阅读说明：本技术 血竭素在制备药物中的用途 (Application of dracorhodin in preparing medicine ) 是由 刘予豪 何伟 徐家科 张庆文 周驰 马超 于 2019-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及血竭素在制备药物中的用途,具体涉及血竭素或血竭素高氯酸盐在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途,属于医药技术领域。本发明所述的血竭素或血竭素高氯酸盐在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途,具备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的作用。本发明为血竭素或血竭素高氯酸盐提供了一种新的用途,也为破骨细胞形成或骨吸收功能或溶骨性疾病的治疗提供了一种新的药物成分。(The invention relates to application of dracorhodin in preparation of a medicine, in particular to application of dracorhodin or dracorhodin perchlorate in preparation of a medicine for inhibiting osteoclast formation or inhibiting osteoclast bone absorption or preventing and treating osteolytic diseases, and belongs to the technical field of medicines. The application of the dracorhodin or dracorhodin perchlorate in preparing the medicine for inhibiting osteoclast formation or inhibiting osteoclast bone absorption or preventing and treating osteolytic diseases has the effect of inhibiting osteoclast formation or inhibiting osteoclast bone absorption or preventing and treating osteolytic diseases. The invention provides a new application of dracorhodin or dracorhodin perchlorate and also provides a new medicinal component for treating osteoclast formation or bone absorption function or osteolytic diseases.)

血竭素在制备药物中的用途

技术领域

本发明涉及血竭素在制备药物中的用途，具体涉及血竭素或血竭素高氯酸盐在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途，属于医药技术领域。

背景技术

人体内正常骨组织是动态的、持续性改变的组织，正常的骨代谢平衡主要依靠成骨细胞的骨重建功能、破骨细胞的骨吸收功能来维持。当体内破骨细胞活性增强，这种骨稳态便会被打破，造成骨量丢失，从而诱发各种溶骨性相关疾病，如骨质疏松症、骨坏死等，主要表现为骨组织微结构破坏，骨密度降低导致骨强度降低、脆性增加等。

破骨细胞是由单核巨噬细胞、造血细胞分化而来的多核细胞。巨噬细胞向破骨细胞分化过程中依赖两大细胞因子：核因子κβ配体(RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)。RANKL是破骨细胞分化、存活及发挥骨吸收作用的重要细胞因子，它通过与受体RANK相结合来产生生物效应。RANK与RANKL相结合激活了丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NF-κB及钙离子等信号通路，最终激活破骨细胞分化所必须的c-Fos、T细胞胞质1(NFATc1)等转录因子，从而触发了控制破骨细胞分化和功能的相关基因表达，如抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAcP)、组织蛋白酶K(CTSK)、降钙素受体(Calcitonin receptor)、金属蛋白酶(MMP9)、Integrinβ3、NFATc1和c-Fos等。M-CSF是诱导破骨细胞前体生存及增殖的重要因子，M-CSF同样可以介导骨髓巨噬细胞(BMMs)对RANKL的敏感性。因此，中断或减弱RANKL介导的分子信号通路可以治疗一些与破骨细胞相关的疾病，如骨质疏松症、骨坏死、Paget骨病、骨髓炎、骨囊肿、骨髓瘤、骨转移瘤、骨母细胞瘤、非骨化性纤维瘤、骨巨细胞瘤等。

本发明人既往研究发现龙血竭查尔酮类提取物可通过MAPK、钙离子信号通路等抑制NFATc1活性，抑制ROS活性，抑制破骨细胞分化，从而防治骨质疏松、骨坏死等溶骨性疾病。然而，龙血竭还包括其他类的多种化合物成分，比如黄酮类化合物血竭素，那么其他类的化合物是否具备抑制破骨细胞分化、防治骨质疏松和骨坏死的作用，需进一步的深入研究。

发明内容

血竭素作为龙血竭的主要成分之一，属黄酮类化合物，研究报道其可促进伤口愈合、促进肿瘤细胞凋亡等，但尚没有其对破骨细胞的抑制作用以及在改善溶骨性疾病方面的报道。本发明通过细胞实验明确了血竭素高氯酸盐化合物可抑制RANKL诱导的NFATc1活性，而抑制破骨细胞形成及骨吸收功能，作用机制涉及钙离子信号通路、MAPK信号通路和NF-κB信号通路。

本发明的目的在于克服现有技术的不足，明确了龙血竭的成分血竭素具备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的作用，提供了血竭素或血竭素高氯酸盐在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：血竭素或血竭素高氯酸盐在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途。

