阅读说明：本技术 奥美沙坦在制备延缓血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用 (Application of olmesartan in preparation of medicine for delaying vascular smooth muscle cell aging ) 是由 张莉 雷达 张艺 梁庆阳 于 2019-10-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种奥美沙坦的新用途,具体是指奥美沙坦在制备延缓血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用。血管老化影响各种心血管疾病的发生阈值、进展、严重程度和预后,是造成心血管疾病高病死率的重要因素。血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要成分之一,是血管老化的重要细胞生物学基础,血管平滑肌细胞的结构和功能在血管老化过程中扮演着重要角色,本发明的奥美沙坦的用途是其能够延缓血管平滑肌细胞衰老,具有积极的临床意义。(The invention provides a new application of olmesartan, and particularly relates to an application of olmesartan in preparation of a medicine for delaying vascular smooth muscle cell aging. Vascular aging affects the occurrence threshold, progression, severity and prognosis of various cardiovascular diseases, and is an important factor contributing to high mortality of cardiovascular diseases. The blood vessel smooth muscle cell is one of main components forming a blood vessel wall, is an important cell biological foundation of blood vessel aging, the structure and the function of the blood vessel smooth muscle cell play an important role in the blood vessel aging process, and the olmesartan has positive clinical significance for delaying the aging of the blood vessel smooth muscle cell.)

奥美沙坦在制备延缓血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用

技术领域

本发明涉及奥美沙坦的新用途，具体是指奥美沙坦在制备延缓血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用。

背景技术

人口老龄化是严峻的社会问题，我国尤甚。伴随分子和细胞功能紊乱的血管衰老被认为是心血管疾病(CVD)的一个特殊危险因素，可导致动脉粥样硬化和高血压等；同时血管衰老也是治疗CVD的干预靶目标之一。血管平滑肌细胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)作为血管壁固有的最丰富的细胞，在衰老相关的血管重构及在动脉粥样硬化的病理进程中扮演着主要角色。阐明血管衰老的相关机制，尤其在VSMC中的机制有助于衰老相关CVD的防治，意义重大。小分子RNA中的微RNA(miRNAs)是目前在不同状态不同疾病中研究较多的非编码RNAs，包括在衰老疾病中的研究，miRNAs功能的改变可通过调节关键分子通路影响衰老相关基因表达，参与细胞衰老及相关信号通路的调控。

血管紧张素II(Ang II)信号在血管衰老相关的重构中起重要作用。衰老VSMCs中血管紧张素转换酶-1(ACE-1)的转录、翻译及活性均显著增加。研究发现Ang II的表达水平在衰老增厚的内膜中明显增加，其裂解产物Ang II受体-AT1表达水平也上调。同时研究也发现Ang II可诱导动脉血管壁重构，包括内膜-中膜增厚、VSMCs无菌性炎症；介导衰老相关的VSMCs迁移/侵袭能力、增殖能力增加及分泌金属基质蛋白酶2(MMP2)活性增强。Ang II水平的升高对血管重构的影响是血管衰老的重要表现。因此抑制Ang II信号可能成为抑制VSMCs衰老的新手段。奥美沙坦是AT1受体阻滞剂，目前无奥美沙坦相关血管衰老的研究。

发明内容

本发明的目的是在奥美沙坦具延缓血管平滑肌细胞衰老作用，且这一作用是通过调节miR-665实现的研究基础上，提出奥美沙坦在制备延缓血管平滑肌细胞衰老的药物中的应用。

用博莱霉素(BLM)诱导人血管平滑肌细胞(HA-VSMC)构建细胞衰老模型。SA-β-Gal染色、NAD⁺/NADH比值测定、γ-H2AX荧光染色测定DNA损伤情况、EdU流式定量测定细胞增殖能力指标评价细胞衰老。实验证实：奥美沙坦可延缓HA-VSMC衰老。

miR-665为奥美沙坦干预衰老血管平滑肌细胞的差异表达miRNA之一。

对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组HA-VSMCs行基因芯片检测，分析差异miRNAs表达，选取Top 8差异表达miRNAs。qRT-PCR证实：衰老细胞中miR-665表达上调，而miR-193a-3p、miR-3133、miR-4517和miR-942-3p表达下调；然而奥美沙坦仅逆转了miR-665和miR-3133的表达。值得注意的是，miR-665比miR-3133产生更明显的变化，因此选择miR-665进行进一步研究。发现奥美沙坦具延缓血管平滑肌细胞衰老作用是通过调节miR-665实现的。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：

