阅读说明：本技术 Ldv修饰的s,r-七环醛，其合成,活性和应用 (LDV modified S, R-heptacyclic aldehyde, and synthesis, activity and application thereof ) 是由 赵明 蒋雪云 桂琳 彭师奇 薛双悦 于 2018-06-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了下式S,R-七环醛-Leu-Asp-Val,公开了它的制备方法,公开了它的抗静脉血栓活性,公开了它的抗动脉血栓活性,公开了它抑制体内GPIIb/IIIa表达的活性,公开了它抑制体内P-选择素表达的活性。因而本发明公开了它在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备GPIIb/IIIa拮抗剂中的应用和在制备P-选择素拮抗剂中的应用。<Image he="356" wi="700" file="DDA0001683425280000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention discloses the following formula S, R-heptacyclic aldehyde-Leu-Asp-Val, discloses its preparation method, discloses its anti-arterial thrombosis activity, discloses its activity for inhibiting in vivo GPIIb/IIIa expression and discloses its activity for inhibiting in vivo P-selectin expression, so that the invention discloses its application in preparing anti-arterial thrombosis medicine, in preparing anti-venous thrombosis medicine, in preparing GPIIb/IIIa antagonist and in preparing P-selectin antagonist)

LDV修饰的S,R-七环醛，其合成,活性和应用

技术领域

本发明涉及S,R-七环醛-Leu-Asp-Val，涉及它的制备方法，涉及它的抗动脉血栓活性，涉及它的抗静脉血栓活性，涉及它抑制体内糖蛋白IIb/IIIa(IIb/IIIa)表达的活性，涉及它抑制体内P-选择素表达的活性。因而本发明涉及它们在制备抗动脉血栓药物中的应用、在制备抗静脉血栓药物中的应用、在制备GPIIb/IIIa拮抗剂中的应用和在制备P-选择素拮抗剂中的应用。本发明属于生物医药领域。

背景技术

血栓形成是缺血性心脏病,缺血性中风和静脉血栓的共同病理。在全球范围内,缺血性心脏病和缺血性中风导致的死亡人数占全部因病死亡人数的1/4。而静脉血栓则是不发达国家,中等发达国家和高度发达国家主要的疾病负担。血栓可以使得一系列相关的疾病恶化,例如极少出现的生物材料管的堵塞性血栓可以为反复换管,或接受溶栓治疗或长期接受抗凝治疗的患者带来难以预料的后果,可以引起接受经皮冠状动脉内介入治疗后患者再栓塞,可以伴随肝素诱导的血小板减少症状,以及弯曲的冠状动脉血栓可以引起急性冠状综合症。此外,血栓形成是相关疾病的合并症,例如大块的脑静脉血栓是患有癫痫病的早期怀孕妇女的合并症,以及支架血栓是经皮冠状动脉内介入治疗患者的严重合并症。可见,发明新型抗血栓药物具有临床重要性。

β-咔啉是抑制血栓的重要药效团。然而β-咔啉的有效剂量,例如3S-1,2,3,4-四氢-β-咔啉-3-羧酸抗血栓的有效剂量就高达5μmol/kg,仍然有待降低。发明人假设,两个β-咔啉药效团融合,例如1个(S)-1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸和1个(R)-1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸经分子间缩合为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，后酸解为(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(简称S,R-七环醛)。S,R-七环醛应有强的抗血栓活性。发明人进一步假设,这种新型七环醛的醛基连接Leu-Asp-Val应有更强的抗血栓活性。根据这个假设,发明人提出了本发明。

发明内容

本发明的第一个内容是提供下式的S,R-七环醛-Leu-Asp-Val。

本发明的第二个内容是提供S,R-七环醛-Leu-Asp-Val的合成方法，该方法包括：

(1)将L-色氨酸苄酯在三氟醋酸的催化下与1,1,3,3-四甲氧基丙烷进行Pictet-Spengler缩合,得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)；

(2)在甲醇溶液中1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯在Pd/C催化下,与H₂反应脱去苄酯得到1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)；

(3)在二环己基碳二亚胺和N-羟基苯并三氮唑存在下,1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸在无水N,N-二甲基甲酰胺中进行分子间缩合,得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(3)；

(4)在冰醋酸、水和浓盐酸的存在下，加入(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，酸解反应得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4)；

(5)以二环己基碳二亚胺和N-羟基苯并三氮唑为催化剂，采用液相缩合法合成HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl；

(6)在氰基硼氢化钠存在的条件下，HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl和(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，发生氨化还原，得到(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5)；

