Acr蛋白73位c-33.997在制备重度少弱精诊断试剂中的应用
阅读说明：本技术 Acr蛋白73位c-33.997在制备重度少弱精诊断试剂中的应用 (Application of 73 C-33.997 of ACR albumen in the few weak smart diagnostic reagent of preparation severe ) 是由 杨静华 孙胜楠 陈新骏 陈子江 于 2018-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了ACR蛋白73位发生-33.987±0.005的质量偏移的半胱氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。本发明发现：通过ACR蛋白73位发生-33.987±0.005的质量偏移的半胱氨酸的检验频次可以用来诊断重度少弱精症,为重度少弱精症提供了新的诊断和治疗靶点。(The cysteine for the mass shift for occurring -33.987 ± 0.005 the invention discloses 73, ACR albumen is preparing the purposes in the diagnostic reagent that severe lacks weak essence as biomarker.Present invention discover that: the inspection frequency that the cysteine of -33.987 ± 0.005 mass shift occurs by 73, ACR albumen, which can be used to diagnose severe, lacks azoospermia, lacks azoospermia for severe and provides new diagnosing and treating target spot.)
技术领域
本发明涉及医学和分子诊断技术领域，具体涉及一种ACR蛋白73位发生-33.987±0.005Da的质量偏移的半胱氨酸(新型非编码氨基酸[email protected])作为标志物在制备重度少弱精诊断试剂中的用途。
背景技术
据世界卫生组织调查，15％的育龄夫妇存在不育问题，不育症已成为影响人类健康与社会发展的一个全球性医学和社会问题(Turner,T.T.and J.J.Lysiak,Oxidativestress:a common factor in testicular dysfunction.J Androl,2008.29(5):p.488-98)。如果a级***数<25％，(a+b)级***数<50％，且***活率低于60％的话就可诊断为弱***症。少***症是指***中的***数目低于正常具有生育能力男性的一种病症，当男性的***在每毫升低于2千万时，就为少***症。虽然现今关于少弱***症的发病机制的研究很多，但是其确切机制尚不明朗，这也阻碍了其新的治疗手段的发展。由于***成熟后其转录和翻译处于停滞状态，这就为研究人员在蛋白质组及其翻译后修饰水平上研究少弱***症的生理病理机制提供了方便。
目前关于***蛋白质组的研究有很多，总共大约鉴定了6238个非冗余蛋白(Semenproteomics and male infertility，Meritxell Jodar,Ada Soler-Ventura,RafaelOliva，Molecular Biology of Reproduction and Development Research Group，Journal of Proteomics 162(2017)125–134)。目前最新更新的人类***蛋白质组Amaral等完成，共鉴定了6198个蛋白(Amaral A,Castillo J,Ramalho-Santos J,Oliva R.Thecombined human sperm proteome:cellular pathways and implications for basicand clinical science.Human reproduction update,20(1),40-62(2014))。