阅读说明：本技术 柴胡皂苷b2在制备预防或治疗肾纤维化药物中的应用 (Application of saikosaponin B2 in preparing medicine for preventing or treating renal fibrosis ) 是由 辛宏 谭文福 张雪梅 任大堆 骆佳 杨佳鸿 于 2019-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,尤其涉及柴胡皂苷B2对于肾纤维化的预防或治疗作用。柴胡皂苷B2包括以下应用：a1：制备预防和/或治疗肾组织纤维化的药物；a2：预防和/或治疗肾组织纤维化；a3：抑制Hedgehog信号通路；a4：建立肾组织纤维化动物医学模型。本发明首次公开了SSB2的新用途,为SSB2抑制肾纤维化的药理作用提供了理论依据。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to a prevention or treatment effect of saikosaponin B2 on renal fibrosis. The saikosaponin B2 comprises the following applications: a 1: preparing a medicament for preventing and/or treating fibrosis of kidney tissue; a 2: preventing and/or treating fibrosis of kidney tissue; a 3: inhibiting the Hedgehog signaling pathway; a 4: establishing a kidney tissue fibrosis animal medical model. The invention discloses the new application of SSB2 for the first time, and provides a theoretical basis for the pharmacological action of SSB2 in inhibiting renal fibrosis.)

柴胡皂苷B2在制备预防或治疗肾纤维化药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及柴胡皂苷B2在制备预防或治疗肾纤维化药物中的应用。

背景技术

慢性肾脏病(chronic kidney disease)在全球患病率为10-12％，且呈逐年上升趋势，慢性肾小球肾炎、高血压肾病、糖尿病肾病、肾间质疾病、肾小管性疾病、先天性获得性肾脏疾病以及不合理服用肾毒性药物等均可引起慢性肾脏病，最终进展至终末期肾衰竭(End-stage renal disease)，成为致死的高危因素。肾脏纤维化(renal fibrosis)是各种原因引起的慢性肾脏病发展到终末期肾衰竭的早期关键的、共同的病理改变，严重影响肾脏功能。肾脏纤维化病因和发病机制非常复杂，目前在预防和治疗上均无有效的方法。因此，寻找理想的能干预、逆转肾纤维化的药物靶点及开发有效的逆转肾纤维化的药物，对在早期阶段预防各种慢性疾病导致的终末期肾衰竭的发生具有重要的意义。

目前关于肾脏纤维化的分子机制很复杂并没有得到很好的阐释。近年来的一些研究表明hedgehog信号通路的异常活化参与了肾纤维化。Hedgehog(HH)信号通路是一种进化保守的发育通路，在调节哺乳动物胚胎的发育中起着重要作用，包括肾脏的发育。目前研究发现哺乳动物中至少有3种同源基因：音猬因子(sonic hedgehog，SHH)、沙漠刺猬因子(desert hedgehog，DHH)、印度刺猬因子(indian hedgehog，IHH)，在哺乳动物HH信号通路主要是由HH配体SHH、IHH,膜受体Patched(PTCH1、PTCH2)、Smoothened(SMO)及下游的转录因子Gli家族(Gli1、Gli 2和Gli 3)组成。经典的HH信号通路活化途径是HH配体先合成前肽，经过自动的催化裂解产生一个N末端片段(ShhN)，再经胆固醇和异戊烯基脂质修饰后转移至质膜并释放到胞外，HH与PTCH结合，解除对SMO的抑制，SMO解除了Gli磷酸化等过程，从而使Gli以全长形式进入细胞核启动对靶基因的转录，当配体HH缺乏时，受体PTCH与SMO结合形成复合物，SMO活性受到抑制，转录因子Gli被磷酸化、泛素化及蛋白酶体截断，Gli不能以全长形式入核，从而抑制对靶基因的转录。近期的一些研究表明在纤维化的肾脏组织中存在着Hedgehog信号通路的异常激活，并在肾纤维化的发生和发展中起着非常重要的作用。研究表明Gli1消融小鼠能够对抗UUO引起的肾间质纤维化，并且SMO的抑制剂环巴胺(Cyclopamine)能够减轻UUO引起的肾脏纤维化，GDC0449是第二代环巴胺衍生物，被FDA批准上市，通过直接与SMO结合发挥作用。

