霍华德氏肠杆菌fx-02发酵生产吲哚乙酸的方法
阅读说明：本技术 霍华德氏肠杆菌fx-02发酵生产吲哚乙酸的方法 (Method for producing indoleacetic acid by virtue of Enterobacter hollandii FX-02 fermentation ) 是由 赵国群 徐科玉 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于发酵技术领域,公开了一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法,将霍华德氏肠杆菌FX-02接种到种子培养基中,获得FX-02种子液,并将获得的FX-02种子液接种到发酵培养基中,进行摇床振荡培养,发酵结束后,即得到含IAA的发酵液。本发明采用霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸(IAA)的反应过程条件温和、能耗低、不使用有毒有害物质、没有环境污染,IAA的产量能够满足微生物发酵法生产IAA的要求。(The invention belongs to the technical field of fermentation, and discloses a method for producing indoleacetic acid by fermenting Enterobacter hollandii FX-02. The method for producing the indoleacetic acid (IAA) by fermenting the Enterobacter howsoensis FX-02 has the advantages of mild reaction process conditions, low energy consumption, no use of toxic and harmful substances and no environmental pollution, and the yield of the IAA can meet the requirement of producing the IAA by a microbial fermentation method.)
技术领域
本发明属于发酵技术领域，涉及一种发酵生产吲哚乙酸的方法，具体涉及一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法。
背景技术
吲哚乙酸(Indole-3-aceticacid，IAA)，分子式为C10H9NO2，纯品为浅黄色结晶，对光和空气敏感，易溶于无水乙醇、乙酸乙酯、二氯乙烷，可溶于乙醚和丙酮，不溶于苯、甲苯、汽油、水及氯仿。吲哚乙酸是一种植物生长调节剂，能够促进细胞生长，使细胞的体积和重量增加，还具有促进细胞分裂和分化、调节生根等生理功能。施用 IAA可以促进作物生长、提高作物产量，因而广泛使用于农业生产上。
目前吲哚乙酸的工业生产方法主要为化学合成法，在吲哚乙酸的生产过程中，其需要高温高压，并使用甲醛、氰化钾等有毒物质，且成品价格贵。不仅能耗高，同时还会产生大量有害废液，造成环境污染。通过利用微生物发酵法生产IAA具有反应条件温和、能耗低、不使用有毒有害物质、没有环境污染、生产成本低等优点，因而具有很好的市场前景。现有的通过微生物发酵法生产的发酵液中IAA含量很低，均＜1000mg/L，不能满足微生物发酵法规模化生产IAA的要求。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法，通过将霍华德氏肠杆菌FX-02接种到种子培养基中得到FX-02种子液，然后将FX-02 种子液接种到发酵培养基进行发酵，发酵结束后，所获得的发酵液中IAA含量可基本满足微生物发酵法生产吲哚乙酸的要求。
本发明为实现上述目的，所采用的技术方案如下：
一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法，包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.0～7.2；
S2、制作发酵培养基：碳源10.0～12.0g/L、蛋白胨8.0～10.0g/L、色氨酸10.0g/L、无机盐1.2～1.5g/L、磷酸氢二钾1.5～1.8g/L、水1L，pH值调至7.0～7.2；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02接种到种子培养基中，摇床振荡培养，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基灭菌、冷却；按照5～10％(V/V)的接种量接入 FX-02种子液，摇床振荡培养，发酵结束后，即得到含IAA的发酵液。
作为限定，所述霍华德氏肠杆菌FX-02拉丁文名称为Enterobacter hormaecheiFX-02，于2021年4月19日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO.M2021409，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学。
作为第二种限定，步骤S2中，所述碳源为甘油或淀粉，无机盐为氯化钙或硫酸镁。
作为第三种限定，步骤S3中，在30℃、180r/min摇床振荡培养24h。
作为第四种限定，步骤S4中，发酵培养基在121℃灭菌20min，冷却至30℃；
接入FX-02种子液后，在28～30℃、180～220r/min摇床振荡培养72～84h。
作为第五种限定，步骤S4中，得到的含IAA的发酵液中，IAA含量为2300～2737.1mg/L。