Mayank等利用差异蛋白质组学的方法在5组健康人和8组少弱***症患者的***细胞中定量了667个蛋白，***中定量了447个蛋白，分许出了8个显著下调蛋白，并对其进行了通路分析(HumanSpermatozoa Quantitative Proteomic Signature Classifies Normo-andAsthenozoospermia，Mayank Saraswat,Sakari Joenvaara,Tushar Jain,Anil KumarTomar,Ashima Sinha,Sarman Singh,Savita Yadav,and Risto Renkonen，Mol CellProteomics.2017Jan；16(1):57-72)。为了研究无精症的分子机制，Mehdi等利用非标记定量蛋白质组学方法在人阻塞性和非阻塞性无精症的睾丸组织中找到了520个显著性变化蛋白，包括几种关键转录因子，这也为研究***发生和人类生殖的分子调控机制奠定了基础(Quantitative proteomic analysis of human testis reveals system-widemolecular and cellular pathways associated with non-obstructive azoospermia，MehdiAlikhani，MehdiMirzaei，MarjanSabbaghian，PouriaParsamatin，RaziehKaramzadeh，SamaneAdib，NiloofarSodeifi，Mohammad Ali SadighiGilani，MasoudZabet-Moghaddam，LindsayParker，YunqiWu，VivekGupta，Paul A.Haynes，HamidGourabi，HosseinBaharvand，Ghasem HosseiniSalekdeh，Journal of Proteomics，Volume 162,6June 2017,Pages 141-154)。成熟***翻译转录活动的沉默也使其成为研究翻译后修饰的理想细胞模型，但是关于基于质谱的***翻译后修饰大规模研究还是很少。关于修饰的研究主要集中于磷酸化，糖基化，乙酰化和泛素化(The Challenge of HumanSpermatozoa Proteome:A Systematic Review，Kambiz Gilany,Arash Minai-Tehrani,Mehdi Amini,Niloofar Agharezaee,Babak Arjmand，J Reprod Infertil.2017Jul-Sep；18(3):267–279.)。络氨酸磷酸化对于***的运动、获能、超激运动等过程重要作用。Chying-Chyuan Chan等通过对20组正常人和弱精症患者的***进行蛋白质组学分析发现有12种包括TUBGCP2在内的蛋白发生了过磷酸化。非编码氨基酸包括翻译后修饰和氨基酸突变是调控蛋白功能和结构的重要方式，因此将疾病状态下异常的或者数量变化极大的非编码氨基酸作为疾病的生物标志物进而用于诊断疾病的进程具有重要意义。
顶体蛋白是顶体基质蛋白的主要蛋白，是一种丝氨酸蛋白酶，以无活性蛋白酶原的形式存在。顶体蛋白在顶体基质蛋白解体，***与透明带结合，顶体反应等生理过程中起着重要作用(Modes of acrosin functioning during fertilization)。研究表明***受精率与顶体蛋白的活性密切相关(Sperm acrosin activity and fluorescencemicroscopic assessment of proacrosin/acrosin in ejaculates of infertile andfertile men)。
发明内容
目前医学研究人员对重度少弱精症的发病机制并不明确，本案发明人选择***蛋白作为研究对象，分析其中非编码氨基酸的突变状况，有助于从基因层面解析重度少弱精症的发病机制。关于重度少弱精症的治疗药物多以补虚的中成药以及激素类药物为主，治愈率低。开展关于非编码氨基酸突变位点的研究有利于为重度少弱精的治疗药物提供靶标，为药物的研发提供更多依据。
关于重度少弱精症的生物标志物的研究，本案发明人在以往的研究中取得了一定的成果，并公布在专利CN106872630A、CN106932597A、CN106990177A、CN106996981A、CN106996979A、CN106996980A、CN107015005A、CN107024553A、CN107037172A中。众所周知，非编码氨基酸的位点有限，本案发明人选择研究这些突变位点与重度少弱精症发病的关系，但事实上，这些位点的突变可能与人体多种疾病的发生相关联，尽量多的筛选出发生突变的非编码氨基酸位点对于疾病的诊断及医药发展具有重要的意义。因此，本案发明人对***蛋白中的非编码氨基酸突变状况进行了更深入的研究，在后续的研究过程中，发明人进行了细致而繁重的研究工作，通过不断鉴别突变位点，得到了21对有可能有意义的质谱精蛋白数据，并对筛选到的突变位点与疾病的相关性进行统计学分析，发明人再次得到了具有重要意义的研究成果。
