一种增强n-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

文档序号：1793995 发布日期：2021-11-05 浏览：35次 >En<

阅读说明：本技术 一种增强n-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法 (Method for enhancing yield of N-acetyl-5-hydroxytryptamine ) 是由李迪李扬凡冯斌朱敏姜黎于 2021-06-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法。由包含催化5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺相关功能基因的重组细胞转化底物5-羟色胺得到N-乙酰基-5-羟基色胺,所述的催化5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺相关功能基因的重组细胞表达N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因,或表达N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的乙酰辅酶A合成酶基因,产N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶和乙酰辅酶A合成酶。本发明通过过表达AANTA基因和ACS基因,增强AANAT催化底物5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺,明显提升了N-乙酰基-5-羟基色胺的合成产量。(The invention relates to a method for enhancing the yield of N-acetyl-5-hydroxytryptamine. Converting a substrate 5-hydroxytryptamine by a recombinant cell containing a functional gene related to catalyzing 5-hydroxytryptamine to generate N-acetyl-5-hydroxytryptamine to obtain N-acetyl-5-hydroxytryptamine, and expressing an N-acetyl-5-hydroxytryptamine transferase gene or an acetyl coenzyme A synthetase gene for enhancing the yield of N-acetyl-5-hydroxytryptamine by the recombinant cell containing the functional gene related to catalyzing 5-hydroxytryptamine to generate N-acetyl-5-hydroxytryptamine, so as to produce N-acetyl-5-hydroxytryptamine transferase and acetyl coenzyme A synthetase. According to the invention, through overexpression of the AANTA gene and the ACS gene, the generation of N-acetyl-5-hydroxytryptamine from 5-hydroxytryptamine serving as an AANAT catalytic substrate is enhanced, and the synthetic yield of the N-acetyl-5-hydroxytryptamine is obviously improved.)

一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

技术领域

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本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法。

背景技术

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N-乙酰基-5-甲氧基色胺，又名美拉酮宁，褪黑素，是一种生物钟调节激素，参与神经和外周组织细胞时钟基因的表达调控。在各种各样复杂的生理活动，N-乙酰基-5-甲氧基色胺也是一种强效的活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的自由基。同时N-乙酰基-5-甲氧基色胺作为两亲分子，容易进入所有的亚细胞结构空间包括细胞膜结构、细胞质、细胞核和线粒体中。已知的N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生理功能主要有调节生物体内昼夜节律，缓解睡眠障碍，抗氧化等；美国FDA认为N-乙酰基-5-甲氧基色胺可以作为普通的膳食补充剂。我国卫生部批准含有N-乙酰基-5-甲氧基色胺的产品作为“改善睡眠”的保健品生产销售。N-乙酰基-5-甲氧基色胺在调节免疫功能、抗衰老等方面的保健功能正显示其强大的生命力。

N-乙酰基-5-甲氧基色胺的生物合成途径主要是从色氨酸出发，经过羟基化和脱羧生成5-羟基色胺，随后在N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶的作用下生成N-乙酰基-5-羟基色胺，再经N-乙酰基-5-羟基色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶作用生成N-乙酰基-5-甲氧基色胺。N-乙酰基-5羟基色胺转移酶已经被证明是生物合成N-乙酰基-5-甲氧基色胺的关键限速酶。血液N-乙酰基-5-甲氧基色胺主要合成器官松果体中，5-羟基色胺(5-HT)来自血液中的色氨酸脱羧反应，其在N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶的催化下转变成N-乙酰基-5-羟基色胺(Ac-HT)，再经过甲氧基转移酶生成N-乙酰基-5-甲氧基色胺，而松果体内的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶的活力受到光抑制，产量很不稳定，表现出昼夜规律，不利于生产。随着合成生物学的发展，通过基因工程整合N-乙酰基-5-甲氧基色胺生物合成基因至模式微生物基因组，使N-乙酰基-5-甲氧基色胺高产，达到绿色生物制造的目的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

提供一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法，由包含催化5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺相关功能基因的重组细胞转化底物5-羟色胺得到N-乙酰基-5-羟基色胺，所述的催化5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺相关功能基因的重组细胞表达N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因，或所述的催化5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺相关功能基因的重组细胞表达N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的乙酰辅酶A合成酶基因，产N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶和乙酰辅酶A合成酶。

按上述方案，所述的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶的氨基酸序列为：

a)由SEQ ID NO：002，SEQ ID NO：004，SEQ ID NO：006，SEQ ID NO：008任一所示序列；

b)或为具有与(a)所述的氨基酸序列具有75％，优选85％，更优选95％的序列一致性，并且具有(a)所述蛋白的功能的氨基酸序列；

c)或为由a)所述的氨基酸序列的N末端和/C末端添加、替换或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成，并且具有(a)所述催化5羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺酶的功能的氨基酸序列；

所述增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的酶(乙酰辅酶A合成酶)的氨基酸序列为：

a)增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的酶氨基酸序列如SEQ ID NO：010，SEQ ID NO：012或SEQ ID NO：014所示；

b)或与(a)所述氨基酸序列具有75％，优选85％，更优选95％的序列一致性，并且具有(a)所述蛋白的功能的氨基酸序列；

c)或为由(a)所述的氨基酸序列的N末端和/C末端添加、替换或缺失1-30个，更优选1-10个，还要优选1-6个，最优选1-3个氨基酸残基而形成的，并且具有(a)所述功能的氨基酸序列。