血管老化影响各种心血管疾病的发生阈值、进展、严重程度和预后，是造成心血管疾病高病死率的重要因素。血管平滑肌细胞是构成血管壁的主要成分之一，是血管老化的重要细胞生物学基础，血管平滑肌细胞的结构和功能在血管老化过程中扮演着重要角色，本发明的奥美沙坦的用途是其能够延缓血管平滑肌细胞衰老，具有积极的临床意义。

附图说明

图1为对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组血管平滑肌细胞的SA-β-Gal染色图及平均值测定结果图；

图2为对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组血管平滑肌细胞的NAD⁺/NADH比值测定结果图；

图3为对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组血管平滑肌细胞的γ-H2AX染色图；

图4为对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组血管平滑肌细胞的EdU流式定量及平均值测定结果图；

图5为基因芯片检测及聚类图示对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组Top 8差异表达的miRNAs；

图6为采用qRT-PCR验证对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组Top 8差异表达的miRNAs；

图7为采用硫化测序PCR法检测对照组、博莱霉素诱导衰老组miR-665甲基化状态；

图8为TargetScan软件预测miR-665存在与SDC1 3′UTR(非翻译区)的结合域；

图9为双荧光素酶报告实验检测miR-665与SDC1的3′UTR(非翻译区)直接互补配对作用关系；

图10为qRT-PCR和免疫印迹法测定对照组、博莱霉素诱导衰老组SDC1表达；

图11为对照组、博莱霉素诱导衰老组、奥美沙坦干预组及奥美沙坦干预联合miR-665过表达或SDC1过表达/干扰组血管平滑肌细胞的SA-β-Gal染色图及平均值测定结果图；

图12为对照组、博莱霉素诱导衰老组、奥美沙坦干预组及奥美沙坦干预联合miR-665过表达或SDC1过表达/干扰组血管平滑肌细胞的NAD⁺/NADH比值测定结果图；

图13为对照组、博莱霉素诱导衰老组、奥美沙坦干预组及奥美沙坦干预联合miR-665过表达或SDC1过表达/干扰组血管平滑肌细胞的γ-H2AX染色图；

图14为对照组、博莱霉素诱导衰老组、奥美沙坦干预组及奥美沙坦干预联合miR-665过表达或SDC1过表达/干扰组血管平滑肌细胞的EdU流式定量及平均值测定结果图；

图15为奥美沙坦延缓血管平滑肌细胞衰老的示意图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

1、奥美沙坦延缓血管平滑肌细胞衰老

实验分组：

①对照组：未经干预的HA-VSMCs(人血管平滑肌细胞)；

②博莱霉素诱导衰老组：HA-VSMCs经博莱霉素干预48h；

③奥美沙坦干预组：HA-VSMCs经奥美沙坦预处理2h后联合博莱霉素干预48h。

用上述3个实验分组来构建细胞衰老模型。实验方法：用SA-β-Gal染色、NAD⁺/NADH比值测定、γ-H2AX荧光染色测定DNA损伤情况、EdU流式定量测定细胞增殖能力指标评价细胞衰老。

结果如图1-4所示：博莱霉素干预可使SA-β-Gal蓝染阳性细胞增多；NAD⁺/NADH比值增高；γ-H2AX染色示DNA损伤增多；EdU流式定量示细胞增殖能力下降，提示博莱霉素干预可诱导VSMC衰老。而联合奥美沙坦干预后SA-β-Gal蓝染阳性细胞减少；NAD⁺/NADH比值下降；γ-H2AX染色示DNA损伤减少；EdU流式定量示细胞增殖能力增强，提示奥美沙坦可延缓VSMC衰老。注：BLM，博莱霉素；OMST，奥美沙坦；SA-β-Gal，衰老相关β半乳糖苷酶；*P<0.05。

此部分所涉及的实验方法及步骤如下：

1.1细胞培养

人主动脉血管平滑肌细胞(HA-VSMCs)，购自ATCC(CRL-1999)。细胞在含10％胎牛血清(Gibco)的F-12K培养基(ATCC)中培养。培养基中补充0.05mg/mL抗坏血酸，0.01mg/mL胰岛素，0.01mg/mL转铁蛋白，10ng/mL***钠、0.03mg/mL内皮细胞生长添加剂(ECGS)、10mM羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和10mM三(羟甲基)-甲基氨基-乙基磺酸(TES)。HA-VSMCs培养、传代(少于3-5代)，各实验组处理情况如下：博莱霉素诱导衰老组，用博莱霉素(0.5μg/ml)对HA-VSMCs处理48h，诱导衰老；奥美沙坦干预组，奥美沙坦(2mM)在博莱霉素干预前加入HA-VSMCs预处理2h；对照组，HA-VSMCs正常培养。培养基每2天更换一次。

