阅读说明：本技术 一种用于检测乳腺癌her2拷贝数变异的数字pcr方法及检测试剂盒 (Digital PCR method and detection kit for detecting breast cancer HER2 copy number variation ) 是由 董莲华 王霞 王晶 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测试剂盒,所述试剂盒包括用于检测HER2基因拷贝数变异的至少一对引物及其相配套的一条探针,和用于检测的内参基因的一对引物及其相配套的一条探针。本发明的方法采用三组HER2基因的特异性引物探针和一组内参基因的方式进行,从而有效地排除了单一引物探针扩增导致的假阴性结果,因此相较于现有技术中具有更高的准确性,而且将现有方法的不确定区间1.8-2.2降低至1.0-1.2,具有更高的灵敏度。(The invention discloses a digital PCR method and a detection kit for detecting breast cancer HER2 copy number variation, wherein the kit comprises at least one pair of primers for detecting HER2 gene copy number variation and a probe matched with the primers, and a pair of primers for detecting reference genes and a probe matched with the primers. The method of the invention is carried out by adopting a mode of three groups of specific primer probes of HER2 genes and one group of reference genes, thereby effectively eliminating false negative results caused by single primer probe amplification, having higher accuracy compared with the prior art, reducing the uncertain interval 1.8-2.2 of the prior method to 1.0-1.2 and having higher sensitivity.)

一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测 试剂盒

技术领域

本发明涉及与肿瘤靶向治疗相关的基因检测技术领域，特别是涉及一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测试剂盒。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，每年新增病例100多万例，是一种严重威胁患者的健康甚至生命的疾病。不同患者对临床药物的治疗效果以及预后也可能存在很大不同。

HER2基因是位于人类第17号染色体长臂上的原癌基因，编码具有受体酪氨酸激酶(PTK)活性的人类表皮生长因子受体-2(human epidermaL growth factor receptor-2，HER2)跨膜糖蛋白，是表皮生长因子受体家族的成员，需与家族其他受体结合成异二聚体后发挥信号转导功能。HER2基因的过表达或扩增，会导致信号过度传递，将会刺激癌细胞生长转移。HER-2阳性乳腺癌约占侵袭性乳腺癌的20％～30％，该分型肿瘤的侵袭性高、复发风险高、进展快速及预后差。乳腺癌患者肿瘤细胞中HER2基因表达水平的测定有利于治疗方案的选择和预后判断。HER2分子作为乳腺癌重要的分子生物学标记物之一，是乳腺癌基因治疗的重要靶位点。

曲妥珠单抗，又名赫赛汀(Herceptin)是用于HER2阳性乳腺癌的靶向药物，已被美国FDA批准用于治疗HER2阳性乳腺癌。赫赛汀能特异性的结合在HER-2蛋白细胞膜外的第4个功能域，干扰HER2与其它ERBB家族成员形成异源二聚体，从而有效抑制肿瘤细胞的增殖。

目前，临床常规的HER2检测手段包括免疫组化(IHC)和荧光原位杂交技术(FISH)。IHC检测的是细胞膜上HER2蛋白的表达情况，检测结果为3+，即判定为HER2阳性，可以选择HER2靶向药物进行治疗；检测结果为0或1+，即可判定HER2阴性，不适合使用HER2靶向药物进行治疗；检测结果为2+时，需要结合FISH的结果来进行综合判断。FISH是以17号染色体着丝粒探针作为内参，通过计算HER2基因探针与17号染色体着丝粒探针杂交信号的比率(HER2/CEP17)来判断HER2基因是否有扩增。FISH检测结果大于2.2判定为HER2阳性，检测结果小于的1.8判定为HER2阴性，而检测结果为1.8-2.2之间的则无法准确判定。对于HER2阳性患者，可以使用HER2靶向药物，如赫赛汀等；而HER2阴性患者，则不推荐使用这类药物。

然而目前这两种检测方法都存在自身的不足，都存在结果无法准确判断的灰区，而且近年来也发现即使判定为阳性的患者对HER2靶向治疗的效果不佳，而一些疑似阳性的患者和部分阴性患者也对HER2靶向药物敏感。所以，根据IHC或FISH法检测的结果进行用药指导并不是十分准确，因此需要一种更灵敏更准确的HER2阳性乳腺癌的检测方法，来进行HER2靶向药物的指导，让更多的患者得到准确的治疗。