(7)在甲醇溶液中，(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮，pH＝13条件下，生成(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp-Val]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮,即S,R-七环醛-Leu-Asp-Val(6)

本发明的第三个内容是评价S,R-七环醛-Leu-Asp-Val抗静血栓形成的活性。

本发明的第四个内容是评价S,R-七环醛-Leu-Asp-Val抗动血栓形成的活性。

本发明的第五个内容是评价S,R-七环醛-Leu-Asp-Val抑制体内GPIIb/IIIa表达的活性。

本发明的第六个内容是评价S,R-七环醛-Leu-Asp-Val抑制体内P-选择素表达活性。

附图说明

图1.(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp-Val]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮的合成路线。

i)二氯甲烷，三氟乙酸，1,1,3,3-四甲氧基丙烷；ii)钯碳，氢气，甲醇；iii)N-羟基苯并三氮唑，二环己基碳二亚胺，N-甲基吗啉，N,N-二甲基甲酰胺；iv)冰醋酸，浓盐酸，水，冰浴；v)二环己基碳二亚胺，N-羟基苯并三氮唑，N-甲基吗啉，四氢呋喃；vi)氯化氢乙酸乙酯,冰浴；vii)氰基硼氢化钠vii)4N NaOH，甲醇，冰浴。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。

实施例1制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸苄酯(1)

冰浴条件下，向150mL的二氯甲烷中，依次加入5mL的1,1,3,3-四甲氧基丙烷和5mL的三氟醋酸，在冰水浴中活化40min。然后加入5.00g(17.00mmol)L-色氨酸苄酯。溶液呈红棕色。反应混合物先在冰浴下搅拌1h，再室温搅拌12h。反应液用饱和碳酸氢钠水溶液萃洗6次，会有大量的气泡生成。再加入饱和氯化钠水溶液萃洗3次。收集二氯甲烷层，加入无水硫酸钠干燥2小时。常压过滤，滤液减压浓缩后用硅胶柱层析进行纯化(v:v；石油醚：乙酸乙酯＝1:1)，得5.39g(13.68mmol)标题化合物，为黄色油状物。产率为81％。ESI-MS(m/e)393[M+H]^-

实施例2制备1-(2,2-二甲氧基乙基)-2,3,4,9-四氢-β-咔啉-3-羧酸(2)

向5.39g(13.68mmol)化合物1和100mL甲醇溶液中加入540mg的Pd/C，通入H₂，室温搅拌反应4h。滤去Pd/C，滤液减压浓缩得到3.34g(11.00mmol)标题化合物，为黄色油状物，产率80％。ESI-MS(m/e)：303[M-H]^-

实施例3制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-二甲氧乙基-2-基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(3)

将3.34g(11.00mmol)化合物2混悬于60mLN,N-二甲基甲酰胺中，在冰浴下依次往悬浮液中加1.49g(11.00mmol)N-羟基苯并三氮唑和2.72g(13.20mmol)二环己基碳二亚胺，然后用N-甲基吗啉将反应液的pH调至8-9。室温反应8小时。反应液减压过滤，滤液减压浓缩。再用100mL乙酸乙酯溶解，有白色固体析出或不溶解。再进行减压过滤，将滤液收集。得到的乙酸乙酯溶液依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次，5％硫酸氢钾水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次，饱和碳酸氢钠水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次；收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时后，减压过滤，收集滤液。减压除去溶剂，得到的黄色糖浆物经硅胶柱层析进行分离(v:v；石油醚:乙酸乙酯＝1:1)得670mg(1.17mmol)标题化合物，为黄色固体，产率为21％。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：11.00(d,J＝6.9Hz,2H),7.47(m,4H),7.11(m,4H),6.99(s,1H),5.23(s,1H),4.45(m,3H),4.19(s,1H),3.53(m,3H),4.19(s,1H),3.29(s,4H),3.21(s,3H),3.15(s,3H),3.10(s,3H),2.84(m,3H),2.19(s,2H)

实施例4制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[1-羰甲基]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(4)

冰浴条件下，将139mg(24.30mmol)化合物3分散于9ml冰醋酸中，并依次加入2ml水和1ml浓盐酸。冰浴条件下反应1小时。冰水浴条件下，用2N氢氧化钠水溶液，调节反应液pH值到7。反应液有大量的黄色固体析出。用30ml乙酸乙酯进行萃取，萃取三次，不溶物存在于乙酸乙酯层，合并乙酸乙酯相。再用饱和碳酸氢钠溶液进行萃洗，萃洗8次后合并乙酸乙酯相。在萃洗的过程中有大量气泡生成。再用无水硫酸钠干燥乙酸乙酯相2小时，减压过滤，收集滤液，减压旋干得105mg(21.87mmol)标题化合物，为黄色固体，产率90％。ESI-MS(m/e):479[M-H]^-