1.2衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

SA-β-gal是鉴定衰老细胞的生物学标志物。3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于6孔板中，待细胞生长至50％时，用PBS清洗两次后，4％多聚甲醛固定5min，然后用SA-β-gal染色液(C0602，碧云天生物科技)染色。随机选取4个视野在显微镜下观察并计数胞浆内有蓝染物质的细胞(SA-β-gal阳性细胞)的百分数，判断细胞哀老的情况。

1.3NAD⁺/NADH比值测定

NAD⁺/NADH是细胞能量代谢所必需的辅酶，其水平直接影响着细胞的节律、衰老、癌变和死亡等重大生命过程。衰老细胞中NAD⁺/NADH的比值升高。WST-8法行NAD⁺/NADH比值测定(NAD⁺/NADH检测试剂盒，上海碧云天生物科技公司)。3-5代1*10⁶个HA-VSMCs接种于6孔板中，HA-VSMCs经各种干预后加入200μl的NAD⁺/NADH提取液，12,000g，4℃离心5-10min，取上清作为待测样品。根据标准曲线计算细胞样品中的NAD⁺和NADH的浓度。

1.4γ-H2AX免疫荧光检测

衰老细胞中持续的DNA损伤反应导致衰老DNA损伤聚集，这一过程可通过γ-H2AX共定位被鉴定出来。3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于置有爬片的6孔板中，HA-VSMCs经干预后4％多聚甲醛固定，0.2％TritonX-100渗透后5％BSA工作液室温封闭2h。γ-H2AX抗体(1：200)孵育细胞4℃过夜，FITC标记的二抗室温避光孵育细胞2h，DAPI室温染色10min。滴加抗荧光猝灭封片剂，指甲油封片，共聚焦显微镜下观察(避光)。

1.5EdU细胞增殖流式检测

衰老细胞增加了AMP/ADP：ATP和NAD⁺/NADH的比值，激活了AMPK，进而增强细胞周期G1期阻滞，同时伴有细胞增殖能力减弱。3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于6孔板中，HA-VSMCs经各种干预。每孔更换细胞培养液为配制好的EdU培养基，孵育2h。收集细胞至流式管中，先后加入4％多聚甲醛固定、2mg/ml甘氨酸中和、0.5％TritonX-100渗透并孵育。加入1XApollo染色反应液后，再次0.5％TritonX-100渗透，即刻行流式细胞仪(BDBiosciences)检测。

2、miR-665为奥美沙坦干预衰老血管平滑肌细胞的差异表达miRNA之一

此部分对对照组、博莱霉素诱导衰老组和奥美沙坦干预组HA-VSMCs行基因芯片检测并行聚类分析，图5所示：三组两两相比存在多个差异表达miRNAs，选取Top 8差异表达miRNAs，包括has-miR-1267、has-miR-665、has-miR-4742-3p、has-miR-193a-3p、has-miR-5579-3p、has-miR-3133、has-miR-4517、has-miR-942-3p。采用qRT-PCR对8个差异表达miRNAs进行验证，如图6所示：衰老细胞中miR-665表达上调，而miR-193a-3p、miR-3133、miR-4517和miR-942-3p表达下调；然而奥美沙坦仅逆转了miR-665和miR-3133的表达。值得注意的是，miR-665比miR-3133产生更明显的变化，因此我们选择miR-665进行进一步研究。注：BLM，博莱霉素；OMST，奥美沙坦；**与对照组相比P<0.05，***与对照组相比P<0.01，^#与博莱霉素诱导衰老组相比P<0.05，^##与博莱霉素诱导衰老组相比P<0.01。

此部分所涉及的实验方法及步骤如下：

2.1miRNA生物芯片

首先用TRIzol从HA-VSMCs中提取总RNA，进一步用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)高效纯化。紫外分光光度仪上测RNA浓度。按照miRCURY^TMLNA Array(Exiqon,Denmark)microRNAs检测方法，使用by miRCURY^TMPower labeling kit对细胞样品的总RNA进行标记，标记后的样本RNA在含有miRNAs探针的miRCURY^TMLNA Array中进行杂交。杂交后，采用GenePix4000B芯片扫描仪(Axon,USA)读取芯片图像的原始信号强度进行数据分析。

