一种不同产地裸花紫珠药材的鉴别方法
阅读说明：本技术 一种不同产地裸花紫珠药材的鉴别方法 (A kind of discrimination method of the callicarpa nudiflora medicinal material of different sources ) 是由 杨扬 康兴东 杨义芳 李小锋 邓杰仁 刘胜 章弘扬 刘辉辉 任昭洁 毛金娣 于 2019-07-19 设计创作，主要内容包括：本发明涉及药物分析技术领域,具体为一种不同产地裸花紫珠药材的鉴别方法。本发明采用超高效液相色谱法建立裸花紫珠药材特征图谱,并采用具有监督模式的PLS-DA方法,对裸花紫珠样品的UPLC特征图谱进行分析得到的载荷图,对VIP值进行分析,筛选出VIP值大于1.0的成分,这些成分在特征图谱作为区分裸花紫珠产地的标志物,通过这些差异性成分对不同产地的裸花紫珠药材进行区分和鉴别。本发明通过裸花紫珠产地的标志物可以快速精准鉴别来源于不同产地裸花紫珠药材,可实现裸花紫珠道地药材快速评价。(The present invention relates to Pharmaceutical Analysis technical field, the discrimination method of specially a kind of callicarpa nudiflora medicinal material of different sources.The present invention establishes callicarpa nudiflora medicinal material characteristic spectrum using ultra-performance liquid chromatography, and using the PLS-DA method with enforcement mechanisms, the load diagram that the UPLC characteristic spectrum of callicarpa nudiflora sample is analyzed, VIP value is analyzed, filter out the ingredient that VIP value is greater than 1.0, these ingredients, as the marker for distinguishing the callicarpa nudiflora place of production, are distinguished and are identified by callicarpa nudiflora medicinal material of these otherness ingredients to different sources in characteristic spectrum.The present invention can be identified from the callicarpa nudiflora medicinal material of different sources with fast accurate, it can be achieved that callicarpa nudiflora genunie medicinal materials Fast Evaluation by the marker in the callicarpa nudiflora place of production.)
技术领域
本发明涉及中药药物分析技术领域，具体为一种不同产地裸花紫珠药材的鉴别方法。
背景技术
所谓道地药材，又称地道药材，是优质纯真药材的专用名词，它是指历史悠久、产地适宜、品种优良、产量宏丰、炮制考究、疗效突出、带有地域特点的药材，道地药材以外其它各地所处的地理环境十分复杂，水土、气候、日照、生物分布都不完全相同，因此，药物本身的质量，也即其治疗作用有着显著的差异。所以古今医家都喜欢使用道地药材。
中药材具有多基原、多产地的属性,导致其产品质量差异悬殊。除此以外,外在因素方面包括品种、栽培种植及产地生态环境、采收加工、炮制加工、运输贮藏条件、提取纯化过程等均会对质量造成影响(郝敏，陆兔林，毛春琴，等.基于中药质量标志物的饮片质量控制研究[J].中草药,2017,48(9),1699-1708.)。刘昌孝等根据目前中药质量标准中存在的问题,首次提出了“中药质量标志物”的新概念,即Q-marker(刘昌孝,陈士林,肖小河,等.中药质量标志物(Q-Marker):中药产品质量控制的新概念[J].中草药,2016,47(9):1443-1457.)，在行业内引起了强烈反响。此后，他又提出基于中药质量标志物的中药质量追溯系统建设，通过从药材源头到成品全过程的质量、标准和控制研究,构建全程可溯源的控制和基于中药质量标志物的中药产品质量追溯系统,是保证中药质量和产业过程全程控制的关键(刘昌孝.基于中药质量标志物的中药质量追溯系统建设[J].中草药,2017,48(18):3669-3676.)。
裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.是马鞭草科紫珠属CallicarpaL.植物。药用部位为干燥叶片,全年皆可采收。具有抗菌止血、消炎解毒、散瘀消肿、祛风祛湿功效、跌打肿痛、风湿肿痛、肺结核咳血、胃肠出血等症。《中国药典》1977年版曾收录裸花紫珠，2015年版新增中药品种中再次收录了该药材。其化学成分主要包括苯丙素类、黄酮类、三萜类、二萜类、环烯醚萜类、酚酸类及其苷和甾醇等成分。
历代本草记载的混乱、植物形态细微差别以及引用错误等多种原因造成了现今裸花紫珠药材品种复杂,来源较为混乱，其同物异名、同名异物现象较为严重。近年来,随着裸花紫珠研究与开发进程的不断推进,其多种药理活性被广泛应用于临床,而在裸花紫珠日渐重要的市场价值影响之下,出现了较多的裸花紫珠混淆品,尽管其中大部分与裸花紫珠同属紫珠属,但其功效不尽相同。
我们采用了UPLC活性特征指纹色谱的方法，结合化学计量学手段，可实现裸花紫珠与其它紫珠属药材的精准区分，快速鉴别裸花紫珠药材(杨义芳等.裸花紫珠药材的活性特征指纹色谱的构建和色谱/质谱在线快速鉴别的方法.CN.1019-05-)。有助于裸花紫珠与其混淆品进行区别归类,确保其临床用药安全有效,促进其资源的合理开发与应用。
裸花紫珠是海南大宗道地药材,是一种常用的海南传统民族药材，因主要生长在海南黎族地区，黎族疗伤圣药，也被称为黎药，在中国广东、广西、海南以及东南亚的印度、越南、新加坡等地均有分布，其中以海南五指山产的为上品，具有明显地域特点的药材，其它各地所处的地理环境十分复杂，水土、气候、日照、生物分布都不完全相同，因此，药物本身的质量，也即其治疗作用有着显著的差异。为此对裸花紫珠道地药材的快速评价方法亟待解决。同时提高药材鉴定水平，完善其质量标准是主流医药市场对于其品种的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了解决不同产地裸花紫珠中药材无法进行快速有效区分鉴别，缺少裸花紫珠道地药材快速评价方法的技术问题，而提供了一种产地标志物对不同产地裸花紫珠药材进行鉴别的新方法。
本发明提供了一种不同产地裸花紫珠药材的鉴别方法，其包含下列步骤：
色谱条件：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温15～50℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％～0.5％的磷酸水溶液，流速0.2～0.5mL/min；梯度洗脱；洗脱梯度如下所示：
供试品溶液的制备:将裸花紫珠药材粉碎，过30～60目筛，裸花紫珠药材粉末与体积质量比10～80倍量的60％～95％的甲醇水溶液混合，超声提取30～60min，提取后，冷却，用微孔滤膜过滤，即可。
对照品溶液的制备：取对照品适量，加甲醇溶解至一定浓度，用微孔滤膜过滤，即可。对照品包括毛蕊花糖苷、连翘酯苷B、木犀草苷、咖啡酸、熊果酸、木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-3′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、木犀草素、藿香黄酮醇。
检测：精密吸取供试品溶液1～20uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠特征图谱。
对照特征图谱生成：构建的10批次以上的裸花紫珠超高效液相色谱特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件，选择分离度良好、峰面积百分比大于0.5％的共有峰作为指纹峰，生成由42个共有峰构成的裸花紫珠裸花紫珠超高效液相色谱对照特征图谱。
裸花紫珠样品的差异性成分分析：采用具有监督模式的PLS-DA(偏最小二乘法判别分析)方法，对裸花紫珠样品的UPLC特征图谱进行分析，寻找其中的差异标志物。由PLS-DA分析得到的载荷图。对VIP值(变量重要性投影值)进行分析，筛选出VIP值大于1.0的成分，它们明显偏离了主要化合物聚集区和原点，说明这些化合物对不同产地裸花紫珠药材的区分贡献较大。这些成分在特征图谱作为区分裸花紫珠产地的标志物，通过这些差异性成分对不同产地的裸花紫珠药材进行区分和鉴别。
本发明中，所述色谱条件进一步优选为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱，柱温45℃；检测波长210nm；流动相B为乙腈，流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流速0.3mL/min；梯度洗脱；洗脱梯度如下所示：