按上述方案，所述的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因序列如SEQ ID NO：001，SEQID NO：003，SEQ ID NO：005或SEQ ID NO：007所示；所述的乙酰辅酶A合成酶基因序列如SEQID NO：009，SEQ ID NO：011或SEQ ID NO：013所示。

按上述方案，其还包括进一步地，将合成的N-乙酰基-5-羟基色胺用于N-乙酰基-5-甲氧基色胺等后续色氨酸衍生物的生产。

提供一种重组载体，所述重组载体包含如SEQ ID NO：001，SEQ ID NO：003，SEQ IDNO：005或SEQ ID NO：007中任一所述的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因。

及进一步地，提供一种包含上述重组载体或者其基因组中整合N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因的宿主细胞。

提供一种重组载体，所述的重组载体包含如SEQ ID NO：001，SEQ ID NO：003，SEQID NO：005，SEQ ID NO：007中任一所述的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶(AANAT)基因和如SEQ ID NO：009，SEQ ID NO：011或SEQ ID NO：013任一所示的乙酰辅酶A合成酶(ACS)基因。

以及进一步地，提供一种包含上述重组载体或者其基因组中整合有N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因的宿主细胞。

一种N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶，所述的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶的氨基酸序列为

a)由SEQ ID NO：002，SEQ ID NO：004，SEQ ID NO：006，SEQ ID NO：008任一所示序列；

b)或为具有与(a)所述的氨基酸序列具有75％，优选85％，更优选95％的序列一致性，并且具有(a)所述蛋白的功能的氨基酸序列；

一种重组载体的构建方法为：使用基因扩增仪扩增目的基因，并利用无缝克隆或者是酶切酶连的方式将目的基因和表达载体相连接。

按上述方案，将目的基因转入pCDF空质粒中，获得携带有pCDF复制子、大观霉素抗性基因、T7启动子的重组载体，重组载体转入宿主细胞中构建基因工程菌。

按上述方案，上述扩增目的基因的引物为：

提供一种基因工程菌的构建方法为：将上述重组载体导入宿主细胞中获得；或在宿主细胞基因组上整合N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因获得。

按上述方案，所述宿主细胞为原核细胞大肠杆菌(Escherichia coli)、谷氨酸棒状杆菌(Corynebacerium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)、黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)、粘液沙雷氏菌(Serratia marcescens)、低等真和细胞酿酒酵母(Saccharomyces cerecisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和黑曲霉菌(Aspergillus niger)细胞中的任一种。按上述方案，基因组中整合有N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和乙酰辅酶A合成酶基因的方法为：利用lamda噬菌体的同源重组酶整合cat-sacB基因至大肠杆菌的TrpR位点，整合了cat-sacB基因的菌株能够在氯霉素平板上生长；继续利用lamda噬菌体的同源重组酶将T7启动子、N-乙酰基-5羟基色胺转移酶基因、乙酰辅酶A合成酶基因片段替换大肠杆菌的cat-sacB基因，携带有cat-sacB基因的菌株无法在无盐蔗糖平板上生长，由此得到整合有T7启动子、N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因和乙酰辅酶A合成酶基的正确菌株。

提供合成N-乙酰基-5-羟基色胺的方法，步骤为：将上述基因工程菌在液体LB培养基中过夜培养，得到种子液；将种子液中的菌体接种至发酵培养基中发酵培养，发酵中流加含有底物5-羟基色胺的补料培养基，发酵后加入IPTG诱导培养合成N-乙酰基-5-羟基色胺，诱导培养中流加含有底物5-羟基色胺的补料培养基。

按上述方案，所述的LB培养基和发酵培养基中含有大观霉素。

N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶作为N-乙酰基-5-甲氧基色胺生物合成过程中的关键酶，可以将5-羟色胺转化为N-乙酰基-5-羟基色胺，但是目前已报道的N-乙酰基5-羟色胺的重组菌产量不高于2.5g/l。乙酰辅酶A作为微生物代谢通路中重要的中间代谢化合物，参与多种生物物质的合成，通过提高乙酰辅酶A以高产N-乙酰基-5-羟色胺的产量是一个新的方向。本发明通过在宿主细胞内表达高活性AANTA基因，以及进一步的结合表达ACS基因，构建了N-乙酰基-5-羟基色胺的生物合成路径。达到了通过过表达AANTA基因和ACS基因，增强AANAT催化底物5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺的能力，明显提升了N-乙酰基-5-羟基色胺的合成产量，取得了优异的效果。

本发明的有益效果：

本发明通过在宿主细胞内表达高活性AANTA基因，以及进一步的结合表达ACS基因，构建了新的N-乙酰基-5-羟基色胺的生物合成路径。达到了通过过表达AANTA基因和ACS基因，增强AANAT催化底物5-羟色胺生成N-乙酰基-5-羟基色胺，明显提升N-乙酰基-5-羟基色胺的合成产量的目的，取得了优异的效果。我们通过使用不同来源的N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶，并与不同来源的乙酰辅酶A合成功能的酶进行组合，同时过表达这两个基因，N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶产量能达到7.1g/L，是目前报道的最高水平。

