阅读说明：本技术 艾拉莫德在制备治疗系统性硬化症的药物中的用途 (Use of Iguratimod in preparation of medicine for treating systemic sclerosis ) 是由 沈力冲 严青然 李�瑞 陈晓翔 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供了艾拉莫德在制备治疗系统性硬化症的药物中的用途,本发明发现将艾拉莫德制备成外用剂型,通过局部涂抹可以软化硬化的皮肤的应用潜能。通过实验证明,局部或全身应用艾拉莫德,可以显著抑制参与纤维化的重要转录因子EGR1,从而导致促纤维化细胞因子TGFβ的表达量减少或下游信号减弱,从而抑制系统性硬化症的进展。采用艾拉莫德二甲基亚砜溶液局部涂抹给药,也能有效减轻和治愈实验性硬皮病皮肤纤维化。(The invention provides application of Iguratimod in preparation of a medicament for treating systemic sclerosis, and the application potential of the Iguratimod in preparation of an external preparation form and capable of softening hardened skin through local application is discovered. Experiments prove that by applying iguratimod locally or systemically, important transcription factor EGR1 involved in fibrosis can be obviously inhibited, so that the expression level of the cell factor TGF beta promoting fibrosis is reduced or downstream signals are weakened, and the progress of systemic sclerosis is inhibited. The Iguratimod dimethyl sulfoxide solution is locally applied, so that experimental scleroderma skin fibrosis can be effectively relieved and cured.)

艾拉莫德在制备治疗系统性硬化症的药物中的用途

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种用于治疗系统性硬化症的药物，具体来说是艾拉莫德在制备治疗系统性硬化症的药物中的用途。

背景技术

系统性硬化症(SSc)是一种罕见的难治的多系统器官受累的自身免疫性疾病。它的病因和发病机理未明，临床表现复杂多样，主要以局限性或弥漫性皮肤增厚和纤维化为特征，同时也可累及消化道、心、肺、肾等内脏器官的全身疾病。

现有的治疗手段如糖皮质激素激素和免疫抑制剂的应用等，对阻断该病的进展而言疗效较弱、或疗效不明，甚至还会增加诱发硬皮病肾危象的概率。且这些药物的全身应用，副作用较大，部分患者难以耐受。因此，探索对该病治疗作用佳，副作用小的药物，具有重要的临床意义。

艾拉莫德是一种用于治疗类风湿性关节炎的新药。临床研究和应用表明它与甲氨蝶呤在类风湿性关节炎的患者中疗效相当，且副作用小。

发明内容

本发明的目的在于提供艾拉莫德的新的用途，所述的这种用途要解决现有技术中的药物治疗硬皮病的效果不佳或副作用过大的技术问题。

本发明提供了艾拉莫德在制备治疗系统性硬化症的药物中的用途。

进一步的，所述的艾拉莫德的药物剂型为搽剂。

进一步的，将艾拉莫德溶解在二甲基亚砜中，使得艾拉莫德在所述的药物中的质量百分比浓度为2％。

本发明还提供了一种用于治疗系统性硬化症的药物，由艾拉莫德和二甲基亚砜组成，艾拉莫德在所述的药物中的质量百分比浓度为2％。

具体的，所述的艾拉莫德为原料药，为市售药物，其化学结构式为：

本发明实验采用的药物购买自南京先声药业集团有限公司。

发明人发现艾拉莫德在细胞水平能明显抑制转录因子Egr-1的表达水平。Egr-1是一种与纤维化密切相关的转录因子，在弥漫性系统性硬化症患者的硬化的皮肤组织中明显高表达。且过表达该转录因子的成纤维细胞所呈现的基因表达谱的变化与弥漫性系统性硬化症患者的硬化的皮肤组织相对正常人皮肤组织所呈现的基因表达谱的变化十分相近。因此，发明人推测该药具有治疗治疗系统性硬化症的潜在作用，并在体外实验和几种系统性硬化症动物模型中加以验证。

