阅读说明：本技术 氨基酸和氨甲环酸修饰的二酮哌嗪,其制备,活性及应用 (Amino acid and tranexamic acid modified diketopiperazine, preparation, activity and application thereof ) 是由 赵明 王玉记 张筱宜 彭师奇 吴靖 于 2018-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了下面结构的3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪。公开了它们的制备方法和其抗肿瘤、抗转移及抗炎作用,阐明了它们在制备抗肿瘤、抗转移及抗炎药物中的应用。<Image he="186" wi="700" file="DDA0001684352810000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses 3R- (indole-3-methyl) -6R- [4- (Ala-aminomethyl cycloamido n-butyl) ] -2, 5-diketopiperazine with the following structure, discloses a preparation method thereof, anti-tumor, anti-metastasis and anti-inflammatory effects thereof, and clarifies the application of the same in preparing anti-tumor, anti-metastasis and anti-inflammatory drugs)

氨基酸和氨甲环酸修饰的二酮哌嗪,其制备,活性及应用

技术领域

本发明涉及3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪。涉及它们的制备方法,涉及它们的抗肿瘤兼抗转移作用,涉及它们在制备抗肿瘤、抗转移及抗炎药物中的应用。本发明属于生物医药领域。

技术背景

近年来多项流行病学及相关研究结果，已证实多种肿瘤的发生及发展与炎症有关，占所有肿瘤的15％左右，通过抑制慢性炎症，可降低癌前病变患者的癌症发病和(或)复发的风险。肺癌是目前最常见的恶性肿瘤，在我国肺癌的高发病率及高死亡率均位于恶性肿瘤首位，有90％的肺癌患者死于肿瘤转移而非死于原发瘤，此前，发明人曾公开S,S-,R,R-,R,S-和S,R-四种构型的的二酮哌嗪在0.5μM浓度可抑制HCCLM3(高转移人肝癌细胞)迁移和侵袭。后来发明人又公开R,R-构型的二酮哌嗪在最低有效剂量为5μmol/kg/天的剂量时可抑制C57BL/6小鼠的肿瘤向肺转移、抑制ICR小鼠的肿瘤增殖及对ICR小鼠具有抗炎作用。为了降低最低有效剂量，发明人对R,R-构型的二酮哌嗪的丁氨基展开了各种修饰。经过3年探索，发现用氨基酸L-Ala酰化R,R-构型的二酮哌嗪的4-氨基正丁基可使抗肿瘤、抗转移和抗炎的最低有效剂量降至0.5μmol/kg/天。最低有效剂量降低10倍表明，这种结构修饰有突出的技术效果。根据这些发现，发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下面结构的3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(4-TXA(Ala)-氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪。

本发明的第二个内容是提供3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪的制备方法,该方法包括：

(1)D-Trp-OBzl与Boc-D-Lys(Cbz)反应得到Boc-D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl；

(2)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M)Boc-D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl脱除Boc得到D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl；

(3)Boc-D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl在弱碱性环境下自动环合生成3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)；

(4)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)经催化氢解脱除苄氧羰基得到3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)；

(5)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)与Boc-氨甲环酸反应生成3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)；

(6)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)脱除Boc得3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)；

(7)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)与Boc-L-Ala缩合得化合物3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5)；

(8)冰浴下在氯化氢的乙酸乙酯溶液中(4M)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5)脱除Boc得3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6)。

本发明的第三个内容是评价3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪对S180小鼠肿瘤生长的抑制作用、抑制C57BL/6小鼠抗肺癌转移活性及对ICR小鼠的抗炎活性。

附图说明

图1.3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪的合成路线.i)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC),N-羟基苯并三氮唑(HOBt),N-甲基吗啉(DMM),四氢呋喃(THF)；ii)4N氯化氢-乙酸乙酯试剂；iii)乙酸乙酯,5％碳酸氢钠；iv)甲醇,N,N-二甲基甲酰胺(DMF),Pd/C,H₂；v)N,N-二环己基碳二亚胺(DCC),N-羟基苯并三氮唑(HOBt),N-甲基吗啉(DMM),无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备Boc-D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl

将1.930g(5mmol)Boc-D-Lys(Cbz)混悬于100mL干燥四氢呋喃(THF)，在冰浴下依次向悬浮液中加入0.747g(5.5mmol)的1-羟基苯并三氮唑(HOBt)及1.243g(6.0mmol)的N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)，然后搅拌30分钟。之后加入1.620g(5.2mmol)D-Trp-OBzl·HCl。反应混合物逐滴加入N-甲基吗啉(NMM)调节pH值至8-9。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，然后在室温下搅拌反应12h。反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残余物用150mL的乙酸乙酯溶解。分别用饱和5％硫酸氢钾水溶液、饱和氯化钠水溶液各萃洗三次。乙酸乙酯层用无水硫酸钠干燥12小时。过滤，减压浓缩至干。得到黄色糖浆经硅胶柱层析分离纯化(乙酸乙酯:石油醚＝1:3～1:1)，得到2.423(73.2％)g标题化合物，为粉红色固体粉末。ESI-MS(m/e):657[M+H]⁺。

实施例2制备D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl

冰浴搅拌下1.9g(2.5mmol)Boc-D-Lys(Cbz)-D-Trp-OBzl与40mL氯化氢的乙酸乙酯(4M)缓慢混合。得到的溶液在冰浴中搅拌3小时。之后，反应混合物减压抽干，残留物用干燥乙酸乙酯充分搅匀后抽干，重复三次。残留物再用无水***磨洗三遍得到1.7g(93％)标题化合物，为深红色固体粉末。ESI-MS(m/e):557[M+H]⁺。

实施例3制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)

将1.7g(3.1mmol)D-Lys(Cbz)-D-Trp-Obzl用100mL乙酸乙酯溶解。得到的溶液用浓度为5％的碳酸氢钠水溶液洗三次，乙酸乙酯层减压浓缩并于室温搅拌12小时，待白色固体充分析出后过滤得0.76g(46.5％)标题化合物。ESI-MS(m/e):449[M+H]⁺。

实施例4制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)

于0.900g(2mmol)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-苄氧羰基氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(1)加入10mL甲醇与10mL的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶解，加入90mg Pd/C至上述溶液中，抽尽茄瓶中的空气，通入氢气室温搅拌反应12小时。滤去Pd/C，滤液减压浓缩至干得到白色固体粉末0.600(95％)标题化合物。ESI-MS(m/e):315[M+H]⁺。

实施例5制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)

采用实施例1的方法从0.668g(2.6mmol)Boc-氨甲环酸和0.813g(2.6mmol)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-(4-氨基正丁基)-2,5-二酮哌嗪(2)得到0.77g(53.8％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):554[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝10.88(s,1H),8.05(s,1H),7.94(s,1H),7.58(d,J＝7.8Hz,1H),7.50(t,J＝4.8Hz,1H),7.30(d,J＝7.8Hz,1H),7.03(s,1H),7.02(m,1H),6.93(t,J＝7.4Hz,1H),6.81(t,J＝5.6Hz,1H),4.11(m,1H),3.50(m,1H),3.25(dd,J₁＝4.0Hz,J₂＝14.2Hz,1H),3.00(dd,J₁＝4.0Hz,J₂＝14.4Hz,1H),2.76(m,4H),1.97(m,1H),1.68(m,4H),1.37(s,9H),1.27(m,3H),0.96(m,3H),0.83(m,2H),0.58(m,3H)。

实施例6制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)

按照实施例2的方法，从0.75g(1.35mmol)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-TXA-氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(3)得到0.65g(98.3％)标题化合物，为淡黄色固体。ESI-MS(m/e):454；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝10.94(s,1H),8.04(s,1H),8.02(br,3H),7.94(s,1H),7.58(m,2H),7.31(d,J＝8.0Hz,1H),7.04(s,1H),7.03(m,1H),6.93(t,J＝7.2Hz,1H),4.11(m,1H),3.50(m,1H),3.24(dd,J₁＝3.4Hz,J₂＝14.2Hz,1H),3.02(dd,J₁＝3.4Hz,J₂＝14.4Hz,1H),2.76(m,2H),2.63(m,2H),2.02(m,1H),1.76(m,4H),1.53(m,1H),1.32(m,2H),0.97(m,5H),0.60(m,3H)。

实施例7制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5)