附图说明

图1为pCDF-T7-A2质粒图谱；

图2为携带pCDF-T7-A1，A2，A3，A4质粒的菌株发酵生产N-乙酰基-5-羟基色胺产量；

图3为pCDF-T7-A2-ACS3质粒图谱；

图4为pCDF-T7-A2-ACS1/ACS2/ACS3菌株发酵生产N-乙酰5羟色胺产量；

图5为pCDF-T7-A4-ACS1/ACS2/ACS3菌株发酵生产N-乙酰5羟色胺产量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及实验中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞。再具体实施方式中，所述菌株包括但不限于：大肠杆菌(Eshcerichia coli)，谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)，黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，酿酒酵母(Saccharmyces cerevisiae)。在优选的实施方式中，所述菌株为大肠杆菌，本发明中也以大肠杆菌为例进行详细说明。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞在指数生长期后收获，用电穿法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是是使用MgCl₂，如果需要，转化也可以CaCl₂的方法进行。当宿主是真核细胞时，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法、常规机械方法如显微注射、电穿孔脂质体包装等。

基于本发明的教导和现有技术，本领域技术人员还可以明白，可以将本发明的重组细胞制成固定化细胞等其他利用形式。

本发明中，术语“表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定表达，任何质粒和载体都可以使用。表达载体的一个重要特征是含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制原件。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明具体筛选4种N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶和3种提高N-乙酰基-5-羟基色胺的产量的酶。基于现有技术知识，本领域普通技术人员不难知晓，本发明涉及的3种ACS酶并不限于实施例中提到的某种具体来源的酶，每种酶可以分别使用具有相同或相似催化功能的不同来源的酶替换，或可以使用实施例中的具体来源的酶的一种或多种酶的变异形式，所述变异形式具有与酶相同或相似的功能，但其氨基酸序列与本发明提供的氨基酸序列由少量差异。这些变异形式包括但不限于：一个或多个(通常是1-30个，较佳为1-10个，更佳为1-6个，最佳为1-3个)氨基酸的确实、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或多个(通常为20个以内，较佳为10个以内，更佳为6个或3个以内)氨基酸。例如，本领域技术人员熟知，用性能相近或相似的氨基酸进行取代，例如异亮氨酸与亮氨酸相互取代时，不会改变所得蛋白质的功能。再例如，再C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸，例如为便于分离而添加的蛋白标签，例如，6xHis标签通常不会改变所得蛋白质的功能。

本发明具体包括如下实施例：

实施例1：

(1)N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因AANAT的合成

根据羊的基因序列，合成N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶A1，核苷酸序列见SEQ IDNO.001，氨基酸序列见SEQ ID NO.002；根据果蝇的基因序列，合成N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶A2，核苷酸序列见SEQ ID NO.003，氨基酸序列见SEQ ID NO.004；根据小白链霉菌的基因序列，合成N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶A3，核苷酸序列见SEQ ID NO.005，氨基酸序列见SEQ ID NO.006；根据灰色链霉菌的基因序列，合成N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶A4，核苷酸序列见SEQ ID NO.007，氨基酸序列见SEQ ID NO.008。

设计N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因扩增引物，如A1基因上游引物为F1：5’--3’GAATTCCATGTCCACTCCGTCT，A1基因下游引物为R1 5’-3’AAGCTTTTAACGATCGCTGTTACG，以A1基因为模板，进行PCR扩增得到线性基因片段；按照同样的方式，对N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶A2，A3，A4进行PCR扩增得到线性基因片段，所用引物如下表所示：

(2)N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因的重组载体构建及原核表达

将扩增的A1，A2，A3，A4基因片段和pCDF空质粒分别用EcoR I和Hind III进行双酶切，回收产物以T4 DNA连接酶将其连接，获得重组载体，转入DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆测序，经鉴定测序正确，质粒命名为pCDF-T7-A1质粒，该质粒携带有pCDF复制子，大观霉素抗性基因，T7启动子，A1基因。以同样的方法获得测序结果正确质粒pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4。

提取pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4质粒，将其转入蛋白表达菌株BL21(DE3)中。分别挑取携带有pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4质粒的表达单克隆接种至3ml的LB液体培养基(含终浓度50μg/ml的大观霉素)中过夜培养。吸取1ml菌转接至100ml的LB液体中(含终浓度50μg/ml大观霉素，1mM IPTG)于30℃250rpm摇床中振荡培养8h。将异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的菌液转移至50ml的离心管中，4℃6000rpm离心5min收菌，弃上清，菌体使用PBS溶液清洗2次；清洗后的菌体放置于冰上，使用超声破碎机进行菌体破碎，超声功率为200W，超声时间1.5s，暂停3s，超声总时间20分钟，直至离心管内的溶液变得澄清透明。吸取1ml破碎后的溶液于1.5ml干净的EP管中，4℃，13000rpm离心20min，吸取上清于新的1.5ml EP管中、取破碎后离心后的上清加入适量的5*Loading buffer，混匀后沸水浴10min，之后12000rpm离心2min，吸取上清进行目的蛋白的表达情况检测。结果显示pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4质粒的蛋白在大肠杆菌生产菌株内得到良好表达。

(3)N-乙酰基-5-羟基色胺的生物发酵试验

以摇瓶试验产N-乙酰基-5-羟基色胺的菌株发酵实验，步骤为：1)种子液的制备：分别挑取(2)中整合了pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4质粒的BL21菌株接种至20ml含有大观霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基中，于37℃、250rpm培养12h；然后将20ml培养物转接至300ml含有大观霉素(终浓度50μg/ml)的LB培养基中，37℃、250rpm振荡培养12小时即可得到种子液。2)菌体培养：以10％的接种量将种子液接种到1L含有大观霉素(终浓度50μg/ml)的发酵培养基中，发酵采用5L的发酵罐，培养过程控制温度为37℃，搅拌速度(500-800转/分钟)，通气量(3L/min)控制发酵罐溶氧在30％左右，流加1M磷酸和3M氨水控制pH稳定在7.0，补料培养基流加速度为50ml/h。

