一种l-肌肽合成酶的制备工艺
阅读说明：本技术 一种l-肌肽合成酶的制备工艺 (Preparation process of L-carnosine synthetase ) 是由 张礼 秦振华 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种L-肌肽合成酶的制备工艺,以β-丙氨酸、L-组氨酸盐酸盐为原料,MnCl-2为催化剂,加入L-肌肽水解酶,在pH 8.0-8.5,35-40℃温度条件下通过酶促反应催化合成L-肌肽。本发明针对肌肽水解酶催化的酶法逆水解合成L-肌肽中现有技术上的不足,对转化工艺条件进行了优化,提高了肽水解酶合成L-肌肽的效率和产物浓度,该制备工艺具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便,产物浓度高,转化效率高以及生产成本低等优点。(The invention discloses a preparation process of L-carnosine synthetase, which takes beta-alanine and L-histidine hydrochloride as raw materials and MnCl 2 Adding L-carnosine hydrolase as a catalyst, and catalytically synthesizing the L-carnosine by an enzymatic reaction at the temperature of 35-40 ℃ and the pH of 8.0-8.5. Aiming at the defects in the prior art in the synthesis of L-carnosine by enzymatic reverse hydrolysis catalyzed by carnosine hydrolase, the invention optimizes the conversion process conditions, improves the efficiency of synthesizing the L-carnosine by the peptide hydrolase and the product concentration, and has the advantages of low raw material price, short enzyme conversion time, simple and convenient operation, high product concentration, high conversion efficiency, low production cost and the like.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种L-肌肽合成酶的制备工艺。
背景技术
左旋肌肽（L-carnosine, N-β-Alanyl-L-histidine），又名β-丙氨酰-L-组氨酸，分子式：C9H14N4O3，分子量为226.23，是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸两种氨基酸缩合得到的二肽，为结晶状固体。1900年首次在牛肉中发现，在哺乳动物的大脑、肌肉和其他组织中广泛存在，是一种具有天然的活性二肽。
L-肌肽有抗氧化作用，有抗衰老功能，对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有治疗效果，还有抗肿瘤等生物活性。在鲜肉贮存时添加肌肽可提高肉的风味，并延长货架期。L-肌肽已被证实可清除在氧化应激过程中使细胞膜的脂肪酸过度氧化而形成的活性氧自由基（ROS）以及α-β不饱和醛，化妆品中添加肌肽可延缓皮肤衰老。与其他抗氧化剂相比，L-肌肽具有抗氧化能力强、无毒副作用的优点，并有多种生理活性，在医药、保健、卫生、美容等领域有广泛的应用前景。目前，L-肌肽新的生理活性与机制的探索仍是热点。
目前，L-肌肽的生产方法包括两大类：化学合成法和生物合成法。采用化学合成法制备L-肌肽，需要对底物β-丙氨酸和L-组氨酸的活性基团普遍需要复杂的保护-去保护步骤，合成步骤繁琐，反应条件苛刻，产品收率低，污染大，有毒试剂残留等问题。与之相比，生物合成法具有反应条件温和、合成路线短、环境友好、产品光学纯度高等优点，更适合于工业化，将逐渐取代传统的化学合成方法。
根据使用的酶以及其合成反应类型的不同，酶法合成制备L-肌肽可以分为以下两类：(1)β-氨肽酶催化β-丙氨酰胺/β-丙氨酸酯与L-组氨酸的缩合转化合成L-肌肽（申请公布号为CN107217048A的专利文献）；(2)肌肽水解酶催化β-丙氨酸与L-组氨酸的逆水解反应合成L-肌肽（申请公布号为CN109468303A的专利文献）。但是，氨肽酶催化的L-肌肽合成反应，仍然需要采用化学法对β-丙氨酸的羧基或L-组氨酸的氨基进行活化，反应步骤复杂，存在环境污染和成本上升的问题。
在生物体内，肌肽水解酶能够在水相中水解肌肽，生成β-丙氨酸和L-组氨酸，这是一个可逆反应。与氨肽酶催化的L-肌肽合成反应相比，肌肽水解酶催化的L-肌肽逆水解反应无需对底物进行化学活化和保护，催化步骤少，更加绿色环保，工艺简单，工业应用前景广阔。