CN105986028A公开了一种利用ddPCR技术检测乳腺癌HER2阳性的方法，其试剂盒包括用于检测HER2基因的两对引物，和用于检测CEP17基因的一对引物、用于检测EFTUD2基因的2对引物。但是，该专利申请的技术方案只能解决常规方法判断为疑似阳性的样本是否存在HER2阳性，而无法解决常规方法即使判断为阴性而实际为假阴性的样本，这种样本由于发生的是染色体倍增，所以导致常规方法和该专利申请的方法均无法彻底的准确判断HER2阳性。

综上所述，本领域缺乏一种能够准确有效地检测HER2拷贝数变异的方法及试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测试剂盒。本发明采用ddPCR扩增技术，设计特异性的HER2基因拷贝数检测引物和探针，优化稳定表达的内参基因，结合RPPH1作为内参基因，从而对HER2表达状态进行准确检测，能够极大程度地排除假阴性和假阳性的情况，从而能更准确的判断是否为HER2阳性。

(1)本发明设计了三对特异性扩增HER2基因的引物和探针

根据HER2基因的总长度和外显子分布，分别针对7、16、24号外显子的序列，采用PrimerExpress3.0设计了三对特异性引物和探针。并采用Blast进行了比对，发现其结合人源的HER2基因特异性高，无潜在非特异性扩增区。具体的序列见SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:9。

(2)优化了三对HER2基因特异性的引物和探针扩增条件

将HER2的7号和24号外显子的引物的终浓度固定在300nM，探针浓度固定在300nM条件下(如图1和2)，HER2的16号外显子的引物的终浓度固定在300nM，探针浓度固定在400nM条件下进行退火温度优化，退火温度设定了57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃六个退火温度(如图3)。从扩增的一维散点图看，六个退火温度下均得到了较好的扩增，57℃时阳性微滴和阴性微滴两簇微滴分散的最好，但从定量结果的拷贝数浓度看，60℃条件下的拷贝数浓度与内参基因的差距最小，因此确定了60℃为最佳退火温度。然后进行引物和探针浓度优化，HER2的7号和24号外显子的引物浓度分别设定了200nM、300nM、400nM，探针浓度分别设定了200nM、300nM、400nM，HER2的16号外显子的引物浓度分别设定了200nM、300nM、400nM，探针浓度分别设定了200nM、300nM、400nM、500nM进行优化(如图4-6)。

当引物浓度不变时，HER2的7号和24号外显子的探针浓度由200nM增加至400nM，HER2的16号外显子的探针浓度由200nM增加至500nM时，阴性微滴和阳性微滴荧光强度都在增加，而且阴性和阳性微滴的分离程度增加；当HER2的7号、16号和24号外显子的探针浓度不变时，引物从200nM增加到400nM时，阴性微滴的荧光强度基本没有变化，而阳性微滴的荧光强度在增加，所以导致阴性和阳性微滴的分离程度在增加，但随着探针浓度的增加，阳性微滴的分散的范围越来越大，比如探针在300nM时(B02、E04和D07)阳性微滴的分布宽度明显超过了探针在200nM(G01、D04和B07)，结合定量结果的重复性和拷贝数浓度因素综合考虑后确定了HER2的7号、16号和24号外显子的引物浓度在300nM，探针的浓度都为300nM。

最终确定的微滴数字PCR反应的体系为：2×ddPCR mastermix 10μL，双向引物(5μM)1.2μL，探针(10μM)0.6μL，DNA模板4μL，ddH2O补足20μL。PCR反应程序：95℃10min，94℃30s，60℃1min，40cycles，98℃10min。

(3)设计了一对特异性的内参基因RPPH1

根据NCBI数据库检索，发现RPPH1基因为比较稳定的单拷贝基因，因此选择此基因作为内参基因，进行特异性扩增的引物和探针的设计。采用PrimerExpress3.0设计了一对特异性的引物和探针。采用Blast进行了比对，发现其结合人源的RPPH1基因特异性高，无潜在非特异性扩增区。具体的序列见SEQ ID N0:10-SEQ ID N0:12。