其中发酵培养基为通用培养基，每1L发酵液具体组分如下：葡萄糖10g，(NH₄)₂PO₄，8g，KH₂PO₄ 13.3g，MgSO₄*7H₂O，1.2g，柠檬酸1.7g，微量盐溶液10ml，用水定容至1L，NaOH调节pH至7.0。每1L补料培养基的组分：葡萄糖400g，MgSO₄*7H₂O，10g，微量盐溶液10ml，5羟基色胺10g。每1L微量盐溶液的配置；FeSO₄*7H₂O，10g，ZnSO₄*7H₂O，2.25g，CuSO₄*5H₂O 1g，MnSO₄*5H₂O 5g，Na₂B₄O₇*10H₂O 0.23g，CaCl₂*2H₂O，2g,(NH₄)₆Mo₇O₂₄ 0.1g，用5M的盐酸调节pH，定容至1L。

诱导培养：将上述菌体培养后的发酵液的温度降至30℃，加入IPTG，使得IPTG的终浓度为1mM，进行诱导培养，诱导过程流加补料培养基，补料培养基的流加速度调至20ml/h；流加至菌体密度OD₆₀₀达到250，诱导培养过程结束，测定N-乙酰基-5羟基色胺产量。

分别测定携带pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A3，pCDF-T7-A4质粒菌株的发酵液产量，每24小时检测N-乙酰基-5-羟基色胺浓度，最终发酵96h，N-乙酰基-5-羟基色胺的产量为3.8-5.6g/L，携带有pCDF-T7-A2质粒的菌株产量明显高于pCDF-T7-A1，pCDF-T7-A2，pCDF-T7-A4质粒菌株，N-乙酰基-5-羟基色胺的产量达到了5.6g/L，见图2。

HPLC检测N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

取检测液，5000rpm离心15min吸取上清液，按照上清液：水：甲醇体积比1：7.5：1.5制成待检测样品，0.22um有机型滤器过滤除去不溶物后得到待检测HPLC检测样。HPLC检测仪为Agilent 1260 infinity LV，检测柱为Agilent ZOBAX C18柱。N-乙酰基-5-羟基色胺的紫外检测波长为275nm，流动相15％(v/v)甲醇，流速为1.0ml/min，进样量为10μl，采用外标法按照峰面积定量。

实施例2：

(1)乙酰辅酶A合成酶的串联表达质粒的构建

根据成团泛菌的基因序列，合成具有乙酰辅酶A合成功能的酶ACS1，其核苷酸序列见SEQ ID NO.009，氨基酸序列见SEQ ID NO.010；根据大肠杆菌的基因序列，合成具有乙酰辅酶A合成功能的酶ACS2，其核苷酸序列见，SEQ ID NO.011，氨基酸序列见SEQ ID NO.012；根据索氏志贺菌的基因序列，合成具有乙酰辅酶A合成功能的酶ACS3，其核苷酸序列见，SEQID NO.013，氨基酸序列见SEQ ID NO.014。

以pCDF-T7-A2质粒为载体，利用无缝克隆拼接的方法将成团泛菌ACS1、大肠杆菌的ACS2和索氏志贺菌的ACS3核苷酸在质粒上与N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶串联表达，构建得到pCDF-T7-A2-ACS1，pCDF-T7-A2-ACS2和pCDF-T7-A2-ACS3质粒，pCDF-T7-A2-ACS2如图2所示。将质粒按照实施例1的方法转化DH5α菌株，对LB平板(含终浓度50μg/ml的大观霉素)的阳性克隆进行测序验证，测序结果与SEQ ID 009，SEQ ID 011，SEQ ID 013的序列一致，证明pCDF-T7-A2-ACS1，pCDF-T7-A2-ACS2和pCDF-T7-A2-ACS3质粒构建成功。

按照上步的方法，以具有较好的N-乙酰5-羟色胺产量的pCDF-T7-A4质粒为载体，构建pCDF-T7-A4-ACS1，pCDF-T7-A4-ACS2和pCDF-T7-A4-ACS3质粒。

(2)N-乙酰基-5-羟基色胺的生物发酵试验

将上述构建的pCDF-T7-A2-ACS1，pCDF-T7-A2-ACS2和pCDF-T7-A2-ACS3质粒转入BL21(DE3)菌株中，按照实施例1的方法对串联表达的质粒进行发酵评价。发酵结果显示携带有pCDF-T7-A2-ACS3质粒的菌株的N-乙酰基-5-羟基色胺结果最好，产量达到了7.1g/L，携带有pCDF-T7-A2-ACS2和pCDF-T7-A2-ACS1质粒的菌株产量为5.8g/L和6.4g/L。

同样的将pCDF-T7-A4-ACS1，pCDF-T7-A4-ACS2和pCDF-T7-A4-ACS3质粒按照上步方法进行发酵，发酵结果如图5所示。

结果表明：通过乙酰辅酶A合成酶的串联表达，可进一步提高N-乙酰基-5-羟基色胺的合成产量，其中索氏志贺菌来源具有乙酰辅酶A合成功能的酶对N-乙酰基-5-羟基色胺的产量具有明显提升，索氏志贺菌的ACS酶增强乙酰辅酶A表达效果最佳。

