一种改善NAFLD组织病变的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白及其应用
阅读说明：本技术 一种改善NAFLD组织病变的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白及其应用 (Bacillus licheniformis BL3Sir 2-like protein for improving NAFLD (non-alcoholic fatty acid) tissue lesion and application thereof ) 是由 孙晗笑 徐臻睿 利时雨 于 2018-06-19 设计创作，主要内容包括：一种改善NAFLD组织病变的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白及其应用。本发明公开了一种具有显著改善非酒精性脂肪性肝病组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白及其应用,属于生物技术领域。本发明具有显著改善NAFLD组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白是从<I>Baclicuslicheniformis</I> BL3菌株中分离制备而得,所述菌株由本实验室筛选所得。本发明具有显著改善NAFLD组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白经基因克隆于大肠杆菌表达纯化制备,实验结果表明其可以通过调节肝细胞脂代谢相关基因并影响PPAR-γ和PGC-1α通路,调控与脂代谢、氧化应激和胰岛素抵抗等过程相关的蛋白水平,从而减轻肝组织内的脂质蓄积,改善NAFLD大鼠的代谢异常,为益生菌Sir2样蛋白用于预防和治疗NAFLD提供一种新的治疗策略,以用于NAFLD防治药物或食品中的应用。(Bacillus licheniformis BL3Sir 2-like protein for improving NAFLD tissue lesion and application thereof. The invention discloses a bacillus licheniformis BL3Sir 2-like protein capable of remarkably improving non-alcoholic fatty liver disease tissue lesion and inhibiting lipid droplet formation and application thereof, belonging to the technical field of biology. The bacillus licheniformis BL3Sir 2-like protein for obviously improving NAFLD tissue lesion and inhibiting lipid droplet formation is prepared from Baclicuslicheniformis BL3 strain, which was screened in this laboratory. The invention can obviously improve NAFLD tissue lesionThe bacillus licheniformis BL3Sir 2-like protein for inhibiting lipid droplet formation is prepared by gene cloning in escherichia coli expression and purification, and experimental results show that the protein can regulate the protein level related to processes such as lipid metabolism, oxidative stress, insulin resistance and the like by regulating related genes of hepatocyte lipid metabolism and influencing PPAR-gamma and PGC-1 alpha pathways, thereby relieving lipid accumulation in liver tissues, improving the metabolic abnormality of NAFLD rats, and providing a new treatment strategy for the probiotic Sir 2-like protein for preventing and treating NAFLD, so as to be applied to NAFLD prevention and treatment medicines or foods.)
