阅读说明：本技术 一种化合物在制备治疗肾细胞癌药物的应用 (Application of compound in preparation of medicine for treating renal cell carcinoma ) 是由 肖伟 王红梅 李良 周军 刘莉娜 朱方方 顾莎莎 王振中 于 2019-08-27 设计创作，主要内容包括：本发明提出了1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防肾癌或前列腺癌的药物中的应用。本发明通过实验表明,1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖体外可以明显降低Renca肾癌、RM-1前列腺癌的细胞活性,体内可降低其荷瘤小鼠的瘤重,证明其对2种肿瘤均有抑制作用,在两种肿瘤荷瘤小鼠中均检测到PD-L1的基因表达,因此可初步推定1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖可能主要是通过阻断PD1/PD-L1发挥其抗肿瘤作用。(The invention provides application of 1,2,3,4, 6-pentagalloylglucose, or an optical isomer, a racemate, a solvate or pharmaceutically acceptable salt thereof in preparing a medicament for treating or preventing renal cancer or prostate cancer. Experiments show that 1,2,3,4, 6-pentagalloyl glucose can obviously reduce the cell activity of Renca kidney cancer and RM-1 prostate cancer in vitro and can reduce the tumor weight of tumor-bearing mice in vivo, and the 1,2,3,4, 6-pentagalloyl glucose is proved to have an inhibition effect on 2 tumors and to detect the gene expression of PD-L1 in the two tumor-bearing mice, so that the 1,2,3,4, 6-pentagalloyl glucose can be preliminarily presumed to play an anti-tumor effect mainly by blocking PD 1/PD-L1.)

一种化合物在制备治疗肾细胞癌药物的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种化合物在制备治疗肾细胞癌药物的应用。

背景技术

肾癌是我国***最常见的恶性肿瘤，在西方国家肾癌被列入患病率前十名的恶性肿瘤。肾癌的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果，肾癌细胞对放、化疗具有高度抵抗性，而以白介素和干扰素为代表的传统免疫治疗在肾癌治疗过程中有效率极低且副作用大，使得肾癌的防治成为肿瘤领域研究的重点和难点。肾癌患者存在细胞免疫和体液免疫的异常，包括CD4+T细胞受损，CD8+T淋巴细胞及调节性T细胞缺乏，以及细胞因子分泌异常等。既往研究表明程序性死亡因子(PD-1)及程序性死亡因子配体(PD-L1)与细胞免疫和体液免疫密切相关。Pardoll研究显示PD-1及PD-L1能够导致免疫抑制性肿瘤微环境形成，使肿瘤细胞逃避机体免疫监视和杀伤，而阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤的免疫抑制，增强内源性抗肿瘤免疫效应。PD-1、PD-L1抑制剂在治疗多种恶性肿瘤中显现疗效，其中就包括肾癌。因此，寻找有效的PD-1、PD-L1抑制剂将成为肾癌新的治疗方法。

发明内容

有鉴于此，本发明旨在提出一种治疗或预防肾癌或***癌的药物。

具体地，本发明提出了一种1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备治疗或预防肾癌或***癌的药物中的应用。

具体地，所述药学上可接受的盐包括但不限于化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。

进一步地，所述治疗或预防肾癌或***癌的药物为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

具体地，根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述治疗或预防肾癌或***癌的药物包括但不限于注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂、喷剂、气雾剂。

进一步地，所述治疗或预防肾癌或***癌的药物还可以包括化学治疗剂或免疫治疗剂。其中，所述化学治疗剂或免疫治疗剂可以是除本发明的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖以外同样具有相应抗肿瘤作用的活性物质。

本发明还提出了一种1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐在制备PD-1/PD-L1抑制剂中的应用。

所述PD-1/PD-L1抑制剂可以是药剂学上所说的任何一种剂型，如口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

具体地，所述PD-1/PD-L1抑制剂包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

进一步地，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖结构如下：

上述式I结构的化合物、或其光学异构体、或其外消旋体、或其溶剂化物、或其药学上可接受的盐用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物/制剂的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余可以是其它具有类似作用或者发挥协同作用的活性成分、也可以是或进一步包括药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

本发明通过实验表明，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖体外可以明显降低Renca肾癌、RM-1***癌的细胞活性，体内可降低其荷瘤小鼠的瘤重，证明其对2种肿瘤均有抑制作用，在两种肿瘤荷瘤小鼠中均检测到PD-L1的基因表达，因此可初步推定1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖可能主要是通过阻断PD1/PD-L1发挥其抗肿瘤作用。

附图说明

图1为不同浓度1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对PD1/PD-L1结合的抑制率图。

具体实施方式

以下结合实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

其次，需要注意的是，本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。其它除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。

实施例1 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对肾癌细胞、***癌的影响1、实验材料

1.1药物及试剂：1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(MCE)；RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(GIBCO)；MTT(sigma)。

1.2细胞：Renca(CRL-2947，由ATCC购买)；RM-1细胞系(上海研生实业有限公司)。

1.3仪器和设备：电子天平(赛多利斯)；离心机(安徽中佳)；Flex station 3钙流工作站(MD)；倒置显微镜(OLYPUS)。

2、实验方法

2.1细胞培养

细胞传代接种与培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，当培养瓶中的细胞基本长满后(细胞保持在对数生长期)，弃去培养液，加入适量PBS溶液轻轻荡洗，弃去，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液1ml消化2-3分钟，加入完全培养基2ml终止胰酶的作用，将细胞转入离心管中，1000r，离心5min，弃去上清，加入完全培养基，小心吹打成单细胞。细胞自动计数仪计数，按照1×10⁵个/mL，每孔100μL接种于96孔细胞培养板中，边缘孔加100μL无菌水，继续于37℃、5％CO₂培养箱中培养18-20小时后进行造模、给药试验。