实施例3：

(1)N-乙酰基-5-羟基色胺重组菌的构建

质粒上表达关键基因相较于染色体而言不太稳定，于是本实施例通过将N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶基因A2和乙酰辅酶A合成酶基因ACS3整合至大肠杆菌染色体上，得到整合型N-乙酰基-5-羟基色胺合成菌株BL-S16。

第一步，获得敲除TrpR的第一步同源重组片段I，以pXZ-SC质粒(Tan et al,2013AEM)为模板，使用引物TrpR-F和TrpR-R进行PCR扩增，得到3kb左右的PCR产物，即为第一步同源重组片段DNA，含cat,sacB基因和50bp上下游同源臂。

第二步，将敲除TrpR基因的DNA片段用于第一步同源重组：首先将pTKred(Cox etal，2010Nuclei acid Res)工具酶质粒通过电转化的方法转化至BL21菌株，然后将DNA片段1电转至携带由pTKRed质粒的BL21菌株内。

电转条件：准备带有pTKRed质粒的大肠杆菌BL21感受态细胞，(Dower etal.1998Nuclei acid Res)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段I，转移至1mm的Bio-Rad电转杯。使用Micro Pulser(Bio-Rad)电穿孔仪进行电击，电击后将感受态细胞转至1ml的LB液体培养基内，30℃75rpm孵育3h后涂布含有大观霉素(终浓度50μg/ml)和氯霉素(34μg/ml)的平板上，37℃过夜培养后，使用cat-F和sacB-R引物进行验证，挑选一个正确的单克隆，命名为BL-TrpRC。

第三步，获得同源重组的第二步片段II，以pCDF-T7-A2-ACS3质粒为模板，以T7-A2/ACS3-down为引物，扩增得到含TrpR基因上游50bp，T7启动子、A2基因，ACS3基因和TrpR基因下游50bp的同源线性片段。将扩增的片段电转至BL-TrpRC菌株。

电转条件：准备携带pTKRed质粒的BL21-TrpRC的电转化感受态细胞(制备方法参见Dower et al.1988)；将50μl感受态细胞置于冰上，加入50ng DNA片段，转移至1mm电转杯。使用Micro Pulser(Bio-Rad)电穿孔仪进行电击，电击后将感受态细胞转至1ml的LB液体培养基内，30℃75rpm孵育4h后转接至含有10％蔗糖的无盐LB液体培养基(含终浓度50μg/ml的大观霉素)中，30℃220rpm振荡培养24h后在含有6％蔗糖的无盐LB培养基(含终浓度50μg/ml的大观霉素)上划线。使用T7-A2/ACS3-down引物对单克隆进行验证，阳性克隆命名为BL-S16。

整合A2和ACS基因的引物见下表：

(2)重组菌BLR-S16的发酵

按照实施例1的方式对BLR-S1菌株进行发酵实验，HPLC产量检测到N-乙酰基-5-羟基色胺产量达到7.0g/L，达到一个较为理想的水平。

综上，本发明使用质粒对N-乙酰基-5-羟基色胺转移酶进行表达，进一步对N-乙酰基-5-羟基色胺进行增强表达串联表达，得到的目的菌株N-乙酰-5羟-色胺产量高达7.1g/L，是目前报道的最高水平。