然而在现有技术中，公开报道的肌肽水解酶品种少，催化活性低，反应时间长，产物浓度低，不能达到工业化生产要求。因此，需要在现有基础上进一步优化酶转化工艺，以便在较短反应时间内获得较高浓度的目标产物，从而满足工业化生产L-肌肽的技术要求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种L-肌肽合成酶的制备工艺，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种L-肌肽合成酶的制备工艺，以β-丙氨酸、L-组氨酸盐酸盐为原料，MnCl2为催化剂，加入L-肌肽水解酶，在pH 8.0-8.5，35-40℃温度条件下通过酶促反应催化合成L-肌肽。
优选的，包括以下步骤：
步骤1：以水为反应溶剂，将L-组氨酸盐酸盐溶于水内得到反应液；
步骤2：用pH值调节液调节反应液的pH值；
步骤3：在一定温度下，对调节pH值后的反应液内加入β-丙氨酸和催化剂MnCl2，进行转化反应；
步骤4：原料β-丙氨酸加料完成后在反应釜内继续搅拌反应；
步骤5：加入L-肌肽水解酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸盐酸盐的逆水解反应生成反应混合物；
步骤6：从反应混合物分离提取产物L-肌肽。
优选的，L-组氨酸盐酸盐和β-丙氨酸的摩尔浓度为1∶20-50。
优选的，在步骤2中，pH值调节液选用稀碱液。
优选的，在步骤3中，转化的周期为8h，转化的过程中继续用pH值调节液控制反应液的pH值。
优选的，在步骤3中，每隔2h取样用HPLC检测一次在进行转化反应的反应液浓度。
优选的，在步骤4中，搅拌反应的反应时间为30-60min，搅拌的速度为145-155rpm。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明针对肌肽水解酶催化的酶法逆水解合成L-肌肽中现有技术上的不足，对转化工艺条件进行了优化，提高了肽水解酶合成L-肌肽的效率和产物浓度，该制备工艺具有原料价格低廉、酶转化时间短、操作简便，产物浓度高，转化效率高以及生产成本低等优点。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案：一种L-肌肽合成酶的制备工艺，以β-丙氨酸、L-组氨酸盐酸盐为原料，MnCl2为催化剂，加入L-肌肽水解酶，在pH 8.0-8.5，35-40℃温度条件下通过酶促反应催化合成L-肌肽，包括以下步骤：
步骤1：以水为反应溶剂，将L-组氨酸盐酸盐溶于水内得到反应液；
步骤2：用pH值调节液调节反应液的pH值，pH值调节液选用稀碱液，将pH控制在8.0-8.5中；
步骤3：在一定温度下，对调节pH值后的反应液内加入β-丙氨酸和催化剂MnCl2，进行转化反应，转化的周期为8h，转化的过程中继续用pH值调节液控制反应液的pH值，每隔2h取样用HPLC检测一次在进行转化反应的反应液浓度；
步骤4：原料β-丙氨酸加料完成后在反应釜内继续搅拌反应，搅拌反应的反应时间为30-60min，搅拌的速度为145-155rpm；
步骤5：加入L-肌肽水解酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸盐酸盐的逆水解反应生成反应混合物；
步骤6：从反应混合物分离提取产物L-肌肽。
实验以100ml反应体系进行实验：
实验以L-肌肽水解酶的添加量（0.00、0.25、0.5、0.75、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、4.00%）和L-组氨酸盐酸盐的添加量（0.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00、12.00、16.00%）为变量做正交试验，其他底物添加量不变（即β-丙氨酸50g/dl，0.1M MnCl2 1ml/dl），反应条件为pH8-8.5，温度35-40℃，转化周期为8h，转化过程中用稀碱液维持ph8.0-8.5，每隔2h取样用HPLC检测一次产物浓度。
综合考虑生产成本及提取压力，得到最优的实验结果为：
β-丙氨酸50 g/dl，L-组氨酸盐酸盐8.00 g/dl，L-肌肽水解酶1.00 g/dl，0.1 MMnCl2 1 ml/dl，反应条件为pH 8 - 8.5，温度37℃，转化过程中用稀碱液维持ph不变。检测结果如下：
综合检测分析可知，在此酶转化工艺条件下，转化2 h，L-肌肽含量即可达到2.29g/dl，单位时间内的转化率达到了11.45 g/（h*L）；累计转化8 h后，L-肌肽含量最高可达到3.59 g/dl。
表1 实验数据
鉴于表1中的实验结果，后续可通过改进实验装置，在酶转化达到8h后，通过超滤膜截留L-肌肽水解酶回收转化液，连续补加混合底物，实现连续转化和自动化，将更有利于实现工业化生产。
使用方法
一种L-肌肽合成酶的制备工艺，包括以下步骤：
步骤1：以水为反应溶剂，将L-组氨酸盐酸盐溶于水内得到反应液；
步骤2：用pH值调节液调节反应液的pH值；
步骤3：在一定温度下，对调节pH值后的反应液内加入β-丙氨酸和催化剂MnCl2，进行转化反应；
步骤4：原料β-丙氨酸加料完成后在反应釜内继续搅拌反应；
步骤5：加入L-肌肽水解酶催化β-丙氨酸和L-组氨酸盐酸盐的逆水解反应生成反应混合物；
步骤6：从反应混合物分离提取产物L-肌肽。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
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