针对上述现有技术，本发明的目的提供一种与重度少弱***症相关的生物标志物的筛选与应用。本发明首先利用NanoHPLC-MS/MS质谱系统和非标记定量蛋白质组学方法对多组重度少弱精疾病的***蛋白非编码氨基酸进行了深度的质谱分析；然后利用非限定氨基酸蛋白质修饰分析方法对质谱数据进行搜索，再经过多变量高斯混合分布聚类分析，尽可能大量的鉴定出***蛋白组中非编码氨基酸；最后通过正常和病人***蛋白组中非编码氨基酸的比较，得到与重度少弱精症相关的蛋白非编码氨基酸位点，从而将其作为重度少弱精症的分子标志物。
为了实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
等量的重度少弱精和正常***样本分别用DPBS洗三次，加入等量RIPA裂解液超声1-2min，置于冰上孵育30min裂解，4℃离心14,000g×20min取上清。利用Bradford方法测定蛋白浓度。
取约重度少弱精和正常***样本各150μg***蛋白，使用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离，各分成5份进行切胶酶解。使用ziptip对肽段进行脱盐。
纳流液相色谱分离：A相：含有0.1％甲酸的水；B相：含有0.1％甲酸的乙腈。
每个样品分别用13.5μL A相溶解，样品进样量为4μL，纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。样品分离之前分别用4μL A相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μm I.D.,C18填料粒径5μm,)，分析柱(30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒径3μm, Dr.Maisch GmbH,Germany)。平衡之后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离。150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B，100min；32-80％流动相B，20min；80％流动相B，30min。流速始终保持在300nL/min。经过纳流液相分离的样品直接进入ESI离子喷雾源并进入Orbitrap Elite质谱仪中进行质谱检测。
质谱数据采集条件为350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induced dissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
为了鉴定出***蛋白的非编码氨基酸，本发明采用ByonicTM分析21对正常与重度少弱精患者的精蛋白质谱数据。搜索参数如下：蛋白酶为胰蛋白酶，漏切位点设置为2，母离子质量偏差为10ppm,碎片离子的质量偏差为0.6Da，盲搜上限设为1000，盲搜下限设为-200.蛋白FDR为0.01。
选择FDR<0.01的Byonic Wildcard Search搜索到的未知修饰肽段数据，组成一维数据矩阵，数据的delta mass范围选择-200Da-400Da，再将数据按照1Da的变化区间，0.5Da为区间界限，分割成601个数据窗口。针对每一个数据窗口，采用R语言中的mclust程序包做高斯混合分布聚类分析，根据BIC取最优值，再对每一个峰进行合并分析，然后用高斯分布拟合每一个峰，确定峰值。聚类之后的每个峰中都包含着氨基酸的信息，根据未知修饰在20种氨基酸上的分布比例，以10％为选择参数，用RUP的迭代模型选择非编码氨基酸。
将正常与患病组的非编码氨基酸按照其检测频率的T检验(p<0.01)、比值(ratio>2)和检测频率(>100)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。然后利用SPSS软件作出差异非编码氨基酸ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，进而判断其诊断价值。