技术领域
本发明属益生菌Sir2蛋白治疗疾病的新机制领域，更具体地说，本发明涉及一种具有显著改善非酒精性脂肪性肝病组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白及其应用。
背景技术
Sir2（Silence information regulator）蛋白主要位于细胞的核仁内，是一类高度保守的NAD+依赖性蛋白脱乙酰酶，存在于细菌和哺乳动物体内。Sir2蛋白与NAD+相互影响，一方面，Sir2蛋白功能的调节受NAD+合成途径和补救途径的影响，尤其Sir2蛋白的去乙酰化作用需要NAD+作为辅助因子；另一方面，NAD+补救途径的烟碱、烟酸等中间产物与NADH以及一些NAD+代谢物也可调节Sir2蛋白的活性。目前大量的研究已经表明哺乳动物Sirtuin蛋白家族参与调节细胞代谢，并且有助于延缓，甚至阻止代谢相关疾病。
相关研究表明，Sirtuins广泛参与调节机体能量代谢调节，保持机体糖脂代谢稳态，其中以SIRT1、SIRT3、SIRT6研究的最为广泛。SIRT1作为家族中研究最多的一个成员，当前的研究已表明其不仅可调控组蛋白的去乙酰化作用，且对非组蛋白有很好的调节作用。有研究表明，通过调节SIRT1-SIRT3-线粒体的途径实现SIRT1改善线粒体功能障碍的作用，当过表达SIRT1时改善高糖诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗。而在肌肉中，SIRT1能够通过去乙酰化PGC1-α来增强线粒体中的脂肪酸氧化。另外，SIRT3是一种最主要的线粒体去乙酰化酶，它的很多靶蛋白已被确定，其中有许多参与调节重要的代谢平衡。如SIRT3去乙酰化而激活参与三羧酸循环的异柠檬酸脱氢酶2；SIRT3也激活三羧酸循环中的谷氨酸脱氢酶，尽管谷氨酸脱氢酶脱乙酰的生理意义尚不清楚。而且，SIRT3去乙酰化复合体I、II、III均能参与氧化磷酸化，即线粒体有氧呼吸的最后阶段。而在HEK293T细胞内过表达线粒体Sirtuin蛋白则改变糖酵解和线粒体功能。其次，SIRT6参与基因组DNA的稳定和修复代谢和衰老的作用。已有研究表示SIRT6 缺失会引起小鼠低血糖症状，而SIRT6缺失的细胞中葡萄糖摄取增加，糖酵解增强而引发线粒体呼吸功能减弱。因此，Sirtuin蛋白与细胞能量、脂质代谢密切相关，且在一定程度上充当着糖酵解到氧化代谢的开关。
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是最常见的慢性肝脏疾病之一，发病率正逐年上升，目前全世界已经有约10亿人受到影响，无特效的药物及治疗方法。虽然众多科学家已对NAFLD进行了大量研究，但目前仍不清楚NAFLD的发病机制，其原因相当复杂，且受多种因素的调控，如胰岛素抵抗、氧化应激和脂肪细胞能量代谢紊乱等。因此，通过改善肝细胞能量代谢紊乱、抗氧化应激和抑制胰岛素抵抗等，以从源头上降低NAFLD发病率的治疗手段已成为现阶段的研究重点。已有大量文献报道了Sir2类去乙酰化酶蛋白在缓解和治疗NAFLD等代谢性疾病的进展中起关键作用，这些研究则主要集中在前文提及的SIRT1、SIRT3和SIRT6中。
越来越多的研究表示益生菌可以改善代谢等疾病。益生菌中具有Sir2同源蛋白，但关于Sir2蛋白在益生菌中的生物学功能少有报道。近年来发现肠道菌群的变化与NAFLD的发生有着极为重要的关联性，研究表明，益生菌与胃肠道感染、细菌移位、胆固醇代谢等有着直接联系。地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）是一种革兰氏阳性（G+）、兼性厌氧、孢子形成的益生菌，俗称整肠生，是一种存在多种特殊功能的菌株，能产生多种酶及蛋白等物质，在畜牧业、农业、医药、食品等方面均有极为广泛的研究价值。地衣芽孢杆菌以活菌制剂对疾病发挥着防治作用，且对生物体自身无任何伤害。因此可利用其对人体无害，甚至还促进人体中外来细菌或过盛细菌的拮抗作用，通过细菌对细菌的抑制作用和生物拮抗作用达到预防和控制的目的并提高健康水平。因为地衣芽孢杆菌是一种兼性厌氧菌，可以发挥生物夺氧的作用，使益生菌得到更好的生长环境，维持肠道中的生态平衡。