优选地，所述药物用于抑制RANKL诱导破骨细胞形成过程中的相关基因Acp5、c-fos、Ctsk、Mmp9、Ctr或Nfatc1的表达。

优选地，所述药物用于抑制RANKL诱导破骨细胞形成过程中的相关蛋白NFATc1、c-Fos、Integrinβ3、MMP9或CTSK的表达。

优选地，所述药物用于抑制NFATc的活性。

优选地，所述药物用于抑制RANKL诱导破骨细胞分化过程中的钙离子信号通路、MAPK信号通路或NF-κB信号通路。

优选地，所述药物的剂型为固态片剂或粉剂。

本发明提供一种药物组合物在制备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的药物中的用途，所述药物组合物的有效成分包括血竭素或血竭素高氯酸盐；所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；所述药物组合物的剂型为固态片剂或粉剂。

优选地，所述溶骨性疾病为骨质疏松症、骨坏死、Paget骨病、骨髓炎、骨囊肿、骨髓瘤、骨转移瘤、骨母细胞瘤、非骨化性纤维瘤或骨巨细胞瘤。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明所述的血竭素或血竭素高氯酸盐能抑制RANKL诱导的破骨细胞形成、抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能、抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的基因Acp5、c-fos、Ctsk、Mmp9、Ctr和Nfatc1的表达、抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的蛋白NFATc1、c-Fos、Integrinβ3、MMP9和CTSK的表达、抑制RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路以及能抑制RANKL诱导的NFATc1活性，由此说明，本发明所述的血竭素或血竭素高氯酸盐可以用于制备抑制破骨细胞形成或抑制骨吸收功能或防治溶骨性疾病的药物，具备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的作用；

(2)本发明为血竭素或血竭素高氯酸盐提供了一种新的用途，也为破骨细胞形成或骨吸收功能或溶骨性疾病的治疗提供了一种新的药物成分。

附图说明

图1为D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞形成的结果图；其中，图1A为梯度浓度的D.P逐渐抑制破骨细胞形成的数量和大小的结果图；图1B为不同浓度的D.P抑制作用下，小鼠破骨细胞的数量统计图；图1C为D.P不同浓度下对小鼠的骨髓巨噬细胞毒性检测结果图；图1D为D.P的化学结构式。注：Dracorhodin Perchlorate(D.P)，血竭素高氯酸盐；MNCs，多核细胞；Absorbance，吸光度。

图2为D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能的结果图；其中，图2A为骨吸收实验，箭头所示为破骨细胞在羟基磷灰石的骨吸收区，D.P抑制破骨细胞的骨吸收范围；图2B为骨吸收实验统计图；图2C为破骨细胞表面的肌动蛋白环荧光染色，D.P抑制肌动蛋白环的数量和面积；图2D为肌动蛋白环面积的统计图。注：Bone Resorption，骨吸收；％arearesorbed per OC，单个破骨细胞的骨吸收面积百分比；F-actin belt size per OC，单个破骨细胞肌动蛋白环大小；Fold Change，倍数。

图3为D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的基因表达的结果图；梯度浓度的D.P抑制Acp5、Ctsk、Mmp9等基因的表达。注：gene expression，基因表达；Fold Change，倍数。

图4为D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的蛋白表达的结果图；其中，图4A为蛋白代表性条带，D.P抑制破骨细胞分化相关蛋白c-Fos、Integrinβ3、MMP9、CTSK的表达；图4B为蛋白条带的表达量统计图。

图5为D.P抑制RANKL诱导的MAPK、NF-κB信号通路的结果图；其中图5A为蛋白代表性条带，D.P抑制破骨细胞分化过程中JNK、p65蛋白的磷酸化表达，抑制IκB-α蛋白的降解；图5B为蛋白条带的表达量统计图。

图6为D.P抑制RANKL诱导的NFATc1活性的结果图；其中，图6A为钙离子通道开放情况，D.P抑制钙离子通道开放的次数和强度；图6B为qPCR结果，D.P抑制Ctr、Nfatc1基因的表达；图6C为NFATc1蛋白表达的代表性条带，D.P抑制NFATc1蛋白的表达，图6D为蛋白条带的表达量统计图；图6E为NFATc1蛋白的荧光染色结果，D.P抑制NFATc1在胞质、胞核中的表达量，抑制NFATc1向细胞核内迁移。注：Intensity，强度；Calcium Oscillation，钙离子震荡。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为本发明的发明人通过破骨细胞分化实验、细胞毒性实验、肌动蛋白环及细胞核染色、骨吸收实验、钙离子震荡实验、免疫荧光染色实验、短时间梯度Westernblot实验、qPCR实验和长时间梯度Western blot实验研究血竭素高氯酸(D.P)对RANKL诱导的破骨细胞形成、RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能、RANKL诱导的破骨细胞相关的基因表达、RANKL诱导的破骨细胞相关的蛋白表达、RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路、RANKL诱导的NFATc1活性的作用结果的研究。

