阅读说明：本技术 制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法 (Method for preparing BEM for purifying immobilized recombinant protein with AcmA ) 是由 韩烨 赵芳坤 肖华志 周志江 于 2019-09-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用GEM去除重组蛋白内毒素的方法,它涉及一种去除大肠杆菌表达重组蛋白中内毒素的方法,蛋白-AcmA融合蛋白重组表达载体,诱导表达后利用GEM(革兰氏阳性基质)进行纯化固定化,然后利用Triton X-114处理固定化蛋白以去除内毒素。该方法可以在低温(4℃)下进行内毒素的去除工作,避免温度改变影响蛋白活性,并简化去除内毒素操作。(The invention discloses a method for removing endotoxin in recombinant protein by utilizing GEM, which relates to a method for removing endotoxin in escherichia coli expression recombinant protein, wherein a protein-AcmA fusion protein recombinant expression vector is subjected to purification and immobilization by utilizing GEM (gram positive matrix) after induction expression, and then the immobilized protein is treated by utilizing Triton X-114 to remove the endotoxin. The method can remove endotoxin at low temperature (4 deg.C), avoid temperature change affecting protein activity, and simplify endotoxin removal operation.)

制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法

技术领域

本发明涉及一种利用细菌菌体制备新型材料BEM用于纯化固定化带有AcmA的重组蛋白的方法。

背景技术

酶的固定化对于酶的应用具有重要意义，通过固定化，可以使昂贵的酶得到回收利用，同时能够避免在反应体系中引入新的蛋白杂质。酶的固定化被广泛应用于工业催化、发酵、食品等领域。用于固定化的酶可以利用产酶菌株发酵，从天然产物中分离纯化，也可以通过重组表达来得到。重组表达可以提高酶的产量，通过添加适当标签，可以进行亲和层析等方法进行纯化。这些方法需要多步进行，同时也需要一些化学试剂如硫酸铵、咪唑等。因此这些方法存在着周期长、酶活损失等缺点。

细菌可以产多种天然产物，包括细菌素、胞外多糖、酶等。多种细菌被分离筛选以用于生产各种产物。在产完天然产物以后，大量的细菌菌体需要被处理。部分乳酸菌和芽孢杆菌可以作为益生菌应用，但是野生菌需要经过大量的工作才有可能被用于益生菌。需要为细菌的菌体寻找利用的方法。

细菌细胞壁的主要组分是肽聚糖，包括革兰氏阳性菌和阴性菌，其区别之一就是肽聚糖含量的高低。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白锚定域可以与肽聚糖特异的结合。利用这个特性，通过酸煮沸细菌(包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌)可以得到无生命的细菌增强基质(Bacterial enhancer matrix particles，BEM)。BEM可以用于纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白。

发明内容

本方法的目的在于提供一种制备BEM用于纯化固定化带有AcmA重组蛋白的方法，解决现有技术中纯化固定化带有AcmA的重组蛋白方法存在着周期长、酶活损失的问题。

本发明一种利用细菌菌体制备新型材料BEM用于纯化固定化带有AcmA的重组蛋白的方法，按照以下步骤进行：

1)制备带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，作为纯化固定化酶的来源(可溶性酶及包涵体)；

2)培养***(包括乳酸菌、芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌等)、革兰氏阴性细菌(大肠杆菌、沙门氏菌)；

3)收集菌体，利用0.1M-0.2M的HCl或TCA煮沸菌体30-60分钟；

4)离心收集沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到BEM；

5)将BEM调整至相同浓度，用于纯化固定化带有AcmA标签的重组α-淀粉酶；

6)测定不同BEM纯化固定化的酶活，并进行SDS-PAGE；

7)利用8M尿素溶解包涵体，利用制备的BEM从包涵体的尿素变性中回收酶活；

8)测定不同BEM纯化固定化包涵体中的酶活，并进行SDS-PAGE。

在步骤1)中，培养带有质粒pET28a-α-amylase-AcmA的大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，收集菌体后超声破碎并离心，得到带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，得到的上清作为可溶性的纯化固定化酶来源，沉淀作为从包涵体中回收酶活的来源。

在步骤2)中，利用最适培养基培养细菌，MRS培养基培养乳酸菌(8种)，LB培养基培养芽孢杆菌(2种)、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、大肠杆菌。在最适温度下培养。

在步骤3)中，通过高速离心收集菌体，转速可选择从4000rpm-10000rpm，温度从4℃至室温，离心10分钟至30分钟，弃上清，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl(或TCA)中，煮沸30-60分钟。

在步骤4)中，利用离心收集上一步煮沸得到的沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到不同细菌制备的BEM。

在步骤5)中，将制备得到的BEM调整至相同浓度以测定其结合能力，离心收集后弃上清，分别与步骤1)得到的上清结合以纯化固定化重组α-淀粉酶，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。

在步骤6)中，将上一步纯化固定化的酶测定酶活，利用DNS法测定酶活；将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE。

在步骤7)中，利用8M尿素溶解步骤1)得到的包涵体，充分溶解后12000rpm离心，取上清与制备的BEM混匀，室温下结合20-50分钟，12000rpm离心分离，取沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分清洗以去除非特异性结合和尿素，将结合有重组蛋白的BEM重悬于50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，4℃过夜复性。