按照实施例1的方法，从0.38g(2.1mmol)Boc-Ala和0.90g(1.8mmol)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(氨甲环酸氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(4)得到0.72g(62.1％)标题化合物，为淡黄色固体粉末。ESI-MS(m/e):625[M+H]⁺；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝10.90(s,1H),8.05(s,1H),7.94(s,1H),7.70(m,1H),7.57(d,J＝7.8Hz,1H),7.56(m,1H),7.30(d,J＝7.8Hz,1H),7.03(s,1H),7.02(m,1H),6.92(m,1H),6.85(d,J＝6.9Hz,1H),4.10(m,1H),3.81(m,1H),3.49(m,1H),3.25(dd,J₁＝4.0Hz,J₂＝15.0Hz,1H),3.00(dd,J₁＝4.0Hz,J₂＝15.0Hz,1H),2.89(m,2H),2.74(m,2H),1.99(m,1H),1.69(m,4H),1.37(s,9H),1.30(m,3H),1.15(d,J＝6.6Hz,3H),0.97(m,3H),0.84(m,2H),0.59(m,3H)。

实施例8制备3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(6)

按照实施例2的方法，从0.098g(0.16mmol)3R-(吲哚-3-甲基)-6R-[4-(Boc-Ala-氨甲环酰氨基正丁基)]-2,5-二酮哌嗪(5)得到0.065g(73.6％)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e):525[M+H]⁺；IR(cm^-1):3216,3053,2925,2853,1657,1549,1454,1328,1260,1098,1009,743；¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm＝10.95(s,1H),8.51(s,1H),8.24(s,3H),8.05(s,1H),7.94(m,1H),7.57(m,2H),7.29(d,J＝8.0Hz,1H),7.03(s,1H),7.01(m,1H),6.92(m,1H),4.10(m,1H),3.80(m,1H),3.49(m,1H),3.24(dd,J₁＝3.4Hz,J₂＝14.4Hz,1H),2.99(m,3H),2.74(m,2H),2.00(m,1H),1.71(m,4H),1.35(d,J＝6.6Hz,3H),1.28(m,3H),0.91(m,5H),0.59(m,3H)。

实验例1评价化合物6的抗肿瘤增殖活性

1)化合物6用生理盐水溶解,阿霉素用生理盐水溶解作为阳性对照,生理盐水作为阴性对照；

2)化合物6的口服剂量为0.5μmol/kg，生理盐水的口服剂量为0.2mL/20g，阿霉素腹腔注射剂量为2μmol/kg。肿瘤接种5天后开始给药，连续给药10天，共给药10次。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)瘤源为小鼠S180肉瘤，购自北京大学医学部动物实验中心，自行传代维持。

5)无菌条件下抽取接种生长旺盛的S180腹水瘤瘤液，用生理盐水稀释成(1:2)的液体充分混合，将肿瘤细胞悬液用新鲜配制的0.2％台盼蓝染色，混匀后按白细胞计数方法计数，染蓝色者为死细胞，不染色者为活细胞。按细胞浓度＝4大方格内活细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝细胞数/mL计算细胞浓度。按细胞存活率＝活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100％计算细胞存活率。

将存活率大于90％的瘤液用匀浆法制备成2.0×10⁷个/mL的细胞悬液，于鼠腋皮下接种，0.2mL/只，制造S180荷瘤小鼠。肿瘤接种5天后给药。治疗组小鼠每日口服化合物6剂量为0.5μmol/kg。空白组小鼠每日口服生理盐水剂量为0.2mL/20g。阳性对照组小鼠每日腹腔注射阿霉素剂量为2μmol/kg。连续给药十天，第十一天称小鼠体重，***麻醉，脱颈椎处死小鼠，然后用镊子固定小鼠右腋肿瘤生长部位，剪开皮肤，暴露肿瘤，钝性剥离，称重。实验数据采用t检验和方差分析，瘤重以(均值±SD g)表示。结果见表1。由表1可以看出，在0.5μmol/kg口服剂量下，化合物6可有效地抑制小鼠的瘤重生长。本发明有显著的技术效果。

表1化合物6的抗肿瘤活性

a)与生理盐水组比p<0.05；n＝12.