目前的研究已经表明哺乳动物Sirtuin蛋白家族可以调节细胞代谢，包括细胞呼吸、脂肪酸代谢等。Sirtuins正常活性的维持有助于延缓，甚至阻止代谢相关疾病的发生。以往对于哺乳动物Sirtuin蛋白家族的研究，表明其广泛参与糖脂代谢的调控及维持能量代谢平衡，并且有望成为代谢疾病的靶点。但就目前的研究来说，有关益生菌Sir2同源蛋白生物学功能却少有报道，都还处于起始阶段，尤其是在代谢方面的调控功能更是研究甚少。而研究发现的以代谢紊乱等为诱发原因的NAFLD，到目前为止仍无特效药物与治疗策略。本研究中益生菌地衣芽孢杆菌中也含有sir2的同源基因，具有Sir2样蛋白，虽已发现哺乳动物Sirtuin家族的SIRT1、SIRT3和SIRT6均能改善NAFLD，但原核生物Sir2蛋白对NAFLD的调控作用还未见报道，也没有关于地衣芽孢杆菌BL3Sir2蛋白在细胞内对脂质代谢影响的相关研究，因此，这些都是值得深入研究的。
发明内容
本发明筛选出显著改善非酒精性脂肪性肝病组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白并研究其治疗作用机制，使其在疾病治疗中发挥作用。
本发明构建大鼠模型的方法，是采用高脂饲料结合四氯化碳注射的方法诱导大鼠产生非酒精性脂肪性肝病，并使用已纯化的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白进行干预治疗。
本发明通过用地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白对大鼠模型进行干预治疗，研究BL3Sir2样蛋白对脂肪肝大鼠肝组织形态、病理变化、血清肝功能指标、肝细胞脂代谢相关基因表达、PPAR-γ和PGC-1α及其下游靶基因表达的影响。
本发明提供的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白能明显改善NAFLD组织病变，抑制脂滴形成，减少血清中丙氨酸转氨酶、天冬氨酸转氨酶、胆固醇、甘油三酯的含量，从而保护NAFLD大鼠的肝功能。
本发明提供的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白可通过调节肝细胞脂代谢相关基因并影响PPAR-γ和PGC-1α通路，调控与脂代谢、氧化应激和胰岛素抵抗等过程相关的蛋白水平，从而减轻肝组织内的脂质蓄积，改善NAFLD大鼠的代谢异常。
本发明提供了一种具有显著改善非酒精性脂肪性肝病组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白可用于制备治疗非酒精性脂肪型肝病、脂代谢紊乱或代谢综合征的药物。
相对于现有技术，本发明经实验发现，具有显著改善非酒精性脂肪性肝病组织病变并抑制脂滴形成的地衣芽孢杆菌BL3 Sir2样蛋白可以保护NAFLD大鼠肝功能，通过调节肝细胞脂代谢相关基因并影响PPAR-γ和PGC-1α通路，调控与脂代谢、氧化应激和胰岛素抵抗等过程相关的蛋白水平，从而减轻肝组织内的脂质蓄积，改善NAFLD大鼠的代谢异常，为益生菌Sir2蛋白用于预防和治疗NAFLD提供一种新的治疗策略，以用于NAFLD防治药物或食品中的应用。
附图说明
图1为实施例1 NAFLD大鼠不同处理下的肝脏形态图。
图2为实施例1 NAFLD大鼠不同处理下的肝组织病理学HE染色（100倍）。
图3为实施例1 NAFLD大鼠血清中ALT和AST水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
图4为实施例1 NAFLD大鼠血清中TC和TG水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
图5为实施例1 NAFLD大鼠肝细胞脂代谢调节相关基因mRNA表达水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
图6为实施例1 Western blot检测NAFLD大鼠肝细胞脂代谢调节相关蛋白表达图。
图7为实施例1 NAFLD大鼠肝细胞脂代谢调节相关蛋白表达水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
图8为实施例1 PPAR-γ和PGC-1α及其下游基因mRNA水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
图9为实施例1 Western blot检测PPAR-γ和PGC-1α及其下游蛋白表达图。
图10为实施例1 PPAR-γ和PGC-1α及其下游蛋白水平，其中图示数值为均值±标准误；与模型组相比，*p < 0.05和**p < 0.01；n=8。