在步骤8)中，利用DNS法测定酶活，将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE。

有益效果：本发明以细菌(***和革兰氏阴性细菌)菌体为原料制备新型的纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白的材料BEM，BEM能够纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白，并且能够从包涵体中回收酶活。该方法具有简单易行、成本低廉、来源广泛、将废弃的细菌菌体充分利用的优点。该方法可以将细菌菌体制备成纯化固定化材料BEM并且可以替代GEM作为纯化固定化材料。

附图说明

图1重组α-淀粉酶的诱导表达；

M：蛋白Marker；1、2：诱导前后全菌蛋白组成；3、4：诱导后超声破碎离心分离得到的上清和沉淀；

图2BEM纯化固定化重组α-淀粉酶；

a：SDS-PAGE分析BEM纯化固定化情况；M：蛋白Marker；1：上清；2：乳酸乳球菌NZ9000；3：大肠杆菌BL21；4：鼠伤寒沙门氏菌；5：金黄色葡萄球菌；6：藤黄微球菌；7：屎肠球菌TG2；8：乳酸片球菌PA003；9：清酒乳杆菌；10：假肠膜明串珠菌；11：魏斯氏菌；12：柠檬明串珠菌；13：清酒乳杆菌；14：解淀粉芽孢杆菌BH072；15：地衣芽孢杆菌。b：不同BEM纯化固定化α-淀粉酶的酶活；1：乳酸乳球菌NZ9000；2：大肠杆菌BL21；3：鼠伤寒沙门氏菌；4：金黄色葡萄球菌；5：藤黄微球菌；6：屎肠球菌TG2；7：乳酸片球菌PA003；8：清酒乳杆菌；9：假肠膜明串珠菌；10：魏斯氏菌；11：柠檬明串珠菌；12：清酒乳杆菌；13：解淀粉芽孢杆菌BH072；14：地衣芽孢杆菌。

图3BEM从包涵体中回收酶活；

A：SDS-PAGE分析BEM从包涵体中回收酶活；M：蛋白Marker；1：尿素溶解包涵体；2：乳酸片球菌PA003；3：清酒乳杆菌；4：地衣芽孢杆菌；5：乳酸乳球菌NZ9000；6：大肠杆菌BL21；7：鼠伤寒沙门氏菌。B：BEM从包涵体中回收酶活；1：乳酸片球菌PA003；2：清酒乳杆菌；3：地衣芽孢杆菌；4：乳酸乳球菌NZ9000；5：大肠杆菌BL21；6：鼠伤寒沙门氏菌。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：BEM的制备

1)细菌培养

8种乳酸菌利用MRS培养基培养，2种芽孢杆菌、1种沙门氏菌、1种金黄色葡萄球菌、1种藤黄微球菌、1种大肠杆菌利用LB培养基培养，在最适温度下培养。

2)BEM制备

通过高速离心收集菌体，转速可选择从4000rpm-10000rpm，温度从4℃至室温，离心10分钟至30分钟，弃上清，将菌体重悬于0.1M-0.2M的HCl(或TCA)中，煮沸30-60分钟。

3)BEM洗涤

利用离心收集上一步煮沸得到的沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀，得到不同细菌制备的BEM。

实施例2：BEM纯化固定化重组α-淀粉酶

1)重组酶制备

培养带有质粒pET28a-α-amylase-AcmA的大肠杆菌BL21，利用IPTG诱导，收集菌体后超声破碎并离心，利用SDS-PAGE进行分析，结果如图1所示，得到了带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，得到的上清作为可溶性的纯化固定化酶来源，沉淀作为从包涵体中回收酶活的来源。

2)将制备得到的BEM调整至相同浓度以测定其结合能力，离心收集后弃上清，分别与上清结合以纯化固定化重组α-淀粉酶，结合时间为30-50分钟，4000rmp离心分离，用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分洗涤沉淀。

本实施例得到BEM纯化固定化的重组α-淀粉酶，纯化与固定化合并为一步。

3)酶活测定及SDS-PAGE

将上一步纯化固定化的酶测定酶活，利用DNS法测定酶活，结果如图2b所示，以NZ9000制备的BEM结合酶活活性为100％，所制备的全部BEM均能够纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白；将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE，结果如图2a所示，制备的BEM具有纯化固定化带有AcmA标签的重组蛋白的能力。

实施例3：BEM从包涵体中回收酶活

1)包涵体制备

制备带有AcmA标签的重组α-淀粉酶，超声破碎以后得到的沉淀作为从包涵体中回收酶活的来源。

2)BEM从包涵体中回收酶活

利用8M尿素溶解包涵体，充分溶解后12000rpm离心，取上清与制备的BEM混匀，室温下结合20-50分钟，12000rpm离心分离，取沉淀，利用50mM的Tri-HCl(pH7.2)充分清洗以去除非特异性结合和尿素，将结合有重组蛋白的BEM重悬于50mM的Tri-HCl(pH7.2)中，4℃过夜复性。

3)分析

利用DNS法测定酶活，结果如图3b所示，制备的6种BEM均能够从尿素溶解的包涵体中回收酶活，其回收能力因来源菌不同而不同；将不同BEM纯化固定化的酶进行SDS-PAGE，结果如图3a所示，制备的6种BEM均具有从尿素溶解的包涵体中回收目的蛋白的能力。

本实施例利用BEM从包涵体中回收得到具有活性的重组α-淀粉酶。