实施例5制备Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl

将2.00g(6.19mmol)的Boc-Asp(OBzl)-OH混悬于30mL无水四氢呋喃中，在冰浴下依次往悬浮液中加0.92g(6.81mmol)的N-羟基苯并三氮唑和1.40g(6.81mmol)二环己基碳二亚胺，冰浴搅拌30分钟。加2.58g(6.81mmol)Tos·Val-OBzl。反应混合物逐滴加入N-甲基吗啉调节pH至8～9。室温反应8小时，反应混合物过滤，滤液减压浓缩，残留物用60mL乙酸乙酯溶液溶解。得到的乙酸乙酯溶液依次用饱和碳酸氢钠水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次，5％硫酸氢钾水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次，饱和碳酸氢钠水溶液洗3次，饱和氯化钠水溶液洗3次；收集乙酸乙酯层，用无水硫酸钠干燥2小时后，减压过滤，收集滤液。减压浓缩滤液后得黄色油状化合物经硅胶柱层析分离(v:v；二氯甲烷：甲醇＝25:1)得到3.10g(6.04mmol)目标化合物，为无色固体，产率为98％。ESI-MS(m/e):513[M+H]⁺

实施例6制备HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl

冰浴下将4.68g(9.14mmol)Boc-Asp(OBzl)-Val-OBzl用50mL氯化氢的乙酸乙酯(4N)溶液溶解，冰浴下反应4小时。反应液减压浓缩，残留物用无水乙酸乙酯溶解，得到的溶液再减压浓缩。该操作重复3次。得到的黄色糖浆样物用无水***充分磨洗，得到3.92g(96％)标题化合物，为黄色固体。ESI-MS(m/e):413[M+H]⁺。

实施例7制备Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例5的方法从1.25g(5mmol)Boc-Leu和2.69g(6mmol)HCl·Asp(OBzl)-Val-OBzl得到2.10g(67.2％)标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e):626[M+H]⁺。

实施例8制备HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl

采用实施例6的方法从2.00g(3.2mmol)Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl得到1.66g(92％)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e):526[M+H]⁺

实施例9制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(5)

将206mg(0.43mmol)的化合物4分散于5mL的甲醇中。冰浴下，加入2滴三乙胺调节pH＝8，为溶液A；将724mg(1.29mmol)的HCl·Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl分散于5mL的甲醇中，冰浴下，加入2滴三乙胺调节pH＝8，为溶液B；合并溶液A和B。并加入干燥剂硫酸镁,常温活化1小时。每隔1小时，加入还原剂氰基硼氢化钠27mg(0.42mmol)，总共加了4次，总共加入氰基硼氢化钠107mg(1.69mmol)。常温反应8小时，终止反应，减压浓缩溶剂。加入10mL乙酸乙酯溶解残留物。得到的乙酸乙酯溶液用饱和碳酸氢钠水溶液萃洗3次，饱和氯化钠水溶液溶液洗至中性，收集乙酸乙酯层，无水硫酸钠干燥2小时后，过滤，滤液减压浓缩至干。得到的黄色糖浆物经硅胶柱层析纯化(v:v；二氯甲烷：甲醇＝75:1)得586mg(0.39mmol)标题化合物，为黄色固体，产率为30％。

ESI-MS(m/e)：1499[M+H]⁺

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ/ppm：9.87(s,1H),9.59(s,0.5H),8.91(d,J＝6.9Hz,1H),8.11(d,J＝6.9Hz,1H),7.52(m,3H),7.35(m,20H),7.18(m,5H),6.15(s,1H),5.22(m,4H),5.12(m,4H),4.91(m,2H),4.55(m,2H),4.30(m,2H),3.63(m,3H),3.00(m,10H),2.76(m,3H),2.36(m,3H),2.22(m,3H),2.05(m,2H),1.85(m,4H),1.55(m,4H),1.01(m,2H),0.92(m,24H)

实施例10制备(2S,5S)-四氢吡嗪[1,2:1,6]并双{(1S,1R)-[N-乙基-Leu-Asp-Val]-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶[3,4-b]并吲哚}-1,4-二酮(6)