＜110＞河北维达康生物科技有限公司

＜120＞一种增强N-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

＜160＞ 14

＜210＞ 1

＜211＞ 624bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 1

atgtccactc cgtctgttca ctgcctgaaa ccgagcccgc tgcacctgcc gtccggcatc 60

ccaggctctc cgggtcgtca gcgtcgtcac accctgccgg cgaacgaatt tcgttgcctg 120

accccggaag atgcggcggg tgttttcgaa atcgaacgtg aagcgttcat ctctgtttcc 180

ggtaactgcc cgctgaacct ggatgaagtt cagcacttcc tgaccctgtg cccggaactg 240

agcctgggct ggttcgttga aggccgtctg gttgcgttca tcatcggctc actgtgggat 300

gaagaacgtc tgacccagga atcactggcg ctgcaccgtc cgcgtggcca cagcgcgcac 360

ctgcacgcgc tggcggttca ccgtagcttc cgtcagcagg gcaaaggcag cgttctgctg 420

tggcgttacc tgcaccacgt tggcgcgcag ccggcggttc gtcgtgcggt tctgatgtgc 480

gaagatgcgc tggttccgtt ctatcagcgt ttcggcttcc acccggctgg cccgtgcgcg 540

atcgttgttg gtagcctgac cttcaccgaa atgcactgca gcctgcgtgg ccacgcggcg 600

ctgcgtcgta acagcgatcg ttaa 624

＜210＞ 2

＜211＞ 207

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 2

MSTPSVHCLK PSPLHLPSGI PGSPGRQRRH TLPANEFRCL TPEDAAGVFE IEREAFISVS 60

GNCPLNLDEV QHFLTLCPEL SLGWFVEGRL VAFIIGSLWD EERLTQESLA LHRPRGHSAH 120

LHALAVHRSF RQQGKGSVLL WRYLHHVGAQ PAVRRAVLMC EDALVPFYQR FGFHPAGPCA 180

IVVGSLTFTE MHCSLRGHAA LRRNSDR 207

＜210＞ 3

＜211＞ 723bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 3

atggaagatg cgctgaccgt tagcggcaaa ccggcggcgt gcccggttga tcaggattgc 60

ccgtacacca tcgaactgat ccagccggaa gatggcgaag cggttatcgc gatgctgaaa 120

accttcttct tcaaagatga accgctgaac accttcctgg atctgggcga atgcaaagaa 180

ctggaaaaat acagcctgaa accgctgccg gataactgca gctacaaagc ggttaacaaa 240

aaaggtgaaa tcatcggcgt tttcctgaac ggcctgatgc gtcgtccgtc cccggatgat 300

gttccggaaa aagcggcgga ttcttgcgaa cacccgaaat tcaagaaaat cctgagcctg 360

atggatcacg ttgaagaaca gttcaacatc ttcgatgttt acccggatga agaactgatc 420

ctggatggta aaatcctgag cgttgatacc aactaccgtg gtctgggcat cgctggtcgt 480

ctgaccgaac gtgcgtacga atacatgcgt gaaaacggta tcaacgttta ccacgttctg 540

tgctcttctc actactctgc gcgtgttatg gaaaaactgg gcttccacga agttttccgt 600

atgcagttcg cggattacaa accgcagggt gaagttgttt tcaaaccggc ggcgccgcac 660

gttggcatcc aggttatggc gaaagaagtt ggcccggcga aagcggcgca gaccaaactg 720

taa 723

＜210＞ 4

＜211＞ 240

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 2

MEDALTVSGK PAACPVDQDC PYTIELIQPE DGEAVIAMLK TFFFKDEPLN TFLDLGECKE 60

LEKYSLKPLP DNCSYKAVNK KGEIIGVFLN GLMRRPSPDD VPEKAADSCE HPKFKKILSL 120

MDHVEEQFNI FDVYPDEELI LDGKILSVDT NYRGLGIAGR LTERAYEYMR ENGINVYHVL 180

CSSHYSARVM EKLGFHEVFR MQFADYKPQG EVVFKPAAPH VGIQVMAKEV GPAKAAQTKL 240

＜210＞ 5

＜211＞ 549bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 3

atgaacacct tccgtaccgc gaccgcgcgt gatctgccgg atgttgcggc gaccctgacc 60

gaagcgttcg cggcggatcc gccgacccag tgggttttcc cggatggcgc ggcggcggtt 120

agccgtttct tcttcggcgt tgctgatcgt gcgcgtgaag cgggtggcat cgttgaactg 180

ctgccgggta ccgcggcgat gatcgcgctg ccgccgcacg ttcgtctgcc ggatgcgccg 240

gcgtgcggcc gccaggcgga aatgcagcgt cgcctgggcg aacgtcgtcc gcgtaccccg 300

cactactacc tgctgttcta cggcgttcgt accgcgcacc agagcagcgg cctgggtggt 360

cgtatgctga gcgatctgat cagcttggcg gatcgtgatc gtgttggcac ctacaccgaa 420

gcgagcacct ggcgtggtgc gcgtctgatg ctgcgtcacg gcttccacac cgcgcagccg 480

ctgcgtctgc cgcacggtcc tccgatgttc ccgctgtggc gtgacccgat tcatgatcat 540

tgtgattaa 549

＜210＞ 6

＜211＞ 182

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 6

MNTFRTATAR DLPDVAATLT EAFAADPPTQ WVFPDGAAAV SRFFFGVADR AREAGGIVEL 60

LPGTAAMIAL PPHVRLPDAP ACGRQAEMQR RLGERRPRTP HYYLLFYGVR TAHQSSGLGG 120

RMLSDLISLA DRDRVGTYTE ASTWRGARLM LRHGFHTAQP LRLPHGPPMF PLWRDPIHDH 180

CD 182

＜210＞ 7

＜211＞ 549bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 7

atgaacacct tccgtaccgc gaccgcgcgt gatatcccgg atgttgcggc gaccctgacc 60