(4)优化了RPPH1内参基因的扩增条件

首先进行退火温度的优化，将引物的终浓度固定在250nM，探针浓度固定在100nM条件下，进行退火温度优化，退火温度设定了56℃、58℃、60℃、61℃四个退火温度，从扩增结果(图3)一维散点图看，四个退火温度下均得到了较好的扩增，56℃时阳性微滴和阴性微滴两簇微滴分散的最好，但从定量结果重复性看，60℃条件下的重复性最好，因此确定了60℃为最佳退火温度。然后进行引物和探针浓度优化，引物浓度分别设定了150nM、250nM、350nM，探针浓度分别设定了50nM、100nM、200nM，进行优化(如图4)。

引物浓度不变时，探针浓度由50nM增加至200nM时，阴性微滴和阳性微滴荧光强度都在增加，而且阴性和阳性微滴的分离程度增加，当探针浓度不变时，引物从150nM增加到350nM时，阴性微滴的荧光强度没有变化，而阳性微滴的荧光强度在增加，所以导致阴性和阳性微滴的分离程度在增加，但随着探针浓度的增加，阳性微滴的分散的范围越来越大，比如探针在200nM时(F05、F06和F07)阳性微滴的分布宽度明显超过了探针在100nM(D05、C06和D07)，结合定量结果的重复性因素综合考虑后确定了探针的浓度为100nM，引物浓度在250nM。最终确定的微滴数字PCR反应的体系为：2×ddPCR mastermix 10μL，双向引物(5μM)1μL，探针(10μM)0.2μL DNA模板4μL，ddH2O补足20μL。PCR反应程序：95℃5min，95℃20s，60℃40s，45cycles，98℃10min。

(5)对不同细胞系的HER2基因拷贝数进行了定量

为证明所建HER2基因特异性引物探针可以实现HER2基因拷贝数的准确检测，选择了包括正常人细胞和乳腺癌细胞株共6株，对HER2基因拷贝数进行了测量。测量结果发现正常人细胞DNA中HER2基因拷贝数与内参基因拷贝数比值均小于1.0，而且三对引物探针的测定结果一致。而两株确定为乳腺癌细胞系的HER2基因拷贝数与内参基因拷贝数比值分别为22.4和34.6，因此可以确定这两个细胞为HER2拷贝数变异阳性。

(6)对检测HER2拷贝数变异方法的灵敏度和线性进行了研究

采用正常人基因组DNA和乳腺癌细胞基因组DNA，按照一定的比例混合，配制成4个不同突变水平的DNA样本，采用建立的三对HER2特异性引物和探针进行扩增，同时扩增内参基因RPPH1，对每对HER2特异性基因的引物和探针与内参基因拷贝数比值进行分析，以配制的HER2基因和RPPH1基因拷贝数比值为横坐标，以ddPCR测定的比值为纵坐标，进行线性拟合(如图5-7)。配制值和ddPCR测定结果一致，线性相关系数均大于0.995，表明所建立的ddPCR方法检测HER2基因拷贝数变异准确可靠，最低可检测低至一个拷贝数的变异。

基于此，本发明提供的技术方案具体如下：

一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的检测试剂盒，所述的试剂盒包括：用于检测HER2基因的至少一对引物及其相配套的一条探针，和用于检测单拷贝内参基因RPPH1的一对引物和探针。

所述的试剂盒包括用于检测RPPH1基因的一对引物和一条探针。

所述的试剂盒包括用于检测HER2基因的三对引物和三条探针。

具体的，所述的试剂盒包括：包括用于检测HER2基因拷贝数变异的三对引物H1、H2、H3及其相配套的三条探针，H1的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；H2的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4所示；H3的序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；其探针的序列如SEQ ID NO:7、SEQID NO:8、SEQID NO:9所示。所述的探针为VIC探针或FAM探针。

所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID N0:7或SEQID N0:8或SEQIDN0:9所示；优选地，所述的探针为FAM探针。

所述的用于检测RPPH1基因的引物对P1的序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID N0:11所示。所述的用于检测RPPH1基因的探针的序列如SEQ ID N0:12所示：优选地，所述的探针为VIC探针。

进一步的，所述试剂盒包括:

(a)第一容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对和相应探针；

(b)第二容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对和相应探针；

(c)第三容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含HER2基因的特异引物对和相应探针；

(d)第四容器，以及位于所述容器内的用于特异性扩增含RPPH1基因的特异引物对和相应探针；

(e)使用说明书，其中，所述说明书记载了使用方法。

所述的使用方法包括：

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是肿瘤组织样本；

(2)对所述的检测样本进行DNA提取，从而获得DNA提取物；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴式数字PCR(ddPCR)扩增，从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物；