实验例2评价化合物6的抗肿瘤转移活性

本测定模型用Lewis小鼠肺癌细胞(LLC,购自ATCC)接种，选用DMEM培养基(含10％经灭活的胎牛血清,1×10⁵U/L青霉素和100mg/L链霉素),按照贴壁细胞培养方法每两天传代一次，富集细胞。待细胞生长状态良好并处于对数生长期时消化细胞，用生理盐水调整细胞密度至1×10⁷个/mL。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。取近交系C57BL/6雄性小鼠(SPF级,体重20±2g)，左手固定小鼠。用75％乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1mL无菌注射器往小鼠腋部皮下注射LLC肿瘤细胞悬液，每只小鼠注射0.2mL。小鼠接种10天后，长出直径约4-5mm的肿瘤即为瘤源。接种10天的Lewis肺癌荷瘤小鼠***麻醉，脱颈椎处死。用75％乙醇浸泡10min，消毒，在超净工作台上剥离瘤体。选择生长良好的肿瘤组织在无菌平皿中剪碎，置于玻璃制造的组织匀浆器内。按瘤块重比生理盐水体积为1比3(g比mL)的比例加温度为4℃的生理盐水，轻轻研磨制成细胞悬液。细胞悬液过200目细胞筛制单细胞悬液。用生理盐水调单细胞悬液的细胞密度至1.5×10⁷个/mL。胎盘蓝染色，使活细胞计数>95％。左手固定近交系C57BL/6雄性小鼠，用75％的乙醇对小鼠右前肢腋窝皮肤消毒。右手持1mL无菌注射器于小鼠腋部皮下注射瘤细胞悬液，每只注射0.2mL。接种10天后小鼠长出直径4-5mm的肿瘤，按测得的肿瘤体积将接种小鼠随机分组。每组12只小鼠。接种肿瘤的第11天小鼠或腹腔注射公认的抗肿瘤转移肽RGDS的生理盐水溶液(剂量为20μmol/kg/天)或口服化合物6的生理盐水溶液(剂量为0.5μmol/kg/天)或口服生理盐水(剂量为10mL/kg/天)，每天给1次药，连续给药12天，每隔两天测量并记录肿瘤体积。最后一次给药的次日测量瘤体积，***麻醉脱颈椎处死，取小鼠的肿瘤称重，取小鼠的肺并计算肿瘤肺部转移的瘤节数。用t检验对数据进行统计分析。结果见表2。在0.5μmol/kg/天(即最低有效剂量降低10倍)剂量下化合物6不仅有效地抑制肿瘤肺转移，而且活性与20μmol/kg/天剂量的RGDS没有显著性差异。这些数据表明，本发明有显著的技术效果。

表2化合物6的抗肿瘤转移活性

a)与生理盐水比p<0.05；n＝12

实验例3评价化合物6的抗炎活性

1)化合物6用生理盐水溶解；阿司匹林用生理盐水溶解作为阳性对照；生理盐水作为阴性对照。

2)化合物6的口服剂量为0.5μmol/kg，生理盐水的口服剂量为0.2mL/20g，阿司匹林口服剂量为1.11mmol/kg。均为每日单次给药。

3)实验动物为ICR雄性小鼠(清洁级)，体重20±2g，每组12只小鼠。

4)ICR雄性小鼠静息一天后，随机分组，每组12只。采用序贯法按照药物相应剂量对各组小鼠灌胃给药。给药30分钟后按照给药顺序用移液枪在小鼠右耳外廓均匀涂抹30μL二甲苯，使造模完成。涂完二甲苯后，可观察到小鼠右耳变为红色，然后变白变厚。造模2小时后将小鼠摘眼球取血并断颈处死，将小鼠左右两耳沿耳根剪下，让两耳重合叠放，用直径为7mm的电动打孔器在两耳的相同位置打孔，取圆形耳片，分别称取重量，按以下公式计算耳肿胀度：

耳肿胀度＝右耳原片重量-左耳原片重量

实验数据采用t检验和方差分析。结果见表3。由表2可以看出，在0.5μmol/kg口服剂量下，化合物6具有显著的抗炎活性。本发明有显著的技术效果。

表3化合物6的抗炎活性

a)与生理盐水组比p<0.05；n＝12。