通过实验证明，局部或全身应用艾拉莫德，可以显著抑制参与纤维化的重要转录因子EGR1，从而导致促纤维化细胞因子TGFβ的表达量减少或下游信号减弱，从而抑制系统性硬化症的进展。采用艾拉莫德二甲基亚砜溶液局部涂抹给药，也能有效减轻和治愈实验性硬皮病所致皮肤纤维化。

本发明和已有技术相比，其技术效果是积极和明显的。本发明在国际上首先将艾拉莫德应用于系统性硬化症治疗，创新性的验证了艾拉莫德通过局部皮肤涂抹对实验动物局部皮肤硬化的疗效。本发明为治疗系统性硬化症新药的开发，艾拉莫德新剂型的研发提供了依据。

附图说明

图1显示了艾拉莫德可抑制TGF-β诱导的健康成人皮肤成纤维细胞Egr-1的表达。

图2显示了艾拉莫德可抑制TGF-β诱导的健康成人皮肤原代成纤维细胞的激活及胶原合成。

图3显示了艾拉莫德灌胃或局部涂抹可有效治疗博来霉素诱导的皮肤纤维化。

图4显示了艾拉莫德灌胃或局部涂抹可在小鼠体内抑制TGF-β-Egr-1环路。

图5显示了艾拉莫德局部皮肤涂抹

图6显示了经艾拉莫德处理者的皮肤纤维化程度。

图7显示了艾拉莫德处理组与空白载体处理组SSc患者真皮成纤维细胞Egr-1与TGF-β的表达情况。

图8显示了经艾拉莫德处理皮肤皮成纤维细胞Egr-1及TGF-β后，皮肤组织Egr-1与TGF-β免疫组化染色显示的表达量。

具体实施方式

实施例1

本发明从正常成人皮肤组织(20岁男性，***)中成功提取原代皮肤成纤维细胞并培养，传至第三代后用于实验。本发明证实，用TGF-β刺激成纤维细胞可促使高表达与纤维化密切相关的转录因子Egr1，与此同时促使其向肌成纤维细胞分化，特征为：细胞表面高表达α-SMA且合成细胞外基质的能力增强。

而艾拉莫德可在mRNA和蛋白水平明显抑制成纤维细胞的上述反应(图1、图2)。

图1显示了艾拉莫德抑制TGF-β诱导的健康成人皮肤成纤维细胞Egr-1的表达。其中(A)用real-time PCR的方法显示艾拉莫德可在mRNA水平上抑制TGF-β诱导Egr-1的表达，且成浓度依赖性。N＝5*P<0.05(B)(C)分别用western-blot和免疫荧光两种方法证明浓度为100uM艾拉莫德可在蛋白水平上显著抑制TGF-β诱导Egr-1的表达。

图2显示了艾拉莫德可抑制TGF-β诱导的健康成人皮肤原代成纤维细胞胶原生成。其中图(A)用real-time PCR的方法证实100uM浓度的艾拉莫德可在mMRA水平抑制α-SMA基因及主要细胞外基质I型胶原(col1a1)、Ⅱ型胶原(col1a2)、纤连蛋白的表达(fibronectin)的表达(N＝5,*P<0.05,ANOVA)；图(D)(E)分别用western-blot和免疫荧光两种方法证明100uM浓度的艾拉莫德可在蛋白水平抑制α-SMA基因表达；图(B)(C)用细胞天狼星红染色的方法证明100uM浓度的艾拉莫德可抑制胶原蛋白的合成(N＝5,**P<0.01,ANOVA)。

