一种茶树精油抗菌机制的研究方法
阅读说明：本技术 一种茶树精油抗菌机制的研究方法 (Method for researching antibacterial mechanism of tea tree essential oil ) 是由 宋吉明 吴江敏 朱泽华 方晶 董庄庄 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种茶树精油抗菌机制的研究方法,本发明属于精油抗菌技术领域,包括以下步骤：扫描电镜观察菌体细胞膜的变化；茶树精油处理前后对菌体胞内大分子物质的影响；倒置荧光显微镜观察菌体核酸的变化；茶树精油处理前后细菌DNA含量的变化；茶树精油处理前后细菌蛋白质含量的变化。本发明提供的方法较为简单高效,能够直观准确的反映茶树精油的抗菌机制,为茶树精油进一步的应用提供理论基础。(The invention discloses a method for researching an antibacterial mechanism of tea tree essential oil, belongs to the technical field of essential oil antibacterial, and comprises the following steps: observing the change of the cell membrane of the thallus by a scanning electron microscope; influence on intracellular macromolecular substances of the thalli before and after the treatment of the tea tree essential oil; observing the change of the thallus nucleic acid by an inverted fluorescence microscope; the change of the DNA content of bacteria before and after the treatment of the tea tree essential oil; the change of the bacterial protein content before and after the tea tree essential oil treatment. The method provided by the invention is simple and efficient, can intuitively and accurately reflect the antibacterial mechanism of the tea tree essential oil, and provides a theoretical basis for further application of the tea tree essential oil.)
技术领域
本发明属于精油抗菌研究领域，具体涉及一种茶树精油抗菌机制的研究方法。
背景技术
互叶白千层，又称茶油树，是茶树精油的主要原料，从互叶白千层新鲜枝叶中提取的茶树精油，属于天然油脂，富含松油精、柠檬油精、桉油酚、茴香素等，具有杀菌消炎、收敛毛孔、治疗伤风感冒、咳嗽、鼻炎、哮喘、改善痛经及生殖器感染等功效。适用于油性及粉刺皮肤，能够治疗化脓伤口及灼伤、晒伤及头屑。广泛用于皮肤保健品、化妆品、药品、食品香料等诸多领域。
目前，对茶树精油抗菌的研究大多停留在配方研究上，中国专利CN 108219940 A公布了一种杀菌微胶囊香料，该香料包含如下成分：百里香精油20-30份，茶树精油20-30份，广藿香精油5-10份，硅藻土2-7份，明胶15-20份，麦芽糊精25-30份。中国专利CN108142463 A公布了一种天然植物抗菌剂，它包括质量份数分别如下的原料：茶树精油6-7份、杏仁酸0.5-1份、芦荟提取物4-6份和紫草、红花、乌梅、升麻混合提取液20-25份、多元醇1-5份、 苯氧乙醇1-5份、乙基己基甘油1-5份、对羟基苯乙酮1-5份、抗氧化剂2-5份和去离子水40-60份。然而，国内专利对茶树精油其特定的抗微生物作用和其潜在抗菌机制仍未得到很好的表征。
本专利以变形杆菌和金黄色葡萄球菌为代表，提供一种研究茶树精油抗菌机制的方法，主要通过SEM观察细胞形态，并进一步测定细菌内蛋白质、DNA、大分子、核酸等的变化。
发明内容
针对现有研究中茶树精油抗菌机制的不明，本发明提供了一种高效、快捷表征茶树精油抗菌机制的方法，可以直观准确的说明茶树精油的抗菌机制，为茶树精油在抗菌方面的应用提供理论基础。