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因RPPH1的比例；在所述步骤(2)中，对于2ml样本而言，所述DNA提取物为20～100μL的浓度不低于15ng/μL DNA提取液。

在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为30～100ng。

所述的方法是非诊断且非治疗性的。

所述的方法还包括：对HER2基因进行三组扩增，且所述的扩增是用不同的引物和探针对进行的。

所述的方法还包括：对RPPH1基因进行扩增。

一种样本中HER2突变阳性检测方法，所述方法包括；

(1)提供一检测样本，所述的检测样本是肿瘤组织样本或HER2正常表达的细胞和HER2过表达的细胞分别提取基因组DNA后配置的4个水平DNA溶液；

(2)对所述的检测样本进行DNA抽提处理，从而获得DNA抽提物；

(3)以步骤(2)所得到的DNA提取物为模板，进行微滴数字PCR(ddPCR)，从而获得含HER2基因和内参基因的扩增产物；

(4)对所述扩增产物进行分析，从而得出HER2基因和内参基因RPPH1的比例；所述步骤(2)中，10^⁶-10^⁷个细胞检测样本而言，所述DNA抽提物是含有5-30μg的DNA提取液。在步骤(3)中，所述ddPCR扩增所使用的DNA模板量为30～100ng。

所述的方法还包括：对HER2基因进行三组扩增，且所述的扩增是用不同的引物对进行的。所述的方法还包括：对RPPH1基因进行扩增。在ddPCR中，反应体系中还含有用于检测HER2基因和内参基因的探针。所述的探针为FAM探针或VIC探针。所述的用于检测HER2基因的三对引物对的序列如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2，或SEQ ID NO:3和SEQ ID N0:4或SEQ ID NO:5和SEQ ID N0:6所示。所述的用于检测RPPH1基因的引物对的序列如SEQ IDNO:10和SEQ ID N0:11所示。所述的用于检测HER2基因的探针的序列如SEQ ID N0:7或SEQID N0:8或SEQID N0:9所示；优选地，所述的探针为FAM探针。所述的用于检测RPPH1基因的探针的序列如SEQ ID N0:12所示:优选地，所述的探针为VIC探针。

所述的PCR反应的反应体系包括：待测基因组：30～100ng，2X ddPCR SuperMixfor Probes(Bio-Rad Laboratories)10μ1，HER2基因引物上下游1.2μL，探针0.6μL，内参基因引物上下游1μL，探针0.2μL，TE0.1补足至20μL；其中，所述的引物对选自下组：HER2，3引物对H1、H2、H3，内参基因RPPH1引物对P1。

所述步骤(3)中PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存。

所述的步骤(4)包括：分析所述HER2引物对H1，H2，H3，内参基因RPPH1引物对P1扩增产物的拷贝数，并用HER2基因拷贝数去除以内参基因拷贝数，得到三组比值，即H1/P1，H2/P1，H3/P1，若三个比值均小于等于1.0，则判定为Her2阴性，若三个比值中有2个大于1.2，则判定为Her2阳性。

同现有技术相比，本发明的突出效果在于：

(1)本发明的方法既可以做到常规方法判断为疑似阳性的是否存在HER2阳性，又可以解决常规方法判断为阴性而实际为假阴性的样本。通过设计三对引物结合HER2来明确指示HER2是否增加，另外一对引物结合在恒定的单拷贝基因位置，来指示是否发生染色体倍增。这样就可以非常明确的获得HER2扩增信息以及染色体是否倍增信息。从而可以很准确的判断HER2阳性。

(2)本发明的检测方法具有较高的灵敏度，最低可检测增加一个拷贝HER2基因的变异。

(3)本发明的方法采用三组HER2基因的特异性引物探针和一组内参基因的方式进行，从而有效地排除了单一引物探针扩增导致的假阴性结果，因此相较于现有技术中具有更高的准确性。

(4)本发明的方法采用三组HER2基因的特异性引物探针和一组内参基因的方式进行，三组引物分别结合在不同的外显子区，从而有效排出单一引物探针扩增导致的假阳性结果，因此相较于现有技术中具有更高的可靠性。