2.2分组及给药

将细胞胰酶消化后离心弃上清，细胞重悬计数后按照10000cell/孔接种至96孔板内，24h后加入终浓度为6.25、12.5、25、50、100uM的1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖，同时设置实验对照组，每个浓度均设置5个复孔，孵育24h。

2.3细胞活力测定

每组实验在计时结束前4h，每孔加入10ul MTT。继续培养4h后，小心吸尽上清，每孔加入150uL DMSO溶解结晶，待结晶溶解完全后，酶标仪下测定570nm波长处吸光度值，并计算存活率及IC50。

3、实验结果

1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖对各肿瘤细胞增殖的抑制效果实验结果见表1，由表中可以看出，1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖，对2种肿瘤细胞的增殖具有一定的抑制作用，且随着浓度的逐渐增加，肿瘤细胞的活力逐渐下降。根据公式计算得出对肾癌细胞和***癌的IC50分别为19.46uM、69.23uM。

表1 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对Renca、RM-1细胞活力的影响

与对照组比较，**p<0.01，*p<0.05

实验例2 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对PD-1/PD-L1体外结合的影响

1、实验材料

1.1药物及试剂：1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(MCE)；RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(GIBCO)；PD1/PD-L1 Binding Assay Kits(cisbio)。

1.2仪器和设备：电子天平(赛多利斯)；酶标仪(PE)。

2、实验方法

将药物用DMSO溶解至50mM作为储存液，实验前用试剂盒中稀释液稀释至30uM/mL，然后以此为高浓度，按三倍稀释依次稀释为30、10、3.33、1.11、0.37uM/mL共5个浓度，按照试剂盒操作说明顺序分别加入2uL已稀释的不同浓度的化合物、4uL Tag1-PD-L1 protein、4uL Tag2-PD1 protein，室温避光静置15min后，每孔加入10uL提前混匀的anti-Tag1-Eu3+和anti-Tag2-XL665，室温避光静置2h，于荧光酶标仪下检测各孔荧光值。

3、实验结果

如图1所示，随着给药浓度的增大，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对体外PD1/PD-L1结合的抑制率也不断增大，根据计算得出，其抑制率的IC₅₀为16.01uM。

实验例3 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对裸鼠移植肿瘤的抑制作用

1、实验材料

1.1药物及试剂

1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖(MCE)；RPMI1640(GIBCO)，胎牛血清(GIBCO)；PD1/PD-L1 Binding Assay Kits(cisbio)。

1.2动物和细胞

Renca(CRL-2947，由ATCC购买)；RM-1细胞系(上海研生实业有限公司)；裸鼠(扬州大学比较医学中心，SCXK(苏)2017-0007)。

1.3仪器

注射器(1mL，针号27)；无菌手术器械(包括手术刀、剪刀、镊子、持针器等)

2、实验方法

2.1细胞培养

肿瘤细胞传代接种与培养瓶中，于37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养，当培养瓶中的细胞基本长满后(细胞保持在对数生长期)，弃去培养液，加入适量PBS溶液轻轻荡洗，弃去，然后加入0.25％胰蛋白酶溶液1ml消化2-3分钟，加入完全培养基2ml终止胰酶的作用，将细胞转入离心管中，1000r，离心5min，弃去上清，加入完全培养基，小心吹打成单细胞。细胞自动计数仪计数，调整细胞浓度为所需细胞浓度混悬液，冰上保存备用。

2.2肿瘤模型的制备

裸鼠消毒背部皮肤，用左手拇指和食指拎起消毒过的皮肤，使皮肤与下方的肌肉分离，向拎起的皮肤皱褶中注射20ul充分涡旋的细胞悬液。如果在注射时遇到阻力，则注射角度不对，请及时改变进针方向。

2.3观察及实验分组

接种后每日观察肿瘤生长情况，在几周后，可见肿瘤生长，用游标卡尺测量肿瘤的最长纵径和最宽横径，肿瘤体积采用以下公式进行计算：0.5x长x宽2，待到肿瘤体积达到100mm³时，将裸鼠随机分为肿瘤模型组、低剂量组(25mg/kg)、中剂量组(50mg/kg)、高剂量组(100mg/kg)，每组至少10只，按10mL/kg体积给药，每天一次，连续给药15天，模型组给予等量生理盐水代替，末次给药后1h，脱臼处死鼠，小心剥离肿瘤组织，称重比较。

3、结果

实验结果显示，各种肿瘤在给予不同浓度1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖后，与模型对照组相比较，瘤重均有一定程度的改善，其中，中、高剂量组与模型组比较，具有统计学差异(*p<0.05；**p<0.01)。具体数据见表2。

表2 1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖对肿瘤细胞瘤重的影响

与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01。

根据实验可见，1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖体外可以明显降低Renca肾癌、RM-1***癌的细胞活性，体内可降低其荷瘤小鼠的瘤重，证明其对2种肿瘤均有抑制作用，在两种肿瘤荷瘤小鼠瘤体细胞中均检测到PD-L1的基因表达，而1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖在体外PD-1/PD-L1结合率检测中具有较好的结合率，可初步推测1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖主要是通过阻断PD1/PD-L1发挥其抗肿瘤作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。