本发明的原理：霍华德氏肠杆菌FX-02是一株从蔬菜根际土壤中筛选出的产IAA能力较强的细菌菌株。IAA属于微生物的次级代谢产物，而色氨酸是合成IAA的前体。前体的浓度对次级代谢产物有很大的影响。但前体浓度较低时对产物合成有促进作用，当前体浓度较高时则有毒性，对产物合成有抑制作用。前体的适宜浓度与微生物菌种有关。据文献报道，多数微生物的IAA适宜浓度为0.6～5.0g/L。研究表明，霍华德氏肠杆菌FX-02生物合成IAA的途径为色氨酸依赖型，而且霍华德氏肠杆菌 FX-02具有很强的色氨酸转化能力，对色氨酸耐受浓度高达10.0g/L。当发酵培养基中含有较高浓度的色氨酸时，霍华德氏肠杆菌FX-02可以大量合成IAA，从而实现高产IAA。碳源、氮源及无机盐均对微生物合成IAA有显著的影响。研究表明，霍华德氏肠杆菌FX-02产IAA最适碳源、氮源及无机盐分别为甘油、蛋白胨和氯化钙。综上，本发明的原理是使用产IAA能力较强且有很强的色氨酸转化能力的霍华德氏肠杆菌FX-02，并使用优化的培养基，最终获得高IAA含量的发酵液。
本发明由于采用了上述的技术方案，其与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
(1)本发明通过霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸IAA，减少了调节剂化学合成过程的环境污染，具有反应条件温和、能耗低、不使用有毒有害物质、没有环境污染、生产成本低等优点；
(2)本发明通过霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸IAA，制备的发酵液中IAA含量高达2737.1mg/L，基本上满足了微生物发酵法生产IAA的要求；
(3)本发明提供的发酵培养基及培养条件简单，操作方便，生产成本低，吲哚乙酸产量高，易于工业化生产，节能环保，经济和社会效益巨大；
(4)本发明提供的霍华德氏肠杆菌FX-02生长速度快、发酵周期短、易于规模化生产。
本发明提供的霍华德氏肠杆菌FX-02可以通过发酵生产得到高产量的吲哚乙酸，基本满足微生物发酵法生产吲哚乙酸的要求，属于发酵技术领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本领域的技术人员应当理解，本发明并不限于以下实施例，任何在本发明具体实施例基础上做出的改进和变化都在本发明权利要求保护的范围之内。
实施例1一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法
本实施例包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.0；
S2、制作发酵培养基：甘油10.0g/L、蛋白胨10.0g/L、色氨酸10.0g/L、硫酸镁1.2g/L、磷酸氢二钾1.5g/L、水1L，pH值调至7.2；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02斜面菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至30℃；按照5％(V/V)的接种量接入FX-02种子液，30℃、180r/min摇床振荡培养72h，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为2349.40mg/L。
实施例2一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法
本实施例包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.1；
S2、制作发酵培养基：甘油12.0g/L、蛋白胨9.0g/L、色氨酸10.0g/L、氯化钙 1.3g/L、磷酸氢二钾1.7g/L、水1L，pH值调至7.0；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02斜面菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至30℃；按照10％(V/V)的接种量接入FX-02种子液，30℃、180r/min摇床振荡培养80h，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为2737.1mg/L。
实施例3一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法
本实施例包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.1；
S2、制作发酵培养基：淀粉12.0g/L、蛋白胨8.0g/L、色氨酸10.0g/L、氯化钙 1.5g/L、磷酸氢二钾1.6g/L、水1L，pH值调至7.2；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02斜面菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至30℃；按照8％(V/V)的接种量接入FX-02种子液，28℃、200r/min摇床振荡培养84h，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为2668.5mg/L。
实施例4一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法
本实施例包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.2；