将300mg(0.20mmol)化合物5溶于10mL的甲醇，在冰水浴下，用4N NaOH溶液调pH至13。冰浴下反应3个小时。冰浴下，用饱和硫酸氢钾水溶液调节pH至7，减压浓缩溶剂。冰浴下，用饱和硫酸氢钾水溶液调节pH至2。有沉淀析出。反应液用乙酸乙酯，进行萃取，萃取过程重复3次，收集乙酸乙酯层。用饱和氯化钠溶液对乙酸乙酯层进行萃洗，萃洗过程重复3次，收集乙酸乙酯层。无水硫酸钠干燥乙酸乙酯层2个小时，减压过滤，减压浓缩试剂。得到153mg(0.13mmol)标题化合物，为黄色固体，产率为67％。熔程：217.8～218.4℃；ESI-MS(m/e)：1140[M+H]⁺IR(cm^-1):3268.99,3060.27,3030.67,2960.20,2933.38,2872.62,1729.08,1637.84,1533.06,1496.55,1435.54,1390.21,1370.49,1329.74,1284.82,1260.16,1206.42,1156.31,1111.99,1079.82,1035.46,1007.34,925.10,844.20,816.49,794.23,781.90,739.96,696.81,671.74；¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ/ppm：12.57(m,1.5H),11.25(m,1.5H),8.56(m,5H),7.31(m,8H),5.81(s,1H),5.21(s,1H),5.01(m,1H),4.72(s,1H),4.50(m,4H),4.15(m,2H),3.80(m,2H),3.00(m,5H),2.78(m,4H),2.22(m,2H),2.04(m,3H),1.59(m,5H),1.30(m,4H),0.92(m,25H)。

实验例11评价化合物S,R-七环醛-Leu-Asp-Val的抗静脉血栓活性

1)实验方法

SD大鼠(200±20g)在手术前适应环境并禁食一天，以0.3mL/100g体重的剂量对大鼠进行灌胃给药，给药30min后于手术前2min用20％的乌拉坦溶液进行腹腔给药麻醉。将大鼠腹部备皮且消毒后沿腹白线打开腹腔，下至凝固腺，上至露出肝脏一角即可。将腹腔内小肠等器官拖出，暴露出下腔静脉，拖出的器官用浸润过生理盐水的纱布包裹。钝性分离血管周围***，暴露下腔静脉及其分支，在肾静脉下方将腹主动脉和下腔静脉剥离开，然后用被生理盐水浸湿的缝合线在下腔静脉与左肾静脉的交汇处将下腔静脉结扎，按解剖位置将肠等器官放回腹腔，用缝合线逐层缝合腹腔。

术后将大鼠置于25～28℃的环境中循环4小时，打开腹腔后，逐个将其分支结扎，从下腔静脉与左肾静脉的交汇处的结扎处开始取出2厘米下腔静脉，从中取出血栓。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.3mL/100g；阳性对照：华法林(给药剂量为4.87μmol/kg)；4(给药剂量为1μmol/kg)；本发明6(给药剂量为0.1μm ol/kg)。

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验，栓重以(均值±SD mg)表示。

4)实验结果

从表1结果可以看出,6与生理盐水比P<0.01，表明6具有良好的抗静脉血栓活性；0.1μmol/kg6与4.87μmol/kg华法林抗静脉血栓活性相当(还与1μmol/kg4抗静脉血栓活性相当)。本发明的化合物6在相同的活性条件下，比华法林剂量降低48.7倍，比4剂量降低10倍。本发明有意想不到的技术效果。

表1化合物6的抗静脉血栓活性

a)与生理盐水比P<0.01,与4.87μmol/kg华法林及1μmol/kg4比P>0.05；n＝12

实验例12评价化合物6的抗动脉血栓活性

1)实验方法

健康SD雄性大鼠，体重180-220g，术前禁食24小时，手术前配置抗凝剂肝素钠(2.4mg/mL),生理盐水溶液和乌拉坦(20g/100mL,麻醉剂量为7mL/kg)。将实验动物SD雄性大鼠随机分组，n＝9，大鼠灌胃给药的体积为3mL/kg，灌胃30分钟后用乌拉坦麻醉，分离右颈动脉和左颈静脉，结扎远心端，将一根含有6cm事先已精密称重的丝线的聚乙烯管充满肝素钠生理盐水溶液，聚乙烯管一端***左颈静脉，一端***右颈动脉，结扎近心端。血流从右侧动脉经聚乙烯管流入左侧静脉，15分钟后取出丝线并记录血栓湿重。

2)给药方法和剂量

给药方式为灌胃给药。空白对照：生理盐水，给药剂量为0.3mL/100g；阳性对照：阿司匹林(给药剂量为167μmol/kg)；4(给药剂量为1μmol/kg)；本发明6(给药剂量为0.1μmol/kg)。

3)统计方法

本实验数据统计均采用t检验，栓重以(均值±SD mg)表示。

4)实验结果

从表2结果可以看出，6与生理盐水比P<0.05，表明6具有良好的抗动脉血栓活性；0.1μmol/kg6与1μmol/kg4抗动脉血栓活性相当。本发明的化合物6在相同的活性条件下，比4剂量降低10倍。本发明有意想不到的技术效果。

表2化合物6的抗动脉血栓活性

a)与生理盐水比P<0.05,与167μmol/kg阿司匹林比P<0.05,与1μmol/kg 4比P>0.05；n＝9.