柴胡皂苷B2(Saikosaponin B2，SSB2)属于五环三萜类齐墩果烷型的衍生物的一种，目前尚未见有关其抑制肾纤维化作用的报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种柴胡皂苷B2的应用，为如下a1、a2、a3或a4：

a1：制备预防和/或治疗肾组织纤维化的药物；

a2：预防和/或治疗肾组织纤维化；

a3：抑制Hedgehog信号通路；

a4：建立肾组织纤维化动物医学模型。

优选的，所述药物的活性成分包含柴胡皂苷B2。

优选的，所述肾组织纤维化的药物为治疗慢性肾脏病的药物。

优选的，所述肾组织纤维化动物医学模型的建立方法包括以下步骤：

S1、分组：将动物分为假手术组和单侧输尿管结扎组；

S2：给予两组动物不同浓度的柴胡皂苷B2；

S3：造模：

S4：造模后给药6-9天后取左肾，进行肾脏病理学分析。

应当理解，在步骤S1之前、步骤S1和S2之间、步骤S2和S3之间、步骤S3和S4之间及步骤S4之后还可以包括其他步骤，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，在S3中，单侧输尿管结扎组的处理步骤为：将动物麻醉后固定；剪掉腹部毛发，消毒腹部皮肤，腹部正中切口1.5-2.5cm，止血钳固定，分离左侧输尿管，双重结扎，缝合切口，消毒。

优选的，在S2中，柴胡皂苷B2的浓度分别为15mg/kg和30mg/kg。

应当理解，本发明中的柴胡皂苷B2的浓度并不限于以上两种，本领域技术人员可以根据需要选择任意浓度的柴胡皂苷B2，且均在本发明的保护范围之内。

优选的，在S3中，腹部正中切口2cm。

在本发明的一些优选方案中，采用单侧输尿管结扎法建立小鼠肾纤维化模型，实验分为4组：正常对照组、模型组、低剂量SSB2用药组、高剂量SSB2用药组。

通过HE染色、Sirius red染色和Masson染色法检测肾组织纤维化程度及病理改变，荧光定量PCR和Western blot检测肾组织中α-SMA、fibronectin、collagen I、Gli1的mRNA和蛋白表达的变化。所述低、高剂量组中SSB2用量为15、30mg/kg小鼠。

在本发明的一些优选方案中，利用含ShhN条件培养基(ShhN-CM)诱导大鼠成纤维细胞NRK-49F激活HH通路，构建了离体细胞纤维化模型，实验分为6组：正常对照组、模型组、三种剂量SSB2用药组及GDC0449用药组，免疫荧光法检测细胞α-SMA、fibronectin含量变化，荧光定量PCR和Western blot检测肾组织中α-SMA、fibronectin、collagen I、Gli1的mRNA和蛋白表达的变化。所述三种剂量用药组中SSB2用量为5、10、20μmol/L；所述GCD0449用药组中GDC0449用量为0.1μmol/L。

在本发明的一些优选方案中，利用双荧光素酶报告基因检测(Dual-Luciferasereporter assay，DR)法检测SSB2对TNF-α刺激的NF-κB转录活性、PEG2刺激的Wnt/β-catenin中的转录活性及Gli2ΔN和Smo D473H质粒转染诱发的Gli转录活性的影响。

本发明的目的之二在于提供一种预防和/或治疗肾组织纤维化的药物，所述药物的活性成分包含柴胡皂苷B2。

优选的，所述药物还包括药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂选自粘合剂、填料、增塑剂、助流剂、崩解剂和润滑剂中的一种或者任意组合。

优选的，所述药物为注射剂或口服剂。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，而不超出本发明的构思与保护范围。

本发明首次公开了SSB2的新用途，为SSB2抑制肾纤维化的药理作用提供了理论依据。

附图说明

图1是SSB2干预UUO小鼠肾脏HE染色、Sirius red染色和Masson染色图(200X)。

图2是SSB2减少UUO引起的肾纤维化标志蛋白的生成且降低Hedgehog信号通路上Gli1蛋白的表达水平示意图。

图3是SSB2减少UUO引起的肾纤维化标志蛋白和Hedgehog信号通路上Gli1 mRNA的表达水平示意图。

图4是SSB2干预Shh诱导NRK-49F细胞纤维化标志蛋白表达和Gli1蛋白表达示意图。

图5是SSB2减少Shh诱导NRK-49F细胞纤维化蛋白和Gli1 mRNA的表达示意图。

图6是SSB2减少Shh诱导NRK-49F细胞Fibronectin、α-SMA的表达示意图。

图7是SSB2选择性抑制Hedgehog信号通路示意图。

图8是SSB2抑制Hedgehog信号通路中的Smo示意图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