所述供试品溶液的制备方法进一步优选为:将裸花紫珠药材粉碎，过30～60目筛，裸花紫珠药材粉末与体积质量比50倍量的80％的甲醇水溶液混合，超声提取45min，提取后，冷却，用微孔滤膜过滤，即可。
所述检测方法进一步优选为:精密吸取供试品溶液2～5uL，注入超高效液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得裸花紫珠指纹图谱。
本发明中，19批裸花紫珠药材(S1-S19)经江西普正制药有限公司吴永忠研究员鉴定为马鞭草科裸花紫珠Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.的干燥叶经密封保存于阴凉干燥处，药材信息如表1所示。
表1裸花紫珠药材信息
本发明中，对照品信息如表2所示
表2对照品的信息
本发明的有益效果：各地裸花紫珠药材所处的地理环境的复杂，水土、气候、日照、生物分布的不同，本质上是由于它们次生代谢成分的生物积累差异，从而从生物分子水平上阐明地域差别。本发明通过裸花紫珠产地的标志物可以快速精准鉴别来源于不同产地裸花紫珠药材，可实现裸花紫珠道地药材快速评价。
附图说明
图1为实施例1中不同紫外波长下裸花紫珠UPLC-UV色谱图(A：210nm；B：254nm；C：332nm)
图2为实施例2中水及不同的甲醇对裸花紫珠指纹图谱峰个数(A)和总峰面积(B)的影响
图3为实施例2中不同超声时间对裸花紫珠指纹图谱峰个数(A)和总峰面积(B)的影响
图4为实施例2中不同液固比对裸花紫珠指纹图谱峰个数(A)和总峰面积(B)的影响
图5为实施例4中裸花紫珠(S1)的UPLC特征指纹图谱
图6为实施例5中裸花紫珠样品PLS-DA载荷图
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例中的药材粉末由下列制备方法制得：将S1～S19批次的药材用粉碎机粉碎，即可。
实施例1
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，置具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声(功率500W，频率40kHz)提取45min，放冷，80％甲醇补重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，柱温45℃，进样量2μL，在检测波长210nm、254nm和332nm分别测试。色谱图(如图1所示)，发现210nm时色谱峰信息最完全，由于裸花紫珠中大量二萜、三萜类化合物只在紫外波长210nm处有末端吸收，而苯丙烯酸类、黄酮类等化合物的最大吸收峰在254nm和332nm处，210nm处也有末端吸收，因此选择210nm作为指纹图谱的检测波长。
实施例2
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，7份，分置具塞锥形瓶中，分别精密移入25mL的纯水、20％甲醇、40％甲醇、50％甲醇、60％甲醇、80％甲醇和纯甲醇，称重，超声(功率500W，频率40kHz)30min，放冷，相对应的溶剂补重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为提取溶剂比例的优化供试品溶液。
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，6份，分置具塞锥形瓶中，分别精密移入25mL的50％甲醇，称重，分别超声(功率500W，频率40kHz)提取15、30、45、60、75、90min，放冷，50％甲醇补重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为超声时间的优化供试品溶液。
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，6份，分置具塞锥形瓶中，分别精密移入10、25、40、50、65、75mL的50％甲醇，称重，放冷，分别超声(功率500W，频率40kHz)提取45min，放冷，50％甲醇补重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为提取液固比的优化供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。
提取溶剂比例的优化结果如图(图2)所示。由图可见加入80％甲醇时峰个数和总峰面积达到最大，因此选择80％甲醇作为提取溶剂。
超声时间的优化结果如图(图3)所示。由图可见超声45min时峰个数和总峰面积达到最大，因此选择45min作为超声时间。
提取液固比的优化结果如图(图4)所示。由图可见加入25mL提取溶剂时峰个数和总峰面积达到最大，因此选择液固比为50(mL/g)。
实施例3