(5)在本领域中，本方法具有较高灵敏度和重复性，可以判定常规检测方法结果的不确定区域。

(6)本发明中采用了新设计的内参基因，该内参基因经过多个细胞系样本优化和鉴定，可以作为稳定的内参基因表征HER2基因拷贝数是否产生变异。

下面结合附图说明和具体实施例对本发明所述的用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测试剂盒作进一步说明。

附图说明

图1为HER2-H1退火温度优化结果图(C02：57℃；C04：58℃；C06：59℃；C08：60℃；C10：61℃；C12：62℃)；

图2为HER2-H2退火温度优化结果图(F01：57℃；F03：58℃；F05：59℃；F07：60℃；F09：61℃；F11：62℃)；

图3为HER2-H3退火温度优化结果图(F02：57℃；F04：58℃；F6：59℃；F08：60℃；F10：61℃；F12：62℃)；

图4为HER2-H1引物和探针浓度优化结果图，(A01：引物浓度200nM+探针浓度200nM；C01：引物浓度200nM+探针浓度300nM；E01：引物浓度200nM+探针浓度400nM；G01：引物浓度300nM+探针浓度200nM；B02：引物浓度300nM+探针浓度300nM；D02：引物浓度300nM+探针浓度400nM；F02：引物浓度400nM+探针浓度200nM；H02：引物浓度400nM+探针浓度300nM；B03：引物浓度400nM+探针浓度400nM)；

图5为HER2-H2引物和探针浓度优化结果图，(D03：引物浓度200nM+探针浓度200nM；F03：引物浓度200nM+探针浓度300nM；H03：引物浓度200nM+探针浓度400nM；B04：引物浓度200nM+探针浓度500nM；D04：引物浓度300nM+探针浓度200nM；E04：引物浓度300nM+探针浓度300nM；G04：引物浓度300nM+探针浓度400nM；B05：引物浓度300nM+探针浓度500nM；D05：引物浓度400nM+探针浓度200nM；F05：引物浓度400nM+探针浓度300nM；H05：引物浓度400nM+探针浓度400nM；B06：引物浓度400nM+探针浓度500nM)；

图6为HER2-H3引物和探针浓度优化结果图，(D06：引物浓度200nM+探针浓度200nM；F06：引物浓度200nM+探针浓度300nM；H06：引物浓度200nM+探针浓度400nM；B07：引物浓度300nM+探针浓度200nM；D07：引物浓度300nM+探针浓度300nM；F07：引物浓度300nM+探针浓度400nM；H07：引物浓度400nM+探针浓度200nM；B08：引物浓度400nM+探针浓度300nM；D08：引物浓度400nM+探针浓度400nM)；

图7为RPPH1基因扩增退火温度优化(C01：56℃；C03：58℃；C6：60℃；C09：61℃)；

图8.为RPPH1基因引物和探针浓度优化结果图，(B05：引物浓度150nM+探针浓度50nM；D05：引物浓度150nM+探针浓度100nM；F05：引物浓度150nM+探针浓度200nM；H05：引物浓度250nM+探针浓度50nM；C06：引物浓度250nM+探针浓度100nM；F06：引物浓度250nM+探针浓度200nM；B07：引物浓度350nM+探针浓度50nM；D07：引物浓度350nM+探针浓度100nM；F07：引物浓度350nM+探针浓度200nM)；