具体实施方式
以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例1 地衣芽孢杆菌Bli-Sir2蛋白对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝组织的影响
1. 实验方法材料
1.1实验动物
SPF级SD大鼠90只，雄性，2月龄，体重（20 ± 2）g，由广东省医学实验动物中心提供，实验SD大鼠饲养于广东药科大学SPF级动物实验中心。
1.2动物分组
当SD大鼠达到2月龄，体重达到约（20±2）g，将所有的SD大鼠随机分为3组：空白对照组（野生型大鼠）、模型组（NAFLD大鼠不处理）、实验组（NAFLD大鼠用Bli-Sir2蛋白处理），每组30只。
1.3 非酒精型脂肪肝大鼠模型的建立及评估
1.3.1大鼠模型的建立
所有的实验大鼠分成9笼，每笼10只，3笼一组。所有的雄性动物大鼠饲养在SPF级实验室，保持温度在25 ± 3℃，相对湿度50% ~ 70%，每日光照14 h。对照组：按照常规方法喂养；模型组和实验组：复合高脂饲料（普通饲料中加入10%猪油，2%胆固醇，0.5%胆酸钠和0.2%丙基硫氧嘧啶）喂养，并且从第2周开始，腹腔注射0.01 mL/g的CCl4食用油，一周注射两次。保持良好通风，每天对鼠笼进行清洁处理，避免不良因素的影响，适应性饲养一周后开始造模。
1.3.2模型的评估
饲养8周后，对大鼠分别称重，将模型组和实验组中体重无明显增长，或低于对照组的大鼠剔除；同时采血分别检测大鼠的血脂指标，将模型组和实验组中血脂指标无明显增长，或与对照组无明显差异的大鼠剔除。
1.3.3给药
从造模的第9周起开始给药，通过尾静脉注射纯化的Bli-Sir2蛋白，剂量为10 mg/kg。对照组和模型组注射等体积生理盐水，给药时间共20天。
1.3.4生化指标测定
给药结束后，第二天对大鼠空腹取血，制备血清，使用生化分析仪检测丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）等生化指标变化。
1.3.5标本的获取和处理
通过腹腔注射10%的水合氯醛，对大鼠进行麻醉，之后切开腹部，小心拨开肠管显露门静脉和下腔静脉，向肝内灌注1×PBS，同时剪断门静脉，等到肝脏由红色转变为淡黄色，且门静脉流出清澈液体时，停止灌注，此时取出完整肝脏。观察肝脏的形状、大小、颜色。
1.3.6肝组织蛋白样品制备
（1）剪下约0.1 g肝脏组织，在液氮中研磨碎；
（2）加入适量蛋白裂解液使蛋白充***解，沸水加热15 min，使溶液澄清；
（3）将煮好的蛋白样品移入干净EP管中，室温下12000 rpm离心10 min；
（4）分装标记好，- 80℃冷冻保存。
1.3.7肝组织总RNA的制备
（1）剪下0.1 g肝组织，加入含500 μL RNA裂解液EP管中，置于冰上；
（2）匀浆器粉碎组织，然后于4℃下12000 rpm离心5 min，取上清；
（3）将上清液加入另一干净的EP管内，再向其中加入适量无水乙醇，充分吹打混匀，混合物于4℃下12000 rpm离心1 min，收集沉淀；
（4）向沉淀中加入600 μL RNA洗液，于4℃下12000 rpm离心45 s；
（5）向上步得到的沉淀物中加入50 μL DNA酶I孵育液，室温静置15 min；
（6）再加入600 μL RNA洗液，于4℃下12000 rpm离心45 s，弃去滤液；
（7）重复上述步骤一次，在离心柱中加入100 μL无核酸酶的纯净水，室温放置2 min后，于4℃下12000 rpm离心1 min，- 80℃冷冻保存。
1.3.8 肝组织石蜡切片制备
（1）剩下的肝脏组织放入4%多聚甲醛液中固定过夜；
（2）按85%、90%、95%和100%的乙醇梯度进行组织脱水，然后在二甲苯中浸泡约30 min，58 ℃下充分浸蜡，再放入模具中进行包埋；
（3）当蜡块自然冷却后，放入4℃冰箱冷缩；
（4）将蜡块从模具中取出，组织切割成约24 × 24 × 2 mm大小；
（5）向组织支承器的底部滴上包埋剂OCT，然后迅速放入冷冻台上，等到包埋剂快凝固时，将组织放上去，并滴入包埋剂直到组织完全包埋；
（6）把蜡带放在漂片槽内水面上，当其完全铺开时，用载玻片捞片；
（7）40℃下烤片8 h以上，烘烤结束后将切片室温保存即可。
1.4苏木精-伊红染色
（1）将制备的肝组织石蜡切片在60℃烘箱中熔蜡30 min；
（2）在二甲苯中浸泡15 min透明，再用100%、95%、90%和85%的乙醇按梯度水化，每个梯度浸泡5 min；
（3）纯水冲洗5 min后，用苏木素染色2 min；
（4）纯水洗去多余的苏木素，PBS浸泡2 min；
（5）纯水冲洗5 min后，用伊红染色6 min；