1.材料和试剂

①中国成都曼思特生物科技有限公司：血竭素高氯酸盐(D.P)；

②澳大利亚gibco公司：α-MEM培养基、FBS(胎牛血清)；

③美国Santa Cruz Biotechnology公司：β-actin抗体、NFATc1抗体、V-ATPase-d2抗体、CTSK抗体等；

④澳大利亚Promega公司：MTS测定试剂盒、PCR反应试剂盒

⑤澳大利亚西澳大学：M-CSF(巨噬细胞集落刺激因子)试剂、RANKL(核因子κβ配体)试剂

2.实验方法

2.1破骨细胞分化实验

将提取自6周龄C57BL/6J小鼠的骨髓巨噬细胞(BMMs)在含有完全培养基(α-MEM培养基+10％FBS+1％P/S+50ng/ml M-CSF)的T75培养瓶中培养，待BMMs分化成熟后，以每孔6x10³个细胞的比例种入96孔板中。第二天开始每孔加入50ng/ul的RANKL进行破骨细胞分化，实验组分别加入梯度浓度为0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM的D.P，对照组同时加入相同体积的PBS。每两天更换一次分化液，直至破骨细胞分化成熟。待破骨细胞分化成熟后，使用2.5％的戊二醛固定15分钟，随后进行TRAcP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色，镜下统计各组破骨细胞(细胞核数量≥3)数量。

2.2细胞毒性实验

将分化成熟的BMMs以每孔6x10³个细胞的比例种入96孔板中，第二天开始进行干预：实验组每孔分别加入梯度浓度为0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM的D.P，对照组加入相同体积的PBS，在含有10％FBS和1％P/S的α-MEM培养基中培育48小时，然后每孔加入20ul MTS试剂，避光培养2小时后使用ELISA读书器(德国BMG)检测490nm光度数以确定MTS吸光度。

2.3肌动蛋白环及细胞核染色

将分化成熟的BMMs以每孔5x10⁴个细胞的密度种入24孔板中，第二天，实验组每孔加入50ng/μl的RANKL诱导BMMs向OC分化，其中药物组加入30μM的D.P，阳性对照组加入相应体积的PBS；阴性对照组的处理同阳性对照组，但不进行诱导分化。每两天更换一次培养基或分化液，至第六天阳性对照组OC分化成熟。待细胞分化成熟后，使用PBS清洗各组细胞一次，然后使用4％多聚甲醛溶液(PH＝7.4)固定细胞10分钟，再次使用PBS清洗细胞两次；每孔加入100μl0.1％Triton X-100溶液进行破膜5分钟，随后使用3％BSA-PBS溶液室温封闭10分钟，接着室温孵育Vinculin蛋白抗体2小时，使用PBS清洗细胞三次，随后在避光条件下同时使用相应蛋白二抗(FITC标记)和鬼笔环肽对肌动蛋白环进行染色70分钟。染色完成后，继续使用PBS清洗细胞四次，接着使用Hoechst 33258底物对细胞核DNA染色10分钟。上述染色结束后，将骨片转移至载玻片上，随机使用抗荧光淬灭封闭液封闭、使用盖玻片封片，然后使用Nikon共聚焦显微镜拍照观察各组细胞肌动蛋白环面积及细胞核数量。

2.4骨吸收实验

将分化成熟的BMMs以每孔8x10⁴个细胞种到胶原板内进行破骨细胞分化，直至破骨细胞开始形成，然后将细胞转移至羟基磷灰石板中，继续进行破骨细胞诱导，并同时分别加入龙血竭提取物或PBS。待破骨细胞分化成熟后，将同组细胞中的一半孔进行TRAcP染色，另一半进行漂洗、干燥，分别观察破骨细胞数量及羟基磷灰石吸收情况，并使用Image J软件进行量化分析。

