala Ile Leu Gln Gln Val Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Val Ser Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Ile Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ser Ile Ile Arg Tyr Ala Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Asp Asn Gly Asn Thr Thr Tyr Val Ser Asn Thr Leu Trp Pro Val

145 150 155 160

Ile Gln Leu Asp Leu Asp Tyr Val Ala Asp Asn Trp Asn Gln Ser Thr

165 170 175

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Thr Phe Ala Ser Arg Ile

195 200 205

Gly Gln Ser Ser Val Val Ser Gly Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Val Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ser Asn Thr Val Leu

245 250 255

Thr Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Ala Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ala Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Ile Asn Asn Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Met Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Ser Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Tyr Val Trp Asp Gln Leu Gly Gly Leu Asn Val Thr Ser Thr

340 345 350

Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Ser Thr Gly Thr

355 360 365

Tyr Ser Ala Ser Ser Ser Thr Tyr Ala Thr Leu Thr Ser Ala Ile Arg

370 375 380

Ser Phe Ala Asp Gly Phe Leu Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ala

385 390 395 400

Asp Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Arg Asn Asp Gly Thr Pro Leu

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Ala Ala Arg Glu Gly Lys Thr Tyr Gly Ser Trp Gly Ala Ala Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Ala Ser Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ala Thr Val Ala Val

450 455 460

Thr Phe Asn Val Gln Ala Thr Thr Val Phe Gly Glu Asn Ile Tyr Ile

465 470 475 480

Thr Gly Ser Val Ala Ala Leu Gln Asn Trp Ser Pro Asp Asn Ala Leu

485 490 495

Ile Leu Ser Ala Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn Leu

500 505 510

Pro Ala Asn Thr Val Val Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Phe Asn Gly

515 520 525

Gln Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Gln Ile Thr Thr Pro Ser

530 535 540

Gly Gly Ser Phe Thr Gln Asn Asp Val Trp Arg

545 550 555

<210> 24

<211> 556

<212> PRT

<213> 篱边黏褶菌

<400> 24

Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Ser Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Ser Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Thr Ser Asp Pro Asp Tyr

35 40 45

Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Thr Leu

65 70 75 80

Ile Asp Asp Phe Val Thr Ala Glu Ala Asn Leu Gln Gln Val Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ser Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Thr Ser Tyr Val Thr Ser Asn Leu Trp Pro Ile

145 150 155 160

Ile Gln Asn Asp Leu Gly Tyr Val Val Ser Tyr Trp Asn Gln Ser Thr

165 170 175

Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asp Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Ala Ile

195 200 205

Gly Gln Thr Ser Gln Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Asp Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Ser Gly Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Ala Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Val Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Asn Val Trp Glu Ser Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr Ser Thr

340 345 350

Ser Leu Ala Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Gly Val Thr Ala Gly Thr

355 360 365

Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys

370 375 380

Asn Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Lys Tyr Thr Pro Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Tyr Ser Lys Ser Asp Gly Ser Pro Leu

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Ala Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Ser Ser Cys Ser Gly Asn Ser Gly Gly Pro Thr Val Ala

450 455 460

Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Glu Thr Val Trp Gly Glu Asn Ile Tyr

465 470 475 480

Leu Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Glu Asn Trp Ser Ala Asp Asn Ala

485 490 495

Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile Thr Val Asn

500 505 510

Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Glu Tyr Lys Tyr Ile Arg Lys Asn Asn

515 520 525

Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile Thr Thr Pro

530 535 540

Ala Ser Gly Ser Thr Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

545 550 555

<210> 25

<211> 559

<212> PRT

<213> 密粘褶菌

<400> 25

Gln Ser Val Asp Ser Tyr Val Gly Ser Glu Gly Pro Ile Ala Lys Ala

1 5 10 15

Gly Val Leu Ala Asn Ile Gly Pro Asn Gly Ser Lys Ala Ser Gly Ala

20 25 30

Ala Ala Gly Val Val Val Ala Ser Pro Ser Lys Ser Asp Pro Asp Tyr

35 40 45

Trp Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser Ser Leu Val Phe Lys Ser Leu Ile

50 55 60

Asp Gln Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Ser Thr Ser Ser Leu Arg Ser Leu

65 70 75 80

Ile Asp Ser Phe Val Ile Ala Glu Ala Asn Ile Gln Gln Val Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Gly Thr Leu Thr Thr Gly Gly Leu Gly Glu Pro Lys Phe Asn

100 105 110

Val Asp Glu Thr Ala Phe Thr Gly Ala Trp Gly Arg Pro Gln Arg Asp

115 120 125

Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Leu Ile Thr Tyr Gly Asn Trp Leu