S2、制作发酵培养基：淀粉10.0g/L、蛋白胨8.0g/L、色氨酸10.0g/L、氯化钙 1.2g/L、磷酸氢二钾1.8g/L、水1L，pH值调至7.1；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02斜面菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至30℃；按照6％(V/V)的接种量接入FX-02种子液，29℃、220r/min摇床振荡培养75h，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为2300mg/L。
实施例5一种霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸的方法
本实施例包括以下步骤：
S1、制作种子培养基：蛋白胨10.0g/L、酵母浸粉5.0g/L、NaCl 10.0g/L、水1L， pH值调至7.2；
S2、制作发酵培养基：甘油11.0g/L、蛋白胨10.0g/L、色氨酸10.0g/L、硫酸镁1.5g/L、磷酸氢二钾1.6g/L、水1L，pH值调至7.0；
S3、制备FX-02种子液：将霍华德氏肠杆菌FX-02斜面菌株接种到种子培养基中，30℃、180r/min摇床振荡培养24h，获得FX-02种子液；
S4、IAA发酵：将发酵培养基在高压灭菌锅中121℃灭菌20min，冷却至30℃；按照7％(V/V)的接种量接入FX-02种子液，28℃、180r/min摇床振荡培养82h，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为2562.8mg/L。
实施例6色氨酸对霍华德氏肠杆菌FX-02生产吲哚乙酸的影响
本实施例的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于色氨酸的用量不同，通过采用不同浓度的色氨酸，按照实施例1的步骤进行生产得到含IAA的发酵液样品 N1～N5，以验证色氨酸对霍华德氏肠杆菌FX-02生产吲哚乙酸的影响，其中色氨酸的用量以及改变色氨酸的用量后得到的样品中的IAA含量具体如表1所示。
表1色氨酸的用量及得到的样品中的IAA含量
由表1可知，样品N1～N5及实施例1制备时分别采用了不同浓度的色氨酸，说明当色氨酸的浓度为10.0g/L时，得到的含IAA的发酵液中IAA含量最高。
实施例7对比试验
对比例1
采用培养皿转接摇瓶液体培养的方法，首先用去皮的马铃薯200g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1L，自然pH，121℃灭菌20min制成培养基；接菌后在温度30℃，转速 130r/min，无光条件下连续培养发酵10天。利用抽滤法分离发酵菌丝和菌液两部分，然后以乙酸乙酯和菌液1:1的比例进行萃取，共萃取3次。将乙酸乙酯萃取液合并，浓缩蒸干后，用色谱级甲醇定容至3mL。高效液相法测定参数包括：色谱柱为Venusil ASB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为水-乙腈(v:v，65:35)；检测波长为 280nm，流速1mL/min，柱温25℃。经过测算，发酵液中3-吲哚乙酸含量达到1.8mg/L，标记为D1。
对比例2
(1)种子液制备：将肠杆菌(Enterobactersp.)LY6斜面菌株接种到LB液体培养基中，35℃、150r/min振荡培养，待菌液在600nm波长下吸光度达0.7时，按3％接种量(V/V)接种到装有LB液体培养基的种子发酵罐中，35℃，搅拌速度180r/min，通无菌空气进行发酵，发酵7h，菌液为二级种子液。LB培养基成分为：胰蛋白胨10 g·L-1，酵母膏5g·L-1，NaCl10g·L-1，pH 7.2；
(2)接种及发酵：将发酵所用培养基121℃灭菌20min以后冷却至37℃，将二级种子液接种到已经灭菌冷却的发酵所用培养基中(发酵所用培养基成分如下，按重量百分比计：胰蛋白胨0.8％、酵母膏0.4％、NaCl0.7％、葡萄糖2％、水1L、pH 7.2)，通气发酵12h以后补加下列物质：果糖0.7％、L-色氨酸0.12％、丙酮酸钠 0.02％、硫酸铜0.01％；维持温度36℃、pH7.2、搅拌速度160r/min、发酵罐压力 0.07Mpa、溶氧50mg/kg，发酵40h。发酵结束后加入稳定剂，即成为含吲哚乙酸575. 2mg/kg的发酵液，标记为D2。
对比例3
本对比例与实施例1步骤基本相同，不同之处仅在于步骤S1中的碳源为糖蜜，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为1727.4mg/L，标记为D3。
对比例4
本对比例与实施例1步骤基本相同，不同之处仅在于步骤S1中的氮源为氯化铵，发酵结束后，得到的含IAA的发酵液中IAA含量为623.7mg/L，标记为D1。
如表2所示为对比例1～4与实施例1分别制得的含IAA的发酵液中IAA含量的对比结果。
表2对比结果
如表2所示，实施例1通过与对比例D1～D2即通过其他微生物发酵法生产IAA 的方法进行对比可知，实施例1制得的含IAA的发酵液中IAA含量要高出许多，说明通过霍华德氏肠杆菌FX-02能够高产IAA；实施例1通过与对比例D3～D4对比可知，通过霍华德氏肠杆菌FX-02发酵生产吲哚乙酸时，碳源采用甘油，无机盐采用硫酸镁时，制备的含IAA的发酵液中IAA含量较高。
需要说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对上述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。