（6）纯水洗去多余的伊红，用酒精按梯度脱色，接着二甲苯中浸泡5 min；
（7）用中性树脂封片，并于光学显微镜下观察。
1.5实时荧光定量PCR
将制备的肝组织总RNA取出，合成cDNA链，qRT-PCR方法检测ACC1、LPL、UCP-1、LDLR、PGC-1α、PPAR-γ、SREBP-1c、FAS、DGAT、CPT-1A、CYP2E1、PEPCK和G-6-Pase的mRNA表达，按照qRT-PCR验证步骤确定每个基因的表达量。
1.6 Western Blot
将制备的肝组织总蛋白取出，随后进行BCA蛋白定量，Western blot电泳检测ACC1、LPL、UCP-1、LDLR、PGC-1α、PPAR-γ、SREBP-1c、FAS、DGAT、CPT-1A、CYP2E1、PEPCK和G-6-Pase的蛋白表达，用Western blot鉴定上述蛋白的表达情况。
1.7统计学分析
使用SPSS18.0软件处理数据，两组比较作t检验，多组均数间比较采用One-way ANOVA分析，显著性差异用p＜0.05或p＜0.01或p＜0.001表示。
2. 实验结果
2.1大鼠肝脏组织形态学的改变
如图1所示，对照组大鼠的肝脏颜色为深红色，边缘锐利，包膜完整，表面光滑，质地柔软。与对照组相比，模型组肝脏肿大，边缘较厚，颜色为褐色，表面能看见明显的脂滴。而注射Bli-Sir2蛋白的实验组大鼠肝脏颜色为深红色，表面未见明显的脂滴，比较接近对照组。
2.2 病理切片观察结果
如图2所示，对照组肝组织中细胞结构正常，无空泡，细胞核位于中央，肝索排列整齐。高脂饲料与四氯化碳诱导的脂肪肝大鼠肝组织有明显的脂肪病变，出现较多的脂肪空泡。与模型组大鼠相比，Bli-Sir2组大鼠肝组织中脂肪空泡明显减少，脂肪病变有所改善，由此可见Bli-Sir2蛋白能够明显抑制NAFLD大鼠的肝脏脂肪变性。
2.3 Bli-Sir2蛋白对大鼠血清生化指标的影响
与我们的预期一致，与对照组相比，模型组大鼠血清的ALT、AST、TC和TG含量均明显升高。当给予Bli-Sir2蛋白后，大鼠血清中ALT、AST、TC和TG的表达水平均显著降低，并具有显著性差异（图3和图4）。
2.4 Bli-Sir2蛋白对大鼠肝细胞脂代谢调节相关基因mRNA和蛋白水平的影响
如图5所示，与对照组相比，模型组大鼠肝细胞脂代谢相关基因ACC1 mRNA的表达显著增加，而UCP-1、LDLR和脂蛋白脂酶LPL的mRNA表达均有不同程度的降低。Bli-Sir2组相比于模型组，其肝组织中ACC1 mRNA的表达减少，但UCP-1、LDLR和LPL mRNA水平有所升高，且都具有显著性差异。
Western blot结果显示，与对照组的正常大鼠相比，模型组ACC1蛋白水平显著增高，而UCP-1、LDLR、LPL蛋白水平均有所降低。如图6和7所示，Bli-Sir2组鼠肝组织中ACC1的蛋白水平显著低于模型组，UCP-1、LDLR的表达显著升高，基本恢复到对照组水平，LPL蛋白也有所增高，虽然相比于UCP-1和LDLR的增长幅度略低，但也具有显著性。这些结果表明Bli-Sir2蛋白能够影响脂代谢相关基因在体内的表达，说明Bli-Sir2蛋白对NAFLD肝组织的脂代谢具有调控作用。
2.5 Bli-Sir2蛋白对PPAR-γ、PGC-1α及其下游基因mRNA和蛋白表达的影响
细胞实验中，我们已经发现Bli-Sir2蛋白可以通过去乙酰化激活PPAR-γ和PGC-1α信号通路及其下游基因，从而改善NAFLD肝细胞中的脂质代谢紊乱和脂肪病变。为了进一步在体内验证Bli-Sir2对PPAR-γ和PGC-1α及其下游靶基因的调控作用，我们对PGC-1α、PPAR-γ、SREBP-1c、FAS、DGAT、CPT-1A、CYP2E1、PEPCK和G-6-Pase分别进行了实时定量PCR和Western blot检测。结果显示（图8、9和10），与对照组相比，模型组SREBP-1c、FAS、DGAT、CYP2E1、PEPCK和G-6-Pase的mRNA及蛋白含量显著升高，而实验组相比于模型组，这些基因的mRNA及蛋白含量显著降低。相反，PPAR-γ、PGC-1α和CPT-1A的mRNA和蛋白含量在模型组下调，而在Bli-Sir2组中上调。这些结果均与体外实验结果一致，说明了Bli-Sir2在体内也能对PPAR-γ和PGC-1α及其下游靶基因的表达进行调节。另外，已知SREBP-1c、FAS和DGAT对脂类的合成具有重要的调控作用，CYP2E1和CPT-1A均参与β-氧化过程，同时PEPCK和G-6-Pase是糖异生关键酶，其下调和胰岛素抵抗的形成密切相关，而这些基因均可被Bli-Sir2蛋白调控说明了Bli-Sir2对NAFLD的治疗涉及了对脂代谢、氧化应激和胰岛素抵抗等各个方面的影响。