2.5钙离子震荡实验

将分化成熟的BMMs以每孔3x10⁴个细胞的密度种入96孔板中，第二天，实验组每孔加入50ng/μl的RANKL诱导BMMs向OC分化，其中药物组加入30μM的D.P，阳性对照组加入相应体积的PBS；阴性对照组的处理同阳性对照组，但不进行诱导分化。24小时后，使用含2％FBS和0.2mM羧苯磺丙胺的HBSS培养基清洗细胞两次，然后每孔加入100μl Fluo4-AM试剂，在细胞培养箱中避光孵育45分钟；继续使用上述HBSS培养基清洗细胞一次，常温避光静置20分钟后，采用荧光倒置显微镜捕捉单个细胞的钙离子通道在3分钟内的开闭信号，每两秒钟捕捉一次；并使用NIS-Elements Viewer软件定量分析各组细胞荧光强度。

2.6免疫荧光染色实验

将分化成熟的BMMs以每孔5x10⁴个细胞的密度种入玻璃板中。各组细胞分别在第1、3、5天时加入50ng/μl的RANKL诱导BMMs向OC分化，同期药物组加入30μM的D.P，对照组加入相应体积的PBS。每两天更换一次培养基或分化液，至第六天阳性对照组OC分化成熟。待细胞分化成熟后，使用PBS清洗各组细胞一次，然后使用4％多聚甲醛溶液固定细胞10分钟，再次使用PBS清洗细胞三次；每孔加入100μl 0.1％Triton X-100溶液进行破膜5分钟，随后使用3％BSA-PBS溶液室温封闭30分钟，接着先后在避光条件下室温孵育NFATc1蛋白抗体2小时、相应蛋白二抗(FITC标记)30分钟；PBS清洗一次后，使用鬼笔环肽对肌动蛋白带进行染色20分钟，使用Hoechst 33258底物对细胞核DNA染色10分钟。上述染色结束后，使用PBS清洗细胞三次，然后使用抗荧光淬灭封闭液进行封闭、使用盖玻片进行封片，应用Nikon共聚焦显微镜拍照观察各组细胞荧光强度。

2.7短时间梯度Western blot实验

将分化成熟的BMMs以每孔2.5x10⁵个细胞的密度种入6孔板中，每两天更换一次培养液，至细胞生长至覆盖培养瓶底面积的90％左右。采用不含FBS的α-MEM培养基饥饿细胞2小时，向实验组、对照组分别加入30μM的D.P和相应体积PBS，培养1小时；随后分别在第0、5、10、20、30、60分钟时向各实验组及相应对照组加入50ng/μl的RANKL。干预完成后，使用RIPA裂解液裂解细胞，并提取蛋白。使用SDS-PAGE电泳液分离蛋白，使用硝化纤维膜进行转膜，然后在4℃环境过夜孵育蛋白抗体，孵育相应二抗2小时，随后使用ECL显影液、LAS4000显影仪进行显影，使用Gel-pro软件对图像进行分析。孵育的目的蛋白抗体为anti-p-JNK、anti-IκB-α、p-p65，内参蛋白抗体分别为anti-JNK、anti-β-actin、p65。

2.8qPCR实验

将分化成熟的BMMs以每孔1x10⁵个细胞的比例种入6孔板中。第二天开始每孔加入50ng/ul的RANKL进行破骨细胞分化，同时实验组分别加入梯度浓度的D.P，对照组加入相同体积的PBS，每两天更换一次培养基。待第六天(破骨细胞分化成熟)后，使用Trizol裂解液裂解细胞，并提取RNA；使用Oligo-dT进行逆转录，随后采用SYBR Green法、使用ViiATM7Real-time PCR仪进行检测，目标基因引物序列分别为：