2.2miRNA芯片数据分析

芯片结果采用GeneChip Scanner 3000(Affymetrix)进行扫描，用CommandConsole software(version 4.0；Affymetrix)读取原始数据。归一化处理后，两组间差异表达miRNAs筛选采用Fold-change(表达差异倍数>2.0)以及T-test检验(p<0.05)统计学方法进行。将筛选得到的不同组间的差异表达miRNAs通过聚类图进行直观的图形展示。应用TargetScan数据库软件(http://targetscan.org/)预测差异表达miRNAs靶基因。

2.3实时定量PCR

检测差异表达之miRNAs表达水平，收集培养的HA-VSMCs，依次利用裂解液和配置的缓冲液提取总RNA。紫外分光光度仪上测RNA浓度，500ng RNA用第一链合成试剂盒反转录成cDNA。采用染料法(SYBR Green I)用ABI Prism 7900实时定量PCR系统(AppliedBiosystems)进行Real-time定量PCR分析，U6用作内参。所有引物由引物设计软件3.0(Applied Biosystems)设计并由Invitrogen公司合成。

3、异常甲基化是miR-665表达差异的原因

为了验证博莱霉素诱导的衰老HA-VSMCs中高表达的miR-665是否与异常甲基化相关，硫化测序PCR法检测对照组与博莱霉素诱导衰老组miR-665启动子区域CpG岛异常甲基化。如图7所示：与对照组相比，衰老HA-VSMC中miR-665甲基化状态减少(35.38％vs.69.23％)。提示衰老HA-VSMCs中存在miR-665异常甲基化(去甲基化水平增多)。注：BLM，博莱霉素。

此部分所涉及的实验方法及步骤如下：

硫化测序PCR(BSP)

首先用TRIzol从HA-VSMCs中提取基因组DNA，然后用EZ DNA Metylation-Gold试剂盒(Zymo Research)进行亚硫酸氢盐硫化处理。用“MethPrimer”(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi)设计特异性miR-665甲基化引物进行扩增，扩增片段克隆至Pgemt Easy vector(Promega)，随机选择5个克隆进行测序。用QUMA(http://quma.cdb.riken.jp/top/index.html)计算甲基化百分率。

4、奥美沙坦通过miR-665/SDC1信号通路延缓血管平滑肌细胞衰老

此部分包括以下两方面：

①Syndecan-1(SDC1)为miR-665下游靶基因，且在博莱霉素诱导的衰老HA-VSMCs中表达下调

首先，应用生物信息学(TargetScan)预测miR-665下游靶基因，存在多个候选靶基因，研究已证实SDC1与老化及细胞衰老相关，因此选择SDC1作为后续研究的假定靶基因。图8显示：miR-665存在与SDC1 3′UTR(非翻译区)的结合域。其次，应用双荧光素酶报告实验证实miR-665可与SDC1的3′UTR直接互补配对。在HEK293细胞中联合转染miR-665mimic/inhibitor和野生型/突变型SDC1报告质粒，结果如图9显示：在野生型报告质粒中，miR-665mimic(过表达)减少荧光素酶活性、miR-665inhibitor(干扰)增加荧光素酶活性；而在突变型报告质粒中，miR-665mimic/inhibitor未改变荧光素酶活性。最后，图10显示：qRT-PCR及免疫印迹证实与对照组相比，博莱霉素诱导衰老HA-VSMCs中SDC1表达下调。注：BLM，博莱霉素；*P<0.05。

②奥美沙坦延缓HA-VSMC衰老通过miR-665/SDC1信号通路

分别通过miR-665过表达、SDC1过表达/干扰及联合干预后奥美沙坦处理博莱霉素诱导的衰老HA-VSMC，用SA-β-Gal染色、NAD⁺/NADH比值测定、γ-H2AX荧光染色测定DNA损伤情况、EdU流式定量测定细胞增殖能力指标评价细胞衰老，观察奥美沙坦延缓HA-VSMC衰老的机制。结果如图11-14所示：miR-665过表达及SDC1干扰均可抑制奥美沙坦的延缓HA-VSMC衰老作用；而SDC1过表达可逆转miR-665的抑制奥美沙坦延缓HA-VSMC衰老的作用。注：BLM，博莱霉素；OMST，奥美沙坦；*P<0.05。

