具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的方案，下面结合本发明示例中的附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例仅仅是本发明的一部分示例，而不是全部的示例。基于本发明中的示例，本领域的普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下，所获得的所有其他实施方式都应当属于本发明保护的范围。

在本示例中，发明人对小白链霉菌抗真菌活性次生代谢产物进行了分析与鉴定。对Streptomyces albulus strain CK-15全基因组测序及次级代谢产物生物信息学分析：首先，对产生菌液体培养，提取得到CK-15全基因组DNA，经过RNA酶降解等处理，进行全基因组测序。其次，进行CK-15全基因DNA组提取，由于进行全基因组三代测序需要足量的浓度和纯度较高的DNA样品，故示例采取手提法提取全基因组DNA。

测序组装结果显示，全基因组总长度为9426086bp，GC含量为72.33％。结合NR、COG、KEGG以及GO数据库对全基因组进行基因功能注释，结果显示全基因组共预测到9077个开放阅读框，占整个基因组长度的83.16％。对编码基因、重复序列、非编码RNA等进行预测，获取测序CK-15基因组的组成情况，基因组共编码68个tRNA(总长度5156bp)，7个5s rRNA(总长度803bp)、7个16s rRNA(总长度10619bp)、7个23s rRNA(总长度21819bp)和20个sRNA(总长度1487bp)。

分析预测CK-15抗真菌活性次级代谢基因簇：利用anti-SMASH、ThioFinder等数据库对全基因组序列进行分析，分析得到全基因组共包含39个次级代谢基因簇，基因簇种类包括：核苷类、聚酮类、非核糖体肽类、丁内酯类、乳酸菌肽类、细菌素类、嗜铁素类、四氢嘧啶类、萜烯类等，其中具有抗真菌作用的物质包括谷氏菌素、纳他霉素、Oxazolepoxidomycin、Warkmycin、丰加霉素、茴香霉素、制霉菌素。

参见图1，通过转录组分析发现，上述分析到的7种抗真菌活性代谢产物，仅有5种有相关基因的表达，因此证明，谷氏菌素、纳他霉素、丰加霉素、茴香霉素、制霉菌素是有产物生成的，Oxazolepoxidomycin、Warkmycin的生物合成量极小，可以忽略不计。综上所述，认为Streptomyces albulus CK-15抗真菌活性次级代谢产物含有谷氏菌素、纳他霉素、丰加霉素、茴香霉素、制霉菌素。

综上，本示例提供了一种茴香霉素的制备方法，包括：取小白链霉菌CK-15的菌株种子液接种于种子培养基，28℃、220rpm培养24h后，按照5％接种量转接至100ml发酵培养基中，30℃发酵5d，将得到的发酵液经离心处理，收集第一上清液；

将第一上清液的pH调至9.0，用与上清液等体积的乙酸乙酯萃取第一有机相；

用与第一有机相等体积的pH为2.0的酸水对第一有机相反向萃取，收集水相并将水相的pH调至9.0；

用与水相等体积的乙酸乙酯萃取，收集第二有机相并旋干。

本示例的茴香霉素的制备方法，通过小白链霉菌CK-15菌株进行发酵制备茴香霉素，相比于采用化学合成方法制备茴香霉素，该制备方法简单，方便操作，成本较低。

在本示例中，种子培养基采用2g葡萄糖、0.6g蛋白胨、0.6g酵母粉、1g的NaCl和100ml蒸馏水混合而成，并在121℃下灭菌30min。

在本示例中，发酵培养基采用10g玉米粉、20g可溶性淀粉、10g黄豆饼粉、0.2g的KH₂PO₄、3g的NaCl、3g的NH₄Cl、4g的CaCO₃、1L的蒸馏水混合而成，且pH＝7.0。

在本示例中，菌株种子液的制备方法为：切取1cm×1cm菌块，接种于种子培养基中，在28℃、220rpm培养24h，获得种子液。

需要说明的是，收集第二有机相后，需要将其放置在-30℃条件下保存，以防止其发生降解。在收集第二有机相后，为了检测和验证在第二有机相中存在茴香霉素，以便确定后续茴香霉素的制备方法和制备难度。因此，本示例提供了一种采用上述制备方法制备的茴香霉素的检测方法，包括：