Acp5(上游引物:5’-TGTGGCCATCTTTATGCT-3’；

下游引物:5’-GTCATTTCTTTGGGGCTT-3’)；

Nfatc1(上游引物:5’-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3’；

下游引物:5’-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3’)；

Ctr(上游引物:5’-TGGTTGAGGTTGTGCCCA-3’；

下游引物:5’CTCGTGGGTTTGCCTCATC-3’)；

c-fos(上游引物:5’-GCGAGCAACTGAGAAGAC-3’；

下游引物:5’-TTGAAACCCGAGAACATC-3′)；

Ctsk(上游引物:5’-GGGAGAAAAACCTGAAGC-3’；

下游引物:5’-ATTCTGGGGACTCAGAGC-3’)；

Mmp9(上游引物:5’-CGTGTCTG GAGATTCGACTTGA-3’；

下游引物:5’-TTGGAAACTCACACGCCAGA-3’)；

Hmbs(上游引物:5′-AAGGGCTTTTCTGAGGCACC-3’；

下游引物:5’-AGTTGCCCATCTTTCATCACTG-3’)；

Hprt1(上游引物:5’-TCAGTCAACGGGGGACATAAA-3’；

下游引物5’-GGGGCTGTACTGCTTAACCAG-3’)；

采用△△Ct法分析各目标基因表达量。

2.9长时间梯度Western blot实验

将分化成熟的BMMs以每孔1x10⁵个细胞的比例种入6孔板中。第二天开始每孔加入50ng/ul的RANKL进行诱导破骨细胞分化，同时实验组加入30uM的D.P，对照组加入相同体积的PBS，每两天更换一次培养基。待第六天(破骨细胞分化成熟)后，使用RIPA裂解液裂解细胞，并提取蛋白。使用SDS-PAGE电泳液分离蛋白，使用硝化纤维膜进行转膜，然后在4℃环境过夜孵育NFATc1、c-Fos、Integrinβ3、MMP9、CTSK和β-actin蛋白抗体，孵育相应二抗2小时，随后使用ECL显影液、LAS 4000显影仪进行显影，使用Gel-pro软件对图像进行分析。

3.统计学处理

本发明的实验数据的统计学处理：计量资料采用表示；应用SPSS 24.0软件进行统计学分析，两组独立样本间比较采用非配对t检验，多组独立样本间比较采用相应的单因素或双因素方差分析；定义p＜0.05为差异具有统计学意义，用“*”表示；应用GraphPadPrism7软件对数据资料进行统计学绘图。

4.结果

4.1 D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞形成

本发明为验证龙血竭中的成分血竭素对破骨细胞形成的抑制作用，本发明分别使用梯度浓度为0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM的D.P对BMMs的诱导分化进行干预，结果如图1所示。由图1A和图1B可知，梯度浓度的D.P逐渐抑制破骨细胞形成的数量和大小，D.P在低浓度(5μM)开始抑制破骨细胞的形成，30μM浓度的抑制作用已较为明显；由图1C可知，药物毒性实验结果显示0μM、1μM、5μM、10μM、20μM、30μM浓度的D.P药物，不抑制骨髓巨噬细胞(BMMs)的活性，对骨髓巨噬细胞(BMMs)均无毒性。

4.2 D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能

本发明为验证龙血竭中的成分血竭素对破骨细胞骨吸收功能的抑制作用，本发明使用30μM的D.P对开始分化的破骨细胞进行干预，结果如图2所示。由图2的结果显示，实验组骨板的骨吸收面积明显小于对照组；另外，D.P可抑制破骨细胞表面肌动蛋白环及黏着斑蛋白的形成。

4.3 D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的基因表达

本发明研究选用不同浓度梯度(0μM、20μM、30μM)的D.P干预RANKL诱导的破骨细胞形成，结果如图3所示。qPCR结果显示，D.P对破骨细胞形成相关的Acp5、c-fos、骨吸收功能相关的Ctsk以及Mmp9基因表达有抑制作用，并呈剂量依赖性。

4.4 D.P抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的蛋白表达

本发明研究选用30μM的D.P干预RANKL诱导的破骨细胞形成，长时间梯度Westernblot实验结果如图4所示。结果表明，D.P可明显抑制对破骨细胞分化相关的c-Fos、Integrinβ3、MMP9及CTSK蛋白的表达。

4.5 D.P抑制RANKL诱导的MAPK、NF-κB信号通路

本发明研究选用30μM的D.P干预RANKL诱导的破骨细胞形成短时间梯度Westernblot实验结果如图5所示。结果表明，D.P可明显抑制JNK、p65蛋白的磷酸化表达，抑制IκB-α蛋白的降解，由此说明D.P抑制RANKL诱导的MAPK、NF-κB信号通路。

4.6 D.P抑制RANKL诱导的NFATc1活性

本发明的钙离子震荡实验结果如图6所示，结果表明，图6A显示D.P可抑制钙离子通道的开合；图6B-图D显示同期抑制Ctr、Nfatc1基因的表达及NFATc1蛋白表达。此外，免疫荧光染色结果显示，D.P可抑制NFATc1向细胞核内迁移。

综上所述，本发明所述的血竭素或血竭素高氯酸盐能抑制RANKL诱导的破骨细胞形成、抑制RANKL诱导的破骨细胞骨吸收功能、抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的基因表达、抑制RANKL诱导的破骨细胞相关的蛋白表达、抑制RANKL诱导的MAPK和NF-κB信号通路以及能抑制RANKL诱导的NFATc1活性，由此说明，本发明所述的血竭素或血竭素高氯酸盐可以用于制备抑制破骨细胞形成或抑制骨吸收功能或防治溶骨性疾病的药物，具备抑制破骨细胞形成或抑制破骨细胞骨吸收或防治溶骨性疾病的作用。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。