经过质谱数据分析发现ACR蛋白的73位的半胱氨酸有-33.987±0.005Da的质量偏移(C-33.987)，为半胱氨酸脱去H2S变为脱氢丙氨酸，经过比较发现这一非编码氨基酸C-33.987在重度少弱精样本显著性下调了35.6倍，p值为3.49E-12<<0.01。
本发明的第一方面，提供根据上述筛选方法筛选得到的与重度少弱***症相关的生物标志物，所述生物标志物包括但不限于：
ACR蛋白73位发生-33.987±0.005Da质量偏移的半胱氨酸(标记为C-33.987；根据质量偏移值，确定该位置的半胱氨酸脱去H2S变为脱氢丙氨酸)；
本发明的第二方面，提供ACR蛋白73位发生-33.987±0.005Da质量偏移的半胱氨酸(标记为C-33.987)作为生物标志物在制备重度少弱精的诊断试剂中的用途。
本发明还提供一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物(ACR蛋白73位发生-33.987质量偏移的半胱氨酸)的试剂。
优选的，ACR蛋白73位发生-33.987质量偏移的半胱氨酸还可以作为重度少弱精治疗的靶标，从而用于重度少弱精的治疗。
本发明还提供ACR蛋白73位发生-33.987质量偏移的半胱氨酸作为生物标志物在制备重度少弱精的治疗药物中的用途。
本发明还提供一种治疗重度少弱精的药物，该药物中含有将ACR蛋白73位半胱氨酸转化为脱氢丙氨酸的组分。
本发明还提供一种重度少弱精的诊断方法，步骤为：检测待测样本ACR蛋白73位的半胱氨酸发生-33.987±0.05Da质量偏移([email protected])的频次，每个样品平行检测3次，若平均检测频次小于1.7时，被判为少弱精患者。
本发明还提供一种生物标志物，该发生-33.987±0.005质量偏移的半胱氨酸位于ACR蛋白73位。
本发明的有益效果：
本发明进一步的对上述筛选方法得到的生物标志物进行研究，发现可以通过上述生物标志物的检验频次来诊断重度少弱精症，为重度少弱精症提供了新的诊断和治疗靶点。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1：ACR蛋白73位非编码氨基酸C-33.987检测频率的ROC曲线图；
图2：健康和少弱精样本中ACR蛋白73位非编码氨基酸C-33.987检测频率对比图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释：
检测频次：待测样品依照本发明实施例1记载方式进行处理后通过质谱分析，进样样品中非编码氨基酸C-33.987发生偏移的次数，称为检测频次。
本发明筛选得到与重度少弱***症相关的生物标志物，具体如下：
ACR蛋白73位发生-33.98733.987±0.005质量偏移的半胱氨酸(标记为C-33.987；根据质量偏移值，确定该位置的半胱氨酸脱去H2S变为脱氢丙氨酸)；
在本申请的另一种实施方案中，提出了一种用于重度少弱精诊断的试剂盒，所述试剂盒中包括特异性检测上述生物标志物的试剂。
通过对上述生物标志物进行检测，可以实现对重度少弱精症的诊断。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：与重度少弱***症相关的生物标志物的筛选
具体筛选方法如下：
一、样本处理及实验分析
1.***细胞全蛋白的提取：等量的重度少弱精和正常***样本分别用DPBS洗三次，加入等量RIPA裂解液超声1-2min，置于冰上孵育30min裂解，4℃离心14,000g×20min取上清。利用Bradford方法测定蛋白浓度。
2.蛋白酶解：取约重度少弱精和正常***样本各150μg***蛋白，使用10％聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行分离，各分成5份进行切胶酶解。使用ziptip对肽段进行脱盐。
3.质谱分析：纳流液相色谱分离：A相：含有0.1％甲酸的水；B相：含有0.1％甲酸的乙腈。
每个样品分别用13.5μL A相溶解，样品进样量为4μL，纳流液相质谱分析系统为Orbitrap Elite(Thermo Scientific)。样品分离之前分别用4μL A相平衡自制的预柱和分析柱。预柱和分析柱的规格分别为：预柱(4cm×150μm I.D.,C18填料粒径5μm,)，分析柱(30cm×75μm I.D.,C18填料填充，粒径3μm, Dr.Maisch GmbH,Germany)。平衡之后样品在A相的带动下首先载样于预柱，然后在不同梯度下进行液相分离。150min色谱梯度变化如下：5-32％流动相B100min；32-80％流动相B，20min；80％流动相B，30min。流速始终保持在300nL/min。经过纳流液相分离的样品直接进入ESI离子喷雾源并进入OrbitrapElite质谱仪中进行质谱检测。