实施例2

本发明对雄性C57/BL6小鼠皮下注射博来霉素以造成皮肤纤维化模型，并在造模开始2周后分成对照组1组和试验组2组，试验组分别每天予艾拉莫德悬液30mg/kg灌胃或注射处皮肤每天两次涂抹2％艾拉莫德二甲基亚砜溶液，每次100ul。艾拉莫德悬液的制备：以0.1％羧甲基纤维素钠(CMC)为助悬剂，每10ml助悬剂加入艾拉莫德60mg。用玻璃棒碾碎，用前充分摇匀。与对随机对照组相比，艾拉莫德灌胃及皮外涂抹可显著抑制博来霉素诱导的皮肤纤维化(图3A、C)，并减少小鼠皮肤中α-SMA阳性的肌成纤维细胞数量(图3B、D)，并能有效抑制皮肤中TGF-β及Egr1的表达。(图4)。

图3显示艾拉莫德减轻博来霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型皮肤纤维化的程度。造模组(接受博来霉素皮下注射及空白药物载体的灌胃及皮肤涂抹)的皮肤厚度及真皮层α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目明显高于阴性对照组(129.4±4.729μm VS71.17±5.974μm P＝0.005)(接受生理盐水皮下注射及空白药物载体的灌胃及皮肤涂抹)由此我们可以认为博来霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型的建立是成功的。艾拉莫德灌胃治疗组(接受博来霉素皮下注射及艾拉莫德30mg/kg的灌胃及空白药物载体局部涂抹129.4±4.729μm VS 98.66±2.841μm P＝0.0186)及艾拉莫德局部涂抹治疗组(接受博来霉素皮下注射及1％艾拉莫德DMSO溶液局部皮肤涂抹及空白药物载体灌胃129.4±4.729μm VS98.33±4.552P＝0.0394)组的皮肤厚度及真皮层α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目与造模组相比，均有明显下降。

我们进一步比较了两组经不同给药方式艾拉莫德处理的小鼠的皮肤厚度及真皮层α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目，我们发现艾拉莫德灌胃及局部涂抹治疗组间的皮肤厚度及真皮层α-SMA阳性的肌成纤维细胞的数目无统计学差异(98.66±2.841μm VS98.33±4.552μm P＝0.9522)。上述实验结果表明，艾拉莫德具有减轻博来霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型皮肤纤维化程度的疗效，且在此模型中，系统性给药与局部给药所表现出来的治疗效果相当。(图3A)小鼠皮肤组织HE染色及马松染色，图中比例尺长度相当于500μm；(图3B)小鼠皮肤组织α-SMA免疫荧光染色，图中红色荧光代表α-SMA，蓝色荧光代表细胞核比例尺长度相当于500μm。(图3C)小鼠皮肤厚度(μm)测量，各实验组均有5只小鼠，结果比较采用成组t检验，图中*表示P<0.05(图3D)小鼠皮肤组织肌成纤维细胞密度(个/m2)结果比较采用成组t检验，图中****表示P<0.0001.

图4显示了艾拉莫德下调博来霉素诱导的系统性硬化症小鼠模型皮肤组织Egr-1和TGF-β的表达。通过免疫组化染色，我们检测了各组小鼠皮肤成纤维细胞中Egr-1及TGF-β的表达量，造模组小鼠真皮层成纤维细胞的Egr-1及TGF-β阳性者的数目及其占所有成纤维细胞的比例相对阴性对照组明显提高，而艾拉莫德灌胃及局部涂抹治疗的两组小鼠真皮层成纤维细胞的Egr-1及TGF-β阳性者的数目及其占所有成纤维细胞的比例相对造模组有显著下降。两治疗组之间差别无统计学意义。