实验例13评价化合物6抑制体内GPIIb/IIIa表达的活性

1)实验方法：

血清：体内抗动脉血栓的评价的SD大鼠处死前，颈总动脉取血，4℃，3000rpm/min离心15分钟。

酶联免疫分析试剂盒：大鼠血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa试剂盒(来源：酶联生物公司；货号：m1003231)，酶标仪(厂家：Molecular Devices；型号：SpectraMax M3)，烘箱(厂家：莱斯特；型号：101-1AB)。

加样：设置好标准孔、待测样品孔、空白孔。标准孔，每孔分别加不同浓度的标准品50μL；样品孔先加40μL样品稀释液，再加入10μL的样品。空白孔不加。

加酶：每孔100μL，覆上板贴后摇匀，并在37℃的烘箱里温育1个小时。空白孔不加。

洗板：把浓缩的洗涤液用蒸馏水稀释20倍后，揭掉封板膜，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒甩干。重复五次。

加显色剂：每孔先加50μL的显色剂A，再加50μL的显色剂B。摇匀，37℃的烘箱里避光温育显色15min

加终止溶液：每孔50μL，15分钟内使用酶标仪在450nm波长下测量光密度。实验数据，以标准品浓度为0的孔设为空白孔，调零。

2)给药方法和剂量：

同实验例12

3)统计方法

数据统计采用t检验，以(均值±SD)表示。

4)实验结果

从表3结果可以看出，0.1μmol/kg 6与生理盐水比P<0.01，表明6具有良好的抑制体内GPIIb/IIIa表达的活性；0.1μmol/kg 6与1μmol/kg 4比P<0.01,表明6比1μmol/kg 4，抑制GPⅡb/Ⅲa表达的活性更好。本发明有意想不到的技术效果。

表3化合物6对GPⅡb/Ⅲa表达的影响

a)与生理盐水比P<0.01,与1μmol/kg 4比P<0.01；n＝6

实验例14评价化合物6对P选择素表达的影响

1)实验方法：

血清：体内抗动脉血栓的评价的SD大鼠处死前，颈总动脉取血，4℃，3000rpm/min离心15分钟。

酶联免疫分析试剂盒P-选择素：大鼠P-选择素酶联免疫分析试剂盒(来源：CUSABIO公司；产品编号：CSB-E07399r)，酶标仪(厂家：Molecular Devices；型号：SpectraMax M3)烘箱(厂家：莱斯特；型号：101-1AB)。

试剂配制：根据说明书，将一系列浓度梯度的标准品、洗液工作液、生物素标记抗体工作液、辣根过氧化物酶标记亲和素工作液配置好。然后室温平衡至少三十分钟。

加样：设置好标准孔、待测样品孔。每孔分别加标准品或待测样品100μL，覆上板贴后摇匀，并在37℃的烘箱里温育2个小时。甩干。

加生物素标记抗体工作液：每孔100μL，覆上板贴后摇匀，并在37℃的烘箱里温育1个小时。甩干，每孔200μL洗板液，每次浸泡2分钟，洗板三次。

加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：每孔100μL，覆上板贴后摇匀，并在37℃的烘箱里温育1个小时。甩干，每孔200μL洗板液，每次浸泡2分钟，洗板五次。

加底物溶液：每孔90μL，37℃的烘箱里避光温育显色15～30min

加终止溶液：每孔50μL，5分钟后，15分钟内使用酶标仪在450nm波长下测量光密度。实验数据，以标准品浓度为0的孔设为空白孔，调零。

2)给药方法和剂量：同实验例12

3)统计方法

数据统计采用t检验，以(均值±SD)表示。

4)实验结果

从表4结果可以看出，0.1μmol/kg 6与生理盐水比P<0.01，表明6具有良好的抑制体内P-选择素表达活性；6与1μmol/kg 4抑制体内P-选择素表达活性相当。发明的化合物6在相同的活性条件下，比4剂量降低10倍。本发明有意想不到的技术效果。

表4化合物6对P选择素表达的影响

a)与生理盐水比P<0.01；与1μmol/kg 4比P>0.05；n＝6。