具体实施方式

下面对本发明的一方面的方法和转化体的详细情况进行描述。

本发明的技术范围不受下面描述的限制，只要达到其目的，本发明可以采取各种形态。

本说明书中使用的每个术语具有本领域技术人员通常使用的含义，并且不应解释为具有不合理的限制含义，除非另有说明。

(方法的概要)

本发明的一方面的方法至少包括使组氨酸和硒化合物作用于第1转化体以得到麦角硒因的步骤，第1转化体被插入从由SatA基因、CysB基因和MetR基因组成的组中选出的至少1种基因和EgtA基因，并且过量表达该插入的基因。第1转化体以如下方式进行转化：除EgtA基因外，还过量表达从由SatA基因、CysB基因和MetR基因组成的组中选出的至少1种基因、即这些基因中的任意1种或2种或3种。

本发明的另一方面的方法至少包括使组氨酸和硒化合物作用于第2转化体以得到麦角硒因的步骤，第2转化体被插入2-8个拷贝的EgtA基因，并且过量表达该插入的基因。第2转化体通过插入2、3、4、5、6、7或8个拷贝的EgtA基因进行转化。

例如，被插入2个拷贝的EgtA基因的转化体是指通过在染色体中插入2个DNA构建体进行转化的转化体，该DNA构建体以使EgtA基因在宿主生物内正常表达的方式制作。在本说明书中，以使特定基因在宿主生物内正常表达的方式制作的DNA构建体也称为该基因的“表达盒”。被插入2个拷贝的EgtA基因的转化体原则上与2个EgtA表达盒分别独立地表达EgtA基因。

本发明的另一方面的方法至少包括使组氨酸和硒化合物作用于第3转化体以得到麦角硒因的步骤，第3转化体被插入从由SatA基因、CysB基因和MetR基因组成的组中选出的至少1种基因和2-8个拷贝的EgtA基因，并且过量表达该插入的基因。第3转化体通过插入由第1转化体和第2转化体过量表达的所有基因进行转化。

在本说明书中，在仅称为转化体的情况下，“转化体”是指第1转化体、第2转化体以及第3转化体的全部。这些转化体是本发明的另一方面。

在本说明书中，硒化合物除了硒化合物本身之外，还包含硒化合物的盐、络合物、交联物及衍生物。

本发明的技术范围不受任何理论或推测的限制，但在下述方案(I)中示意性地示出了所假设的菌类的麦角硒因生物合成系统的一个形态。方案(I)示出了由组氨酸和硒代半胱氨酸经由组氨酸三甲基内盐生成麦角硒因的反应。

[化学式1]

(式中，PLP表示5'-磷酸吡哆醛。)

方案(I)中的EgtA、SatA、CysB以及MetR分别是由EgtA基因、SatA基因、CysB基因和MetR基因编码的蛋白质。

如方案(I)所示，EgtA蛋白质催化从组氨酸向组氨酸三甲基内盐转化的反应以及从组氨酸三甲基内盐和硒代半胱氨酸向海西宁硒代半胱氨酸转化的反应。SatA蛋白质催化从丝氨酸向乙酰丝氨酸转化的反应。CysB蛋白质催化从乙酰丝氨酸和硫化氢向硒代半胱氨酸转化的反应。MetR蛋白质用作转录因子，促进从硒酸向亚硒酸转化的反应以及进一步从亚硒酸向硒化氢转化的反应。此外，由EgtB基因和EgtC基因分别编码的EgtB蛋白质和EgtC蛋白质各自独立地催化从海西宁硒代半胱氨酸向麦角硒因转化的反应。

本发明的一方面的方法中使用的转化体通过过量表达作为外源基因插入的EgtA基因、SatA基因、CysB基因和MetR基因，能够由组氨酸和硒化合物最终生成麦角硒因。

第1转化体和第3转化体中的SatA基因、CysB基因和MetR基因的拷贝数分别为1个或2个以上。拷贝数的上限没有特别限制，典型地约为6个。

在转化体中，除EgtA基因、SatA基因、CysB基因以及MetR基因以外，还可以插入其他外源基因。其他外源基因只要不妨碍解决本发明的问题就没有特别限制，作为其实例，可以举出EgtB基因和EgtC基因等。认为：转化体通过过量表达作为外源基因插入的EgtB基因、EgtC基因或这两个基因，可以由海西宁硒代半胱氨酸高效地生成麦角硒因。但是，当宿主生物充分表达EgtB基因或EgtC基因时，即使插入EgtB基因或EgtC基因，麦角硒因的生产率也不会有太大变化。