将第二有机相采用甲醇溶解，高速离心10min，得到的第二上清液用0.22μm的有机相滤膜或水相滤膜过滤除杂；

参见图2和图3，将茴香霉素的标准品与过滤后的第二上清液的HPLC色谱图进行比较；其中，HPLC检测条件：使用Agilent 150×21mm C18-SB反相色谱柱，检测波长设为223nm和280nm，流速为0.5ml/min，流动相A相为含0.2％甲酸或者TFA的水，B相为100％甲醇。其中检测程序设置方法如下表：

茴香霉素标准品与CK-15中间产物的HPLC检测条件

质谱检测参数设置：正离子模式，高招气体流速(drying gas flow)设定为10ml/min，喷雾器压力(nebulizer pressure)设定位30psi，干燥气体温度(drying gastemperature)设定为350℃，分子量扫描范围为50-800(m/z)，多级质谱断裂碎片分析的轰击电压设置范围为0.8-1.1V。

通过图2和图3的对比可知，能够充分说明CK-15发酵的中间产物含有茴香霉素。

在本示例中，茴香霉素的制备方法还包括：

将第二有机相通过大孔吸附树脂HP-20预处理，具体地，使用水和乙醇浓度配比从0:100到100:0对第二有机相进行梯度洗脱，例如，可以用乙醇含量依次为100％、80％、60％、40％、20％、0％(即为水)对第二有机相进行梯度冲洗。

依次通过ODS、Sephadex LH-20层析，采用乙酸乙酯与甲醇比例从20:1到1:20进行梯度洗脱，去第二有机相中的杂质，获得茴香霉素粗品；

将茴香霉素粗品用甲醇溶解，经滤膜过滤后，采用HPLC收集茴香霉素出现峰值时的液相，将液相在60℃以下减压浓缩干燥，冷冻干燥后得到淡黄色的茴香霉素粉末。具体地，在本示例中，粗品用甲醇溶解，制成10mg/mL的样品，经滤膜过滤后备用。分析色谱发现茴香霉素标准品在10min左右出峰，流动相相是甲醇-水(体积比40:60)，流速：0.7ml/min，检测波长:225nm；柱温：25℃，进样量10μL，半制备型HPLC分离制备，收集保留时间约为10分钟，将其在60℃以下减压浓缩干燥，最后冷冻干燥得到淡黄色粉末170mg即为茴香霉素，经峰面积归一法计算，制备所得茴香质量分数为98.1％。

本示例还提供了一种采用上述制备方法制备的茴香霉素的抑菌应用，包括：分别在不加茴香霉素的PDA培养基和含有100μg/ml茴香霉素的PDA培养基上表面放入预定直径的供试病原真菌菌饼，24℃恒温培养3-4d后，十字交叉法测量菌落直径，计算菌丝生长抑制率：其中，

菌丝生长抑制率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％；通过测定牛津杯法测定抑菌区直径。

采用本示例的制备方法制备的茴香霉素具有较好的拮抗作用。

需要说明书的是，在本示例中，供试病原真菌菌饼的直径为5mm。可以在多个不同的不加茴香霉素的PDA培养基和含有100μg/ml茴香霉素的PDA培养基上分别放入多个供试病原真菌菌饼，以便进行多组对比试验，例如进行3组对比试验，更准确地得到茴香霉素抗菌作用的数据；在计算菌丝生长抑制率时，对于对照菌落直径和处理菌落直径可以分别取多组数据的平均值进行计算。

在本示例中，供试病原真菌菌饼上的菌可以为葡萄黑腐病菌(Phyllostictaampelicida)、苹果树腐烂病菌(Valsa ceratosperma)、葡萄溃疡病菌(Botryosphaeriadothidea)、黄瓜炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)、烟草赤星病菌(Alternariaalternata)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、番茄叶霉病菌(Fulvia fulva)、灰霉病(Botrytis cinerea)或小麦镰刀菌(Fusarium graminearum)的其中一种，采用本示例制备方法制备的茴香霉素对上述9种植物病原菌菌丝生长的抑制作用见下表：

从上表可知，茴香霉素对9种不同的的病原真菌具有良好的抗菌活性，结果表明9种植物病原菌的生长受到茴香霉素的抑制，茴香菌素对葡萄黑腐病菌、苹果树腐烂病菌的抑制效率超过90％，对葡萄溃疡病菌、黄瓜炭疽菌、烟草赤星病菌、玉米小斑病菌、番茄叶霉病菌、灰霉病的抑制效率达到89％-78％，对小麦镰刀菌的菌丝体生长抑制效果较弱，仅为58％。这些结果证实了茴香菌素对多种植物病原菌的抑菌作用。

最后，可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。