本发明的具体技术方案如下：
一种互叶白千层茶树精油抗菌机制的研究方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）扫描电镜（SEM）观察菌体细胞膜的变化，具体将一定浓度的茶树精油置于菌液中，振荡培养，然后进行高速离心，加入一定量的戊二醛进行固定，菌体用乙醇梯度洗脱，最后用乙酸异戊酯置换，干燥喷金后扫描；
（2）茶树精油处理对菌体胞内大分子物质的影响，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加不同浓度的茶树精油振荡培养，高速离心收集上清液。紫外光分光光度计测定上清液的吸光度；
（3）倒置荧光显微镜（FIM）观察菌体核酸的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，载玻片上滴加等体积的DAPI染色液和菌悬液样品进行暗反应，使用倒置荧光显微镜观察；
（4）茶树精油处理前后细菌DNA含量的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，菌液高速离心，清洗并再次重悬，利用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取实验组和对照组菌体的DNA，紫外分光光度计测定吸光度；
（5）茶树精油处理前后细菌蛋白质含量的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心并重悬，添加一定浓度的茶树精油振荡培养，菌液高速离心，清洗并再次重悬，利用蛋白质检测试剂盒分别测定实验组和对照组细菌的蛋白质含量。
更进一步的，上述步骤（1）中茶树精油在菌液中的浓度为0.5 mg/mL，试样置于37℃振荡培养4 h，8000 rpm离心10 min，加入2.5%戊二醛固定3-4 h，菌体用一系列梯度乙醇脱水10 min，置换时间为30 min；
上述步骤（2）中茶树精油的浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC，试样置于37 ℃振荡培养4 h，8000 rpm离心10 min；
上述步骤（3）中茶树精油在菌液中的浓度为0.5 mg/mL，试样置于37 ℃振荡培养4 h，8000 rpm离心10 min，DAPI染色液浓度为10 μg/mL；
上述步骤（4）中茶树精油在菌液中的浓度为0.5 mg/mL，试样置于37 ℃振荡培养4 h，8000 rpm离心10 min；
上述步骤（5）中茶树精油在菌液中的浓度为0.5 mg/mL，试样置于37 ℃振荡培养0.5h，8000 rpm离心10 min。
本发明提供了一种茶树精油抗菌机制的研究方法，利用较为简单的方法及表征手段直观准确的反映茶树精油的抗菌过程，为茶树精油的抗菌研究及其应用提供一定的参考价值。
附图说明：
附图1为茶树精油作用前后金黄色葡萄球菌的扫描电镜图。
附图2为茶树精油作用前后变形杆菌的扫描电镜图。
附图3为茶树精油作用后金黄色葡萄球菌胞内物质游离程度。
附图4为茶树精油作用后变形杆菌胞内物质游离程度。
附图5为倒置荧光显微镜观察金黄色葡萄球菌和变形杆菌胞内核酸的变化。
附图6为茶树精油作用前后金黄色葡萄球菌和变形杆菌DNA的变化。
附图7为茶树精油作用前后金黄色葡萄球菌和变形杆菌蛋白质的变化。
具体实施方式
：
以下结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：
（1）扫描电镜（SEM）观察菌体细胞膜的变化，具体将茶树精油置于金黄色葡萄球菌菌液中，使其浓度为0.5 mg/mL，置于37 ℃振荡培养4 h后，8000 rpm离心10 min，加入2.5%戊二醛固定3-4 h，菌体用乙醇溶液（50%，70%，80%，90%，100%，v/v）梯度脱水各处理15 min，最后用乙酸异戊酯置换30 min，干燥喷金后扫描；
（2）茶树精油处理对金黄色葡萄球菌胞内大分子物质的影响，将培养至对数期的金黄色葡萄球菌高速离心10 min，清洗3次并重悬。分别向内添加茶树精油，使其浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC，在37 ℃振荡培养4 h。高速离心后收集上清液，利用紫外光分光光度计测定260 nm处上清液的吸光度；