因此，我们可以认为，下调真皮层成纤维细胞Egr-1及TGF-β的表达是艾拉莫德治疗博来霉素诱导的小鼠皮肤纤维化的潜在机制之一。可以提出假设，艾拉莫德作用于成纤维细胞直接导致Egr-1表达的下调，而Egr-1作为具有促进TGF-β表达作用转录因子，其表达的明显抑制进而引起TGF-β表达的下降。(图4A)给药4周后小鼠皮肤组织TGF-β的表达量，上排40倍放大，下排400倍放大，造模组可见真皮层成纤维细胞内TGF-β高表达。而给药组的表达量则与阴性对照相似。(图4B)给药4周后小鼠皮肤组织Egr-1的表达量，上排100倍放大，下排400倍放大，造模组可见真皮层成纤维细胞内Egr-1高表达。而给药组的表达量则与阴性对照相似(图4C)每平方毫米组织中，TGF-β阳性成纤维细胞占所有成纤维细胞的比例(图4D)每平方毫米组织中，Egr-1阳性成纤维细胞占所有成纤维细胞的比例，各实验组均有5只小鼠，结果比较采用Mann-Whitney U检验，图中****表示P<0.0001。，各实验组均有5只小鼠，结果比较采用Mann-Whitney U检验，图中****表示P<0.0001。

实施例3

本发明6周龄雄性TSK-1小鼠2％予以艾拉莫德DMSO溶液100μl局部皮肤涂抹，每天2次，共6周。至第6周末，处死小鼠，收取皮肤组织，并检测皮肤厚度。TSK-1小鼠皮下纤维组织层的厚度明显大于同基因背景的正常小鼠。经6周的实验处理后，我们发现艾拉莫德涂抹组的TSK-1小鼠皮下纤维层的厚度有所下降，且差别有统计学意义(2110.3±110.3μm vs1580±73.16μm P＝0.0161)。

由此我们可以认为，艾拉莫德对模拟系统性硬化症病程晚期阶段的纤维化严重，炎症反应轻微的小鼠模型也有治疗作用。图5显示艾拉莫德局部涂抹可减轻TSK-1小鼠皮肤纤维化。(图5A)小鼠皮肤组织马松染色虚线所示范围即皮下纤维层，(图5B)皮下纤维组织层的厚度。各实验组均有3只小鼠，结果比较采用成组t检验，图中*表示P<0.05

实施例4

本发明旨在验证艾拉莫德对SSc患者皮肤组织过度活化的成纤维细胞的抑制作用。我们将同一患者皮肤活检所得的新鲜弥漫性SSc患者前臂皮肤组织分别移植至两只裸鼠皮下。待伤口愈合后，分别予以移植部位每天1次局部皮下注射艾拉莫德悬液或空白载体。5周后，处死裸鼠，取出其皮下移植的组织，制成石蜡切片后检测相关指标。实验结果如图8所示。我们通过组织天狼星红染色来观察组织内胶原纤维的含量(胶原蛋白被染成红色)，并作相对定量。

可以看到，同一患者的皮肤组织，经艾拉莫德处理者的皮肤纤维化程度较对照组明显减轻(图6)。通过半定量，我们测得，实验所用的3例患者的皮肤组织的胶原蛋白含量经艾拉莫德处理者均低于空白载体处理者。(图7 109.56μg VS 98.67μg、91.19μg VS 76.40μg、124.40μg VS 96.51μg P＝0.0739)。通过免疫组化染色，我们检测了艾拉莫德处理组与空白载体处理组SSc患者真皮成纤维细胞Egr-1与TGF-β的表达情况。

可以观察到，同一患者的皮肤组织，经空白药物载体处理者，真皮成纤维细胞可见大量Egr-1及TGF-β阳性染色，而经艾拉莫德处理者其真皮成纤维细胞Egr-1及TGF-β的阳性染色明显减少，即艾拉莫德可抑制弥漫性SSc患者真皮成纤维细胞Egr-1及TGF-β的过度表达(图8)。

图6、7、8显示艾拉莫德减轻裸鼠皮下移植SSc患者皮肤组织纤维化程度，并抑制皮肤组织Egr-1和TGF-β的表达(图6)移植皮肤组织的天狼星红染色。红色部分代表胶原蛋白，绿色部分代表非胶原总蛋白。图中比例尺的长度代表800μm.(图7)皮肤组织切片胶原蛋白含量半定量测定(图8)皮肤组织Egr-1与TGF-β免疫组化染色显示表达量。图中视野为400倍放大。