需要注意的是，如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用试剂未注明生产厂商者，均为可以通过市场获得的常规产品。

本发明进行了动物实验和细胞实验，经对建立的动物模型和细胞模型，给予SSB2进行干预，使用了组织形态学分析，蛋白印迹实验，荧光定量PCR及双荧光素酶报告基因检测法等实验方法。本发明的实施例中，动物实验结果显示，SSB2能实现对病理环境诱导的肾纤维化的抑制，减轻纤维化过程中对肾单位的损害；细胞实验结果显示，SSB2通过选择性抑制Hedgehog信号通路，抑制成纤维细胞向肌成纤维细胞的激活，降低了ShhN诱导的纤维化标志蛋白增加，并且其作用靶点可能为SMO，SSB2进一步可用于制备治疗或预防肾纤维化。

本发明实施例中，具体进行了包括以下步骤的干预实验：

(1)小鼠单侧输尿管阻塞手术；(2)组织形态学分析；(3)离体细胞研究；(4)蛋白印迹实验；(5)实时荧光定量PCR实验；(6)细胞免疫荧光实验；(7)双荧光素酶报告基因检测；(8)数据分析：实验结果以Mean±SD表示，所有数据用GraphPad Prism软件One-Way ANOVA方法进行分析，P＞0.05认为没有显著性差异。

实施例1 SSB2抑制单侧输尿管结扎(unilateral ureteral occlusion，UUO)诱导小鼠肾纤维化

1.动物

SPF级C57BL/6雄性小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限公司。所有实验经过复旦大学上海医学院动物关爱和使用委员会核准。

2.实验药品及试剂

柴胡皂苷B2(士锋生物)，甲醇(国药集团化学试剂有限公司)，多聚甲醛(国药集团化学试剂有限公司)，乙醇(国药集团化学试剂有限公司)，细胞培养液：DMEM培养基(Gibco)，胎牛血清(Gibco)，PBS磷酸盐缓冲液，胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Sigma)，α-SmoothMuscle Actin rabbit antibody(CST)，Gli1 rabbit antibody(CST)，GAPDH rabbitantibody(CST)，fibronectin rabbit antibody(CST)，HRP标记山羊抗兔IgG(H+L)(明睿生物)，BSA(Sigma)，Trizol(TAKAR)，PrimeScriptTM RT Master Mix(perfect Real Time；TAKAR)，SYBR Premix Ex TaqTM(Takara)，双氧水(国药集团化学试剂有限公司)，苏木素染液(武汉谷歌生物科技有限公司)，盐酸，氨水(国药集团化学试剂有限公司)，中性树胶(谷歌生物)，GDC-0449(Selleck Chemicals)，N末端缺失质粒Gli2ΔN，SMO突变体质粒SmoD473H，ShhN质粒(addgene公司)，TK-Renilla luciferase(Promega公司)、NF-κBluciferase(Promega公司)、***素E2(Prostaglamdin E2(PGE2)，Sigma-Aldrich)，TNF-α(peprotech)，JQ-1(Selleck Chemicals)，Lipofectamine 2000(Thermo Fisher)。

3.仪器

生物安全柜(Thermo Fisher)，CO₂细胞培养箱(Thermo Fisher)、冷冻离心机(Thermo Fisher)、培养皿(Thermo Fisher)、Millipore水纯化系统、凝胶电泳装置BioRad、转印装置Bio Rad、CA及高压灭菌锅Thermo(美国)、凝胶图像处理系统Alpha InnotechCorporation、倒置显微镜(Laica，DMIL，Wetzlar，德国)、Q-RTPCR仪(Bio-Rad，美国)。

4.实验方法

(1)分组：取8周龄C57BL/6小鼠，24只，体重20-22g，分成假手术组(Sham组)、UUO组，低剂量给药组和高剂量给药组，每组6只小鼠。

(2)造模：用3％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，固定；剪掉腹部毛发，碘伏消毒腹部皮肤，腹部正中切口2cm，止血钳固定，分离左侧输尿管，用4-0丝线双重结扎，缝合切口，消毒；Sham组所有操作相同，但不结扎输尿管。造模前7天开始给药，低、高剂量给药组分别给予15mg/kg、30mg/kg的SSB2，其他两组腹腔注射相同体积的生理盐水，每天一次，持续7天，然后进行造模；造模后给药剂量和方式不变持续7天，造模7天后分别取左肾。