（3）倒置荧光显微镜（FIM）观察金黄色葡萄球菌核酸的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心10 min并重悬，向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，37 ℃振荡培养4h，载玻片上滴加等体积的DAPI染色液和菌悬液样品进行暗反应10 min，使用倒置荧光显微镜观察。
（4）将金黄色葡萄球菌菌液高速离心10 min，清洗3次后加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，不添加精油的实验组作空白对照，于37 ℃振荡培养4 h。清洗3次并再次重悬。利用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取实验组和对照组菌体的DNA，紫外分光光度计测定260 nm处吸光度；
（5）将金黄色葡萄球菌菌液高速离心10 min，清洗3次后加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，不添加精油的实验组作空白对照，于37 ℃振荡培养0.5 h。清洗3次并再次重悬。利用蛋白质检测试剂盒分别测定实验组和对照组细菌的蛋白质含量。
实施例2：
（1）扫描电镜（SEM）观察菌体细胞膜的变化，具体将茶树精油置于变形杆菌菌液中，使其浓度为0.5 mg/mL，置于37 ℃振荡培养4 h后，8000 rpm离心10 min，加入2.5%戊二醛固定3-4 h，菌体用乙醇溶液（50%，70%，80%，90%，100%，v/v）梯度脱水各处理15 min，最后用乙酸异戊酯置换30 min，干燥喷金后扫描；
（2）茶树精油处理对变形杆菌胞内大分子物质的影响，将培养至对数期的变形杆菌高速离心10 min，清洗3次并重悬。分别向内添加茶树精油，使其浓度分别为1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC，在37 ℃振荡培养4 h。高速离心后收集上清液，利用紫外光分光光度计测定260nm处上清液的吸光度；
（3）倒置荧光显微镜（FIM）观察变形杆菌核酸的变化，具体将培养至对数期的菌液高速离心10 min并重悬，向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，37 ℃振荡培养4 h，载玻片上滴加等体积的DAPI染色液和菌悬液样品进行暗反应10 min，使用倒置荧光显微镜观察。
（4）将变形杆菌菌液高速离心10 min，清洗3次后加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，不添加精油的实验组作空白对照，于37℃振荡培养4 h。清洗3次并再次重悬。利用细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取实验组和对照组菌体的DNA，紫外分光光度计测定260 nm处吸光度；
（5）将变形杆菌菌液高速离心10 min，清洗3次后加入等量磷酸盐缓冲液（PBS）重悬。向菌液中添加茶树精油使其浓度为0.5 mg/mL，不添加精油的实验组作空白对照，于37 ℃振荡培养0.5 h。清洗3次并再次重悬。利用蛋白质检测试剂盒分别测定实验组和对照组细菌的蛋白质含量。
实验结果：通过图1和图2的对比可知，茶树精油处理后，金黄色葡萄球菌和变形杆菌的表面发生凹陷，细胞膜受损严重；通过图3可知，金黄色葡萄球菌的胞内分子随着茶树精油浓度的增大，其胞内分子的游离程度也在增加，表明茶树精油的处理会导致金黄色葡萄球菌的胞内分子泄露；通过图4可知，变形杆菌的胞内分子随着茶树精油浓度的增大，其胞内分子的游离程度也在增加，表明茶树精油的处理会导致变形杆菌的胞内分子泄露；通过图5对比可知，茶树精油处理后，金黄色葡萄球菌和变形杆菌的核酸量变少，表明茶树精油的处理增加了细胞膜的通透性；通过图6对比可知，金黄色葡萄球菌的DNA含量达到20 μg/mL，茶树精油处理后只有12.5 μg/mL，同样，变形杆菌的DNA含量达到18 μg/mL，茶树精油处理后只有11 μg/mL，表明茶树精油的处理导致细胞内DNA含量的减少；通过图7对比可知，金黄色葡萄球菌的蛋白质含量达到450 μg/mL，茶树精油处理后只有200 μg/mL，同样，变形杆菌的DNA含量达到800 μg/mL，茶树精油处理后只有350 μg/mL，表明茶树精油的处理导致细胞内蛋白质含量的减少。
抗菌机制：本发明通过一系列表征方法，表明茶树精油破坏细菌菌体结构的完整性，增加细胞膜的通透性，使一些胞内大分子物质泄漏出来，核酸、DNA和蛋白质含量减少，无法维持菌体的正常生理活动，从而引起细菌菌体的死亡。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。