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，1份，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为精密度考察供试品溶液，连续进样6次。
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，共6份，分别置于具塞锥形瓶中，分别加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为重复性考察供试品溶液，依次进样。
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，1份，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为稳定性考察供试品溶液，分别在0、2、4、6、12和24h进样。
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。
结果见表3。精密度考察结果显示各指纹峰的相对保留时间RSD≤0.12％，相对峰面积RSD值≤2.91％，表明该仪器的精密度良好；重复性考察结果显示各指纹峰的相对保留时间RSD≤0.09％，相对峰面积RSD值≤2.93％，表明该方法的重复性良好；稳定性考察结果显示各指纹峰的相对保留时间RSD≤0.76％，相对峰面积RSD值≤2.95％，表明裸花紫珠的供试品溶液在24h内能够保持稳定。
表3裸花紫珠指纹图谱方法学考察结果(n＝6)
实施例4
取裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，置于具塞锥形瓶中，加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。
所建立的特征指纹图谱如图5所示。选择分离度良好、峰面积百分比大于0.5％的共有峰作为指纹峰，共获得42个共有指纹峰，其中木犀草苷的色谱峰(11号峰)在各个样品中均分离良好且有适中的峰面积，故选择其作为内参比峰(S)。
实施例5
取S1～S19批裸花紫珠样品粉碎，过40目筛，精密称取样品粉末约0.5g，分置于具塞锥形瓶中，分别加入80％甲醇水溶液25mL，称重，超声45min，放冷，用80％甲醇补足失重，摇匀，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液(S1～S19批供试品溶液)；
采用超高效液相色谱(UPLC)Waters ACQUITY ARCTM型超高效液相色谱仪；Phenomenex kintex XB-C18色谱柱，其规格为外径2.1mm×柱长150mm，填料直径1.7μm。流动相为(A)0.1％磷酸水溶液和(B)乙腈，梯度洗脱如下所示：
流速为0.3ml/min，检测波长210nm，柱温45℃，进样量2μL。得到各自的UPLC指纹图谱和相关数据。
借鉴代谢组学“生物标志物”的思路，采用具有监督模式的偏最小二乘法判别分析方法，对裸花紫珠样品的UHPLC-UV指纹图谱进行偏最小二乘法判别分析，寻找其中的差异标志物。由PLS-DA分析得到的载荷图如图6所示。
对VIP值(Variable Important in Projection，变量重要性投影值)进行分析，一般认为VIP值大于1.0的变量具有统计学意义。分析PLS-DA载荷图发现，有9个成分(以红色星形标记)的VIP值大于1.0，它们明显偏离了主要化合物聚集区和原点，说明这些化合物对不同产地裸花紫珠药材的区分贡献较大。其中，通过与对照品比对可确认峰11、14、15、25分别为木犀草苷、毛蕊花糖苷、木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和藿香黄酮醇；而峰6、10、13、34、35经Q-TOF-MS指认分别为异槲皮苷、nudifloside、5,7,3′,4′-四羟基-8-甲氧基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷、7α-乙酰氧基-山达海松酸和山达海松酸。这9个化合物可作为指纹图谱中区分裸花紫珠产地的标志物。
筛查所得9个差异性成分的VIP值及其在各个产地药材中的平均峰面积如表5所示。同样可发现，VIP值越大的化合物在载荷图中偏离中心点越远，对分类的贡献越大。表5中毛蕊花糖苷的VIP值最大，平均峰面积大小顺序为江西上犹>海南白沙>海南五指山，因此是区分三个产地最主要的标志物。山达海松酸、7α-乙酰氧基-山达海松酸、藿香黄酮醇和5,7,3′,4′-四羟基-8-甲氧基-6-C-β-D-葡萄糖黄酮碳苷在产地海南白沙的样品中含量最高，而木犀草苷、木犀草素-4′-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷和Nudifloside在产地江西上犹的样品中含量最高，它们作为差异性成分可有效的区分鉴别不同产地的裸花紫珠药材。
表4不同产地裸花紫珠中的差异性标志物