(3)肾脏病理学指标：肾脏组织置于4％***固定，石蜡包埋，切为4μm厚度的切片，进行HE染色、Masson和天狼星红染色，在光镜下观察并进行分析，检测肾纤维化程度。

(4)用PCR测定结扎肾的纤维化相关基因α-SMA(α-平滑肌肌动蛋白)、collagen I(胶原蛋白I型)、fibronectin(纤维粘连蛋白)和Gli1(锌指蛋白1)的相对mRNA水平，并用Western blot对相应蛋白水平进行了分析。本实施方式中的PCR法和免疫印迹法均采用本领域常用的实验步骤进行。

实验结果如图1、图2和图3所示：SSB2减轻了肾损伤和肾纤维化，降低了UUO小鼠肾纤维化标志蛋白α-SMA、Fibronectin和Gli1的蛋白及mRNA水平。

实施例2 SSB2抑制Shh诱导大鼠肾成纤维细胞NRK-49F肾纤维化

实验步骤如下：

HEK293T细胞转染ShhN质粒24小时后更换含1％胎牛血清的DMED培养基继续培养48小时后收集的条件培养基ShhN-CM，用于后续的细胞处理。将大鼠肾成纤维细胞NRK-49F接种于孔板，经过12-16小时细胞饥饿处理后，细胞分为对照组，纤维化组(ShhN-CM)，低剂量给药组(ShhN-CM+SSB2 5μM)，中剂量给药组(ShhN-CM+SSB2 10μM)，高剂量给药组(ShhN-CM+SSB2 20μM)，阳性药组(ShhN-CM+GDC0449 0.1μM)，细胞培养48小时之后，加入细胞裂解液，提取细胞蛋白，采用western blot法检测细胞中Fibronectin、α-SMA、Gli1和GAPDH蛋白含量。采用免疫荧光法检测Fibronectin、α-SMA含量的变化。

结果如图4、图5和图6所示：SSB2降低了ShhN诱导NRK-49F细胞的纤维化蛋白和mRNA的升高，并且降低了Gli1蛋白和mRNA的表达，GDC0449作为Hedgehog通路的抑制剂阳性对照药，具有相似的结果。

实施例3 SSB2选择性抑制Hedgehog信号通路

实验步骤如下：

取对数生长细胞LS174T、293T和NIH-3T3细胞接种至96孔板，培养24小时后，分别转染荧光报告基因TCF/LEF质粒、NF-κB质粒、Gli-luciferase质粒与TK-Renilla质粒共转染36小时后，具体转染步骤参照Invitrogen Lopo 2000操作说明书进行，分别给予PEG2、TNF-α、ShhN-CM与SSB2、GDC0449、JQ-1共同作用24小时后终止反应，吸出培养基，预冷的PBS洗两次，最后一步根据荧光素酶双报告试剂盒Promega Dial-Luciferase Reporter assay的说明书对细胞进行处理，萤火虫荧光素Luciferase数值以海参荧光素Renilla为参照进行归一化处理Luciferase/Renilla值显示报告基因的相对转录活性；并检测NIH-3T3细胞的Ptch1和Gli1 mRNA水平。

结果如图7所示：在NIT-3T3细胞中，SSB2降低了ShhN诱导的Ptch1和Gli1 mRNA增加，抑制了Hedgehog通路的转录活性，其IC₅₀为0.49μΜ；并且不能够抑制PEG2诱导的Wnt/β-catenin信号通路转录活性的增加和TNF-α诱导的TNF-α/NF-κB信号通路转录活性增加，说明SSB2是选择性抑制Hedgehog信号通路。

实施例4 SSB2抑制Hedgehog信号通路中的Smo

实验步骤如下：

NIH-3T3细胞分别转染Gli2ΔN和Smo D473H质粒，和Gli-luciferase质粒与TK-Renilla质粒共转染36小时，SSB2处理24小时后检测转录活性。

结果如图8所示：SSB2不能抑制Gli2ΔN诱导的Hedgehog通路转录活性增加，表明SSB2抑制其活性是作用在Gli上游，利用GDC0449耐受的Smo突变质粒Smo D473H转染到细胞，发现SSB2和GDC0449均不能抑制通路的转录活性，Gli的抑制剂JQ-1是具有效果的，说明SSB2发挥抑制hedgehog通路是很有可能是和GDC0449具有相同的作用靶点，即作用于Smo。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。