130 135 140

Leu Ser Asn Gly Asn Thr Thr Trp Val Thr Ser Thr Leu Trp Pro Ile

145 150 155 160

Ile Gln Asn Asp Leu Asn Tyr Val Val Gln Tyr Trp Asn Gln Thr Thr

165 170 175

Phe Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Ser Ser Ser Phe Phe Thr Thr Ala

180 185 190

Val Gln His Arg Ala Leu Arg Glu Gly Ala Ala Phe Ala Thr Lys Ile

195 200 205

Gly Gln Thr Ser Ser Val Ser Ser Tyr Thr Thr Gln Ala Ala Asn Leu

210 215 220

Leu Cys Phe Leu Gln Ser Tyr Trp Asn Pro Thr Ser Gly Tyr Ile Thr

225 230 235 240

Ala Asn Thr Gly Gly Gly Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Ala Ser Ile His Thr Tyr Asp Pro Ser Ala Gly Cys Asp Ala Thr Thr

260 265 270

Phe Gln Pro Cys Ser Asp Lys Ala Leu Ser Asn Leu Lys Val Tyr Val

275 280 285

Asp Ser Phe Arg Ser Val Tyr Ser Ile Asn Ser Gly Ile Ala Ser Asn

290 295 300

Ala Ala Val Ala Thr Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Ser Tyr Gln Gly Gly

305 310 315 320

Asn Pro Trp Tyr Leu Thr Thr Phe Ala Val Ala Glu Gln Leu Tyr Asp

325 330 335

Ala Leu Asn Val Trp Ala Ala Gln Gly Ser Leu Asn Val Thr Ser Ile

340 345 350

Ser Leu Pro Phe Phe Gln Gln Phe Ser Ser Ser Val Thr Ala Gly Thr

355 360 365

Tyr Ala Ser Ser Ser Thr Thr Tyr Thr Thr Leu Thr Ser Ala Ile Lys

370 375 380

Ser Phe Ala Asp Gly Phe Val Ala Ile Asn Ala Gln Tyr Thr Pro Ser

385 390 395 400

Asn Gly Gly Leu Ala Glu Gln Phe Ser Arg Ser Asn Gly Ala Pro Val

405 410 415

Ser Ala Val Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ser Ala Leu Thr Ala Phe

420 425 430

Glu Ala Arg Asn Asn Thr Gln Phe Ala Gly Trp Gly Ala Val Gly Leu

435 440 445

Thr Val Pro Thr Ser Cys Ser Ser Asn Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Thr Val Ala Val Thr Phe Asn Val Asn Ala Gln Thr Val Trp Gly Glu

465 470 475 480

Asn Ile Tyr Ile Thr Gly Ser Val Asp Ala Leu Ser Asn Trp Ser Pro

485 490 495

Asp Asn Ala Leu Leu Leu Ser Ser Ala Asn Tyr Pro Thr Trp Ser Ile

500 505 510

Thr Val Asn Leu Pro Ala Ser Thr Ala Ile Gln Tyr Lys Tyr Ile Arg

515 520 525

Lys Asn Asn Gly Ala Val Thr Trp Glu Ser Asp Pro Asn Asn Ser Ile

530 535 540

Thr Thr Pro Ala Ser Gly Ser Val Thr Glu Asn Asp Thr Trp Arg

545 550 555

<210> 26

<211> 583

<212> PRT

<213> 人工的

<220>

<223> 具有来自黑曲霉葡糖淀粉酶的接头和淀粉结合结构域的微小根毛霉α-淀粉酶核心

<400> 26

Ala Thr Ser Asp Asp Trp Lys Gly Lys Ala Ile Tyr Gln Leu Leu Thr

1 5 10 15

Asp Arg Phe Gly Arg Ala Asp Asp Ser Thr Ser Asn Cys Ser Asn Leu

20 25 30

Ser Asn Tyr Cys Gly Gly Thr Tyr Glu Gly Ile Thr Lys His Leu Asp

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Tyr Ile Ser Gly Met Gly Phe Asp Ala Ile Trp Ile Ser Pro Ile Pro

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Lys Asn Ser Asp Gly Gly Tyr His Gly Tyr Trp Ala Thr Asp Phe Tyr

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Gln Leu Asn Ser Asn Phe Gly Asp Glu Ser Gln Leu Lys Ala Leu Ile

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Gln Ala Ala His Glu Arg Asp Met Tyr Val Met Leu Asp Val Val Ala

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Thr Glu Asn Ser Asp Asn Val Ala Ile Leu Asn Asp Ile Val Ser Gly

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His Ile Arg Lys Asp Phe Trp Thr Gly Tyr Ala Glu Ala Ala Gly Val

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<210> 27

<211> 484

<212> PRT

<213> 嗜热脂肪芽孢杆菌

<400> 27

Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu

1 5 10 15

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Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys

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