gaagcgttcg cgaccgatcc gccgacccag tgggttttcc cggatggtac cgcggcggtt 120

agccgcttct tcacccacgt tgcggatcgt gttcacaccg cgggtggcat cgttgaactg 180

ctgccggacc gtgcggctat gatcgcactg ccgccgcacg ttcgtctgcc gggtgaagcg 240

gcggatggcc gtcaggcgga aatccagcgc cgtctggctg accgtcaccc gctgaccccg 300

cactactacc tgctgttcta cggcgttcgt accgcgcacc agggtagcgg cctgggcggc 360

cgtatgctgg cgcgcctgac cagccgtgcg gatcgtgatc gtgttggtac ctacaccgaa 420

gcgtccacct ggcgtggcgc gcgtctgatg ctgcgtcacg gcttccacgc gacccgtccg 480

ctgcgtctgc cggatggccc gagcatgttc ccgttatggc gtgatccgat ccacgatcac 540

agcgattaa

549

＜210＞ 8

＜211＞ 182

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 8

MNTFRTATAR DIPDVAATLT EAFATDPPTQ WVFPDGTAAV SRFFTHVADR VHTAGGIVEL 60

LPDRAAMIAL PPHVRLPGEA ADGRQAEIQR RLADRHPLTP HYYLLFYGVR TAHQGSGLGG 120

RMLARLTSRA DRDRVGTYTE ASTWRGARLM LRHGFHATRP LRLPDGPSMF PLWRDPIHDH 180

SD 182

＜210＞ 9

＜211＞ 1956bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 9

atgagccaaa tacacaaaca tcccgttcca gagaatattg cagcaaacac cctgattact 60

gcagaacagt atcaggcgat gtatcagcaa tctgtcgacg atccagacag tttctggggc 120

gaacagggca aaatccttga ctggatcaag ccttacagca aagtgaaaaa ctgctcgttt 180

gcaccaggta acattaacat tcgctggtac gaagatggca cgctcaacct ggcggcaaac 240

tgccttgacc gtcatttagc cacgcgcggc gatcacccgg cgattatctg ggaaggcgac 300

gacgccagcg aaagcaaaac cctgactttc cgccagctgc atgccgaagt ctgtcgcttc 360

gccaacgtgc tggaactgct ggaagtgaaa aaaggcgacg tggtggcgat ctatatgccg 420

atggtgccgg aagccgcagt agcgatgctg gcctgtgcgc gtatcggtgc cgttcactcg 480

gtgatctttg gcggtttctc accggaggcg gtcgcgggcc gcatcgtcga ttccagcgcc 540

tcgctggtaa tcacggccga tgaagggatc cgcgccggtc gcagcattcc gctgaagaaa 600

aatgtcgatg acgcgttaaa aaatcctaat gtcaccagcg tgaaaaacgt ggtggtgttc 660

cagcgcactg gtaaagatgt gggctgggtt gaaggccgcg atcagtggtg gcacgacctg 720

atgctgaacg cgagcaccaa ccacgctgcc gcagaagtcg gcgcggaaga tccgctgttt 780

atcctttata cctccggctc aaccggcaaa cccaaaggcg tgttgcactc caccggtggg 840

tatctggtct atgccgccac aacctttaag ttcgtctttg attaccatca ggatgatatc 900

tactggtgca ccgccgatgt tggctgggtg acgggccaca gctatctggt ttatggaccg 960

ctggcctgtg gcgccaccac actgatgttt gaaggggtgc cgaactggcc aacgccgagc 1020

cgtatggcgg aagtggtcga taaacataaa gtcacgctgc tctacaccgc gcccactgca 1080

atccgtgcgc tgatggcgga aggtgataag gcgattgccg gcaccgaccg cagcagcctg 1140

cgcattatgg gatcggtcgg tgagccaatt aacccggaag cctgggagtg gtactacaag 1200

aaaatcggca acagccgctg cccgattgtt gatacctggt ggcagaccga aaccggcggc 1260

ttcatgatca cgccgctgcc gggtgcgacc gaactgaaag cgggttccgc cacccgaccg 1320

ttctttggcg tgcagcccgc gctggtggat aacgaaggtc agccacagga aggtgcctgt 1380

gaaggcaatc tggtgatcac cgagtcgtgg ccgggtcagg cacgtaccct ctatggcgat 1440

cacgaccgtt tcgagcagac ctacttctct acctttaaaa atgtctactt cagtggtgat 1500

ggtgcccgtc gtgatgagga tggctactac tggatcaccg gacgcgtcga tgacgtgctc 1560

aatgtttccg gtcaccgact cggcaccgcc gaaattgaat cggcgctggt ctcgcaccca 1620

aaaattgccg aagcggcggt agtggggatt ccgcacagca tcaaaggcca ggcgatctat 1680

gcctatatca cgctgaatca tggcgaagag ccgtcgccgg agttgtacac cgaagtgcgc 1740

cagtgggtcc gtaaagagat tggcccgata gccacaccgg atgtgctgca ctggaccgac 1800

tcactgccga aaacccgctc cggcaaaatc atgcggcgta ttctgcgcaa aattgccacc 1860

ggggatacca gtaatcttgg tgatacttct acgctcgccg atcctggcgt agtagaaaaa 1920

ctgcttgagg agaagcagtc gatcaaaatg ccttaa 1956

＜210＞ 10

＜211＞ 651

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 10

MSQIHKHPVP ENIAANTLIT AEQYQAMYQQ SVDDPDSFWG EQGKILDWIK PYSKVKNCSF 60

APNNINIRWY EDGTLNLAAN CLDRHLATRG DHPAIIWEGD DASESKTLTF RQLHAEVCRF 120

ANVLELLEVK KGDVVAIYMP MVPEAAVAML ACARIGAVHS VIFGGFSPEA VAGRIVDSSA 180

SLVITADEGI RAGRSIPLKK NVDDALKNPN VTSVKNVVVF QRTGKDVGWV EGRDQWWHDL 240

MLNASTNHAA AEVGAEDPLF ILYTSGSTGK PKGVLHSTGG YLVYAATTFK FVFDYHQDDI 300