图9为HER2-H1测定5个不同水平样品的理论值和测量值的线性相关性；

图10为HER2-H2测定5个不同水平样品的理论值和测量值的线性相关性；

图11为HER2-H3测定5个不同水平样品的理论值和测量值的线性相关性。

本发明采用的引物和探针序列如下：

SEQ ID NO:1 H1-F：CCAGTAGAATGGCCAGGACAA

SEQ ID NO:2 H1-R：TGGCTGCCAGGGTCTGA

SEQ ID NO:7 H1-FAM：CGCAGTGCAGCACAG

SEQ ID NO:3 H2-F：ATAACACCCACCTCTGCTTCGT

SEQ ID NO:4 H2-R：GGTGCGGGTTCCGAAAG

SEQ ID NO:8 H2-FAM：CACACGGTGCCCTGG

SEQ ID NO:5 H3-F：TGGGCATCTGCCTGACATC

SEQ ID NO:6 H3-R：AGCCATAGGGCATAAGCTGTGT

SEQ ID NO:9 H3-FAM：ACGGTGCAGCTGGT

SEQ ID NO:10 P1-F：GAGGGAAGCTCATCAGTGG

SEQ ID NO:11 P1-R：CCCTAGTCTCAGACCTTCC

SEQ ID NO:12 P1-VIC：CCACGAGCTGAGTGC

具体实施方式

实施例1利用ddPCR技术检测正常人细胞DNA和乳腺癌细胞DNA

(1)提取细胞基因组DNA：

对样本进行离心，加缓冲液进行悬浮，之后加入蛋白酶K对所述样本进行溶解，得到样本溶解液；加入200μL缓冲液，充分颠倒混匀，70℃放置10分钟；加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒；将所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放回收集管中；向吸附柱中加入500μL缓冲液，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；向吸附柱中加入600μL漂洗液，12000rpm(～13400×g)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱放入收集管中；

空转12000rpm(～13400×g)离心2分钟，倒掉废液，将吸附柱置于室温放置数分钟；将吸附柱放入第二离心管中，向吸附膜中间加入50-200μL的缓冲液TE，室温孵有2-5分钟，12000rpm(～13400×g)离心2分钟，得到抽提的基因组DNA。

(2)进行PCR扩增。每个待测样本同时进行4组PCR反应，每组PCR反应用H1、H2、H3、P1中的1对引物。

a.20μL PCR反应体系如下：待测细胞基因组DNA 50～100ng，2X ddPCRSuperMixfor Probes(Bio-Rad Laboratories)10μL，HER2基因或者内参基因引物上下游1.2μL，探针0.6μL，无菌蒸馏水补足至20μL；

b.将含有样品的DNA反应液通过QX200微滴发生器(Bio-Rad Laboratories，USA)生成纳升级别的油包水的液滴；

c.PCR反应条件为：95℃变性10min；随后94℃变性30sec，60℃退火60sec，进行40个循环；最后98℃延伸10min，4℃保存；

d.PCR反应结束后，将PCR板转移到QX200微滴分析仪(Bio-Rad Laboratories，USA)对所有样品孔进行荧光检测。

(3)根据数字PCR的结果，将样本1和样本2配置成不同比例的4个水平DNA混合液。

(4)上述步骤(2)进行PCR扩增，

(5)结果分析：

计算三对特异性引物对测定的HER2基因拷贝数和内参基因RPPH1拷贝数，分别计算每对引物测定的HER2基因拷贝数与内参基因拷贝数比值，见下表1。结果表明PLCL5-8四株细胞系的HER2基因没有发生变异，而HCC1419和HCC1954两株细胞系的HER2基因拷贝数与内参基因拷贝数比值均大于1.0，表明这两株细胞系是HER2基因拷贝数变异阳性。

表1不同细胞系HER2基因拷贝数变异分析

样本编号	H1/P1	H2/P1	H3/P1
				样本1：PLCL5	0.98	0.96	0.97
样本2：PLCL6	0.99	0.98	0.96
				样本3：PLCL7	0.96	0.94	0.94
样本4：PLCL8	0.94	0.97	0.93
				样本5：HCC1419	22.6	22.4	22.1
样本6：HCC1954	36.3	33.4	34.3

实施例2利用ddPCR技术检测HER2不同突变水平的样本

将样本3和样本6按不同比例混合，配置成4个HER2不同突变水平的样本，利用实施例1的方法测定得到各个样本的H1/P1、H2/P1、H3/P1值。结果如下表2所示。三对引物扩增得到的拷贝数与内参基因比值均与配制的理论值非常接近，相关系数都大于0.93，线性相关系数均大于0.995。表明本发明中所述方法准确度高，对于最低突变水平样本3的检测结果表明，所述方法可以准确检测出低至1个拷贝增加的样本，而且三对引物的测定结果一致性很高。

表2 HER2不同拷贝数变异水平样本的测定结果

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

序列表

<110> 中国计量科学研究院

<120> 一种用于检测乳腺癌HER2拷贝数变异的数字PCR方法及检测试剂盒

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ccagtagaat ggccaggaca a 21

<210> 2

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggctgccag ggtctga 17

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ataacaccca cctctgcttc gt 22

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgcgggtt ccgaaag 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggcatctg cctgacatc 19

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agccataggg cataagctgt gt 22

<210> 7

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcagtgcag cacag 15

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cacacggtgc cctgg 15

<210> 9

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acggtgcagc tggt 14

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagggaagct catcagtgg 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccctagtctc agaccttcc 19

<210> 12

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccacgagctg agtgc 15