此部分所涉及的实验方法及步骤如下：

4.1免疫印迹法

检测miR-665下游靶基因SDC1蛋白表达水平。细胞利用蛋白提取液收取，15-30μg蛋白样品，4％-20％SDS-PAGE电泳，100V转移1h至硝酸纤维素薄膜，放入封闭液中37℃封闭1h；一抗(SDC1 1:2000，abcam)4℃过夜。反复洗膜后，将膜与辣根过氧化物偶联的二抗孵育，室温轻摇1h，洗膜后，用免疫印迹图像分析仪(model GS-700,Bio-Rad Laboratories,Inc.)观察，用图像分析软件测定各条带吸光度值作定量分析。β-actin用作内参。

4.2.实时定量PCR

检测SDC1表达水平，收集培养的HA-VSMCs，依次利用裂解液和配置的缓冲液提取总RNA。紫外分光光度仪上测RNA浓度，500ng RNA用第一链合成试剂盒反转录成cDNA。采用染料法(SYBR Green I)用ABI Prism 7900实时定量PCR系统(Applied Biosystems)进行Real-time定量PCR分析，GAPDH用作内参。

4.3.双荧光素酶报告

设计及合成包含miR-665结合位点的靶基因SDC1 3′-UTR片段，将其***至含荧光素报告基因的pmirGLO载体(Promega Corporation)中，构建成报告质粒(野生型和突变型)。3-5代2*10⁴个HA-VSMCs转染前一天传代至24孔板，第二天细胞生长约50％-60％，用Lipofectamin 2000进行50nM miR-665mimic/miR-665inhibitor(设立对照)和0.5g 3′-UTR野生型或突变型荧光报告质粒联合转染。48h后用双荧光酶素报告系统(Promega,Corporation)进行分析。

4.4.细胞转染

细胞载染包括miR-665过表达质粒、SDC1小干扰RNA(siSDC1)和阴性对照(miR-NCor siNC)(广州锐博生物科技有限公司)，以及SDC1过表达质粒(pcDNA3.1/SDC1，北京OriGene生物科技有限公司)。3-5代2*10⁵个HA-VSMCs转染前一天传代至6孔板，第二天细胞生长约50％-60％，用Lipofectamin 2000进行单独或不同组合的联合转染，并设立对照。

4.5.衰老相关β半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色

3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于6孔板中，待细胞生长至50％时，用PBS清洗两次后，4％多聚甲醛固定5min，然后用SA-β-gal染色液(C0602，碧云天生物科技)染色。随机选取4个视野在显微镜下观察并计数胞浆内有蓝染物质的细胞(SA-β-gal阳性细胞)的百分数，判断细胞哀老的情况。

4.6.NAD⁺/NADH比值测定

WST-8法行NAD⁺/NADH比值测定(NAD⁺/NADH检测试剂盒，上海碧云天生物科技公司)。3-5代1*10⁶个HA-VSMCs接种于6孔板中，HA-VSMCs经各种干预后加入200μl的NAD⁺/NADH提取液，12,000g，4℃离心5-10min，取上清作为待测样品。根据标准曲线计算细胞样品中的NAD⁺和NADH的浓度。

4.7.γ-H2AX免疫荧光检测

3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于置有爬片的6孔板中，HA-VSMCs经干预后4％多聚甲醛固定，0.2％TritonX-100渗透后5％BSA工作液室温封闭2h。γ-H2AX抗体(1：200)孵育细胞4℃过夜，FITC标记的二抗室温避光孵育细胞2h，DAPI室温染色10min。滴加抗荧光猝灭封片剂，指甲油封片，共聚焦显微镜下观察(避光)。

4.8.EdU细胞增殖流式检测

3-5代5*10⁵个HA-VSMCs接种于6孔板中，HA-VSMCs经各种干预。每孔更换细胞培养液为配制好的EdU培养基，孵育2h。收集细胞至流式管中，先后加入4％多聚甲醛固定、2mg/ml甘氨酸中和、0.5％TritonX-100渗透并孵育。加入1XApollo染色反应液后，再次0.5％TritonX-100渗透，即刻行流式细胞仪(BD Biosciences)检测。

图15为奥美沙坦延缓血管平滑肌细胞衰老的示意图。miR-665表达上调及其异常甲基化是博莱霉素诱导HA-VSMC发生衰老的机制；奥美沙坦则是通过下调miR-665表达延缓HA-VSMC衰老。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。