YWCTADVGWV TGHSYLVYGP LACGATTLMF EGVPNWPTPS RMAEVVDKHK VTLLYTAPTA 360

IRALMAEGDK AIAGTDRSSL RIMGSVGEPI NPEAWEWYYK KIGNSRCPIV DTWWQTETGG 420

FMITPLPGAT ELKAGSATRP FFGVQPALVD NEGQPQEGAC EGNLVITESW PGQARTLYGD 480

HDRFEQTYFS TFKNVYFSGD GARRDEDGYY WITGRVDDVL NVSGHRLGTA EIESALVSHP 540

KIAEAAVVGI PHSIKGQAIY AYITLNHGEE PSPELYTEVR QWVRKEIGPI ATPDVLHWTD 600

SLPKTRSGKI MRRILRKIAT GDTSNLGDTS TLADPGVVEK LLEEKQSIKM P 651

＜210＞ 11

＜211＞ 1959bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 11

atgagccaaa ttcacaaaca caccattcct gccaacatcg cagaccgttg cctgataaac 60

cctcagcagt acgaggcgat gtatcaacaa tctattaacg tacctgatac cttctggggc 120

gaacagggaa aaattcttga ctggatcaaa ccttaccaga aggtgaaaaa cacctccttt 180

gcccccggta atgtgtccat taaatggtac gaggacggca cgctgaatct ggcggcaaac 240

tgccttgacc gccatctgca agaaaacggc gatcgtaccg ccatcatctg ggaaggcgac 300

gacgccagcc agagcaaaca tatcagctat aaagagctgc accgcgacgt ctgccgcttc 360

gccaataccc tgctcgagct gggcattaaa aaaggtgatg tggtggcgat ttatatgccg 420

atggtgccgg aagccgcggt tgcgatgctg gcctgcgccc gcattggcgc ggtgcattcg 480

gtgattttcg gcggcttctc gccggaagcc gttgccgggc gcattattga ttccaactca 540

cgactggtga tcacttccga cgaaggtgtg cgtgccgggc gcagtattcc gctgaagaaa 600

aacgttgatg acgcgctgaa aaacccgaac gtcaccagcg tagagcatgt ggtggtactg 660

aagcgtactg gcgggaaaat tgactggcag gaagggcgcg acctgtggtg gcacgacctg 720

gttgagcaag cgagcgatca gcaccaggcg gaagagatga acgccgaaga tccgctgttt 780

attctctaca cctccggttc taccggtaag ccaaaaggtg tgctgcatac taccggcggt 840

tatctggtgt acgcggcgct gacctttaaa tatgtctttg attatcatcc gggtgatatc 900

tactggtgca ccgccgatgt gggctgggtg accggacaca gttacttgct gtacggcccg 960

ctggcctgcg gtgcgaccac gctgatgttt gaaggcgtac ccaactggcc gacgcctgcc 1020

cgtatggcgc aggtggtgga caagcatcag gtcaatattc tctataccgc acccacggcg 1080

atccgcgcgc tgatggcgga aggcgataaa gcgatcgaag gcaccgaccg ttcgtcgctg 1140

cgcattctcg gttccgtggg cgagccaatt aacccggaag cgtgggagtg gtactggaaa 1200

aaaatcggca acgagaaatg tccggtggtc gatacctggt ggcagaccga aaccggcggt 1260

ttcatgatca ccccgctgcc tggcgctacc gagctgaaag ccggttcggc aacacgtccg 1320

ttcttcggcg tgcaaccggc gctggtcgat aacgaaggta acccgctgga gggggccacc 1380

gaaggtagcc tggtaatcac cgactcctgg ccgggtcagg cgcgtacgct gtttggcgat 1440

cacgaacgtt ttgaacagac ctacttctcc accttcaaaa atatgtattt cagcggcgac 1500

ggcgcgcgtc gcgatgaaga tggctattac tggataaccg ggcgtgtgga cgacgtgctg 1560

aacgtctccg gtcaccgtct ggggacggca gagattgagt cggcgctggt ggcgcatccg 1620

aagattgccg aagccgccgt agtaggtatt ccgcacaata ttaaaggtca ggcgatctac 1680

gcctacgtca cgcttaatca cggggaggaa ccgtcaccag aactgtacgc agaagtccgc 1740

aactgggtgc gtaaagagat tggcccgctg gcgacgccag acgtgctgca ctggaccgac 1800

tccctgccta aaacccgctc cggcaaaatt atgcgccgta ttctgcgcaa aattgcggcg 1860

ggcgatacca gcaacctggg cgatacctcg acgcttgccg atcctggcgt agtcgagaag 1920

ctgcttgaag agaagcaggc tatcgcgatg ccatcgtaa 1959

＜210＞ 12

＜211＞ 652

＜212＞ PRT

＜213＞人工序列

＜400＞ 12

MSQIHKHTIP ANIADRCLIN PQQYEAMYQQ SINVPDTFWG EQGKILDWIK PYQKVKNTSF 60

APGNVSIKWY EDGTLNLAAN CLDRHLQENG DRTAIIWEGD DASQSKHISY KELHRDVCRF 120

ANTLLELGIK KGDVVAIYMP MVPEAAVAML ACARIGAVHS VIFGGFSPEA VAGRIIDSNS 180

RLVITSDEGV RAGRSIPLKK NVDDALKNPN VTSVEHVVVL KRTGGKIDWQ EGRDLWWHDL 240

VEQASDQHQA EEMNAEDPLF ILYTSGSTGK PKGVLHTTGG YLVYAALTFK YVFDYHPGDI 300

YWCTADVGWV TGHSYLLYGP LACGATTLMF EGVPNWPTPA RMAQVVDKHQ VNILYTAPTA 360

IRALMAEGDK AIEGTDRSSL RILGSVGEPI NPEAWEWYWK KIGNEKCPVV DTWWQTETGG 420

FMITPLPGAT ELKAGSATRP FFGVQPALID NEGNPLEGAT EGSLVITDSW PGQARTLFGD 480

HERFEQTYFS TFKNMYFSGD GARRDEDGYY WITGRVDDVL NVSGHRLGTA EIESALVAHP 540

KIAEAAVVGI PHNIKGQAIY AYVTLNHGEE PSPELYAEVR NWVRKEIGPL ATPDVLHWTD 600

SLPKTRSGKI MRRILRKIAA GDTSNLGDTS TLADPGVVEK LLEEKQAIAM PS 652

＜210＞ 13

＜211＞ 1959 bp

＜212＞ DNA

＜213＞人工序列

＜400＞ 13