质谱数据采集：350-1800m/z的全扫描，分辨率为60,000(m/z 200)。二级图谱扫描时，活化时间为10ms，隔离宽度为2m/z。碎裂方式为诱导碰撞解离(collision-induceddissociation,CID)，归一化碰撞能量设定为35％，动态排出时间为90s。
二、质谱数据分析
Byonic分析：为了鉴定出***蛋白的非编码氨基酸，用ByonicTM分析21对正常与重度少弱精患者的精蛋白质谱数据。搜索参数如下：蛋白酶为胰蛋白酶，漏切位点设置为2，母离子质量偏差为10ppm，碎片离子的质量偏差为0.6Da，盲搜上限设为1000，盲搜下限设为-200.蛋白FDR为0.01。
选择FDR<0.01的Byonic Wildcard Search搜索到的未知修饰肽段数据，组成一维数据矩阵，数据的delta mass范围选择-200Da-400Da，再将数据按照1Da的变化范围，0.5Da为界限，分割成601个数据窗口。针对每一个数据窗口，用R语言中的mclust程序包做高斯混合分布聚类分析，根据BIC取最优值，再对每一个峰进行合并分析，然后用高斯分布拟合每一个峰，确定峰值。聚类之后的每个峰中都包含着氨基酸的信息，根据未知修饰在20种氨基酸上的分布比例，以10％为选择参数，用RUP的迭代模型选择非编码氨基酸。
将正常与患病组的非编码氨基酸按照其检测频率的T检验(p<0.01)、比值(ratio>2)和检测频率(>100)进行筛选，从而得到差异非编码氨基酸。然后利用SPSS软件作出差异非编码氨基酸ROC曲线，并计算其曲线下面积(AUC)，进而判断其诊断价值。
分类算法准确性结果如下表所示：
Pos
TotalCount
ave_c
ave_b
ratio
Ttest
AUC
pValue
70
138
1.698413
0.047619
-35.6667
3.49E-12
0.861
7.60E-15
三、实验结果：
经质谱数据分析和将正常与患病组的非编码氨基酸比较，从而得到以下差异非编码氨基酸，可以作为与重度少弱***症相关的生物标志物，具体如下：
ACR蛋白73位发生-33.98733.987±0.005质量偏移的半胱氨酸(标记为C-33.987；根据质量偏移值，确定该位置的半胱氨酸发生了脱去H2S变为脱氢丙氨酸)；
经过质谱数据分析，发现ACR蛋白73位半胱氨酸上发生了质量偏移C-33.987，经过比较发现这一非编码氨基酸在重度少弱精样本显著性下调了35.6倍，p值为3.49E-12<<0.01。
为评价ACR蛋白73位半胱氨酸上的质量偏移C-33.987检测频率对重度少弱精的诊断效能，本发明采用了ROC曲线分析，AUC为ROC曲线下的面积，是最常用的评价ROC曲线特征的参数，是重要的试验准确度指标。若AUC在0.7以下，则表示诊断的准确率较低；AUC在0.7以上，则可以满足临床诊断的要求。
图1为ACR蛋白73位的半胱氨酸发生-33.987±0.005质量偏移检测频率的ROC曲线，ROC分析显示这一非编码氨基酸C-33.987的AUC为0.861>0.7，说明具有较好的诊断效果，即ACR蛋白73位发生-33.98710质量偏移的半胱氨酸可以作为重度少弱精的诊断标志物。
健康和少弱精样本中ACR蛋白73位发生-33.987±0.005质量偏移的半胱氨酸检测频率比较结果见图2，由图2可以看出这一非编码氨基酸在健康人样本中平均发生了1.7次而在病理样本中发生了0次。
鉴于上述结果，ACR蛋白73位发生-33.987±0.005质量偏移的半胱氨酸C-33.987可以作为少弱***症的潜在生物标志物，从而对这一病症进行预测。
实施例2：临床检测验证
以3例健康样本、3例已临床确诊的重度少弱精样本作为研究对象进行验证，分别检测上述样本的ACR蛋白73位发生-33.987±0.005质量偏移的半胱氨酸的检测频次，并按实施例1中生物标志物进行个体检测时的判断标准对待测样本进行诊断。
结果表明：以上述生物标志物进行单独诊断时，3例健康样本中非编码氨基酸C-33.987的检测频次均在2次及2次以上，而3例重度少弱精样本中的这一非编码氨基酸均未检测到偏移。诊断结果与已知结果一致，说明本发明筛选得到的生物标志物可以作为重度少弱精的诊断标志物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。