在本说明书中，有时将EgtA基因、SatA基因、CysB基因、MetR基因等、插入转化体并过量表达的基因统称为插入基因。此外，有时将由插入基因编码的蛋白质统称为插入基因蛋白质。

(插入基因)

EgtA基因没有特别限制，只要相当于WO2017/026173(申请号：PCT/JP2016/068128)中记载的“编码酶(1)的基因”即可。EgtA基因可以称为编码EgtA蛋白质的基因，即编码酶的基因，该酶具有催化在S-腺苷甲硫氨酸和铁(II)的存在下由组氨酸和硒代半胱氨酸生成海西宁硒代半胱氨酸的反应的活性。

SatA基因没有特别限制，只要是一般公知的编码丝氨酸O-乙酰基反式酶(EC2.3.1.30)的基因即可。丝氨酸O-乙酰基反式酶具有催化由乙酰基-CoA和L-丝氨酸生成O-乙酰基-L-丝氨酸和CoA(辅酶A)的反应的活性。

CysB基因没有特别限制，只要是一般公知的编码半胱氨酸合酶(EC2.5.1.47)的基因即可。半胱氨酸合酶具有催化由O-乙酰基-L-丝氨酸和硫化氢生成L-半胱氨酸和乙酸的反应的活性。由此，半胱氨酸合酶催化O-乙酰基-L-丝氨酸和硫化物(S)之间的反应，并且在本发中，应用该酶，以利用CysB基因从O-乙酰基-L-丝氨酸和作为硒化物(Se)的硒化氢得到L-硒代半胱氨酸。

已报道许多微生物具有SatA基因和CysB基因。例如，在文献(Microbiology(2000)，146，2695-2703；GenBank：AAB84208.1；Curr Genet.1997Apr 31(4)：348-356)中报道了对构巢曲霉(Aspergillus nidulans)所具有的SatA基因和CysB基因。此外，在文献(Research in Microbiology 24Mar 2007，158(5)：428-436)中报道了许多丝状菌的酶具有半胱氨酸合酶活性。下述方案(II)中示出了由SatA基因和CysB基因编码的蛋白质介入的、所假设的从丝氨酸和硒酸向硒代半胱氨酸的转化。

[化学式2]

MetR基因只要相当于专利第4029927号公报中记载的“由编码具有控制硫同化基因表达的功能的蛋白质的DNA构成的基因”，则无特别限制。MetR基因作为转录因子，可以说是编码蛋白质的基因，该蛋白质控制硫同化基因的表达，该硫同化基因是从自由烯丙基硫酸酯酶基因、胆碱硫酸酯酶基因、硫酸过氧化物酶基因和硫酸还原酶基因组成组中选出的。下述方案(III)示出了假设的、利用由硫同化基因编码的蛋白质从硫酸向硫化氢的转化。

[化学式3]

由MetR基因编码的MetR因子促进从硫酸向亚硫酸转化的反应，以及从亚硫酸向硫化氢转化的反应。在本发明中，利用这一点以从硒酸得到亚硒酸，进而利用MetR基因得到硒化氢。MetR因子控制编码与硫同化有关、特别是与无机硫同化有关的酶的基因的表达。例如，Amich等人的文献(PLOS Pathogens，August 2013Vol.9，Issue 8，e1003573)的图9中记载了硫代谢中的MetR控制的概况。另外，通过MetR因子的作用，可以防止亚硒酸向硒酸的氧化转化。

下述方案(IV)中示出了由SatA基因、CysB基因和MetR基因编码的蛋白质参与的、假设的硫同化生物合成途径。方案(IV)引自上述Amich等人的文献的图9。

[化学式4]

EgtB基因和EgtC基因没有特别限制，只要相当于WO2017/026173中记载的“编码酶(2)的基因”即可。EgtB基因和EgtC基因可以称为编码EgtB蛋白质和EgtC蛋白质的基因，即编码酶的基因，该酶具有以5'-磷酸吡哆醛为辅酶催化由海西宁硒代半胱氨酸生成麦角硒因的反应的活性。

通过在转化体内过量表达插入基因来生产插入基因蛋白质。本说明书中的“基因的表达”是指通过转录或翻译等，使基因编码的酶以具有原始活性和/或功能的形式生产。此外，本说明书中的“基因的过量表达”是指通过插入基因，使得由该基因编码的蛋白质超过宿主生物最初的生产量而生产。

在导入到宿主生物时，插入基因可以是在转录插入基因后，经剪接而能够生成插入基因蛋白质的基因，或者可以是在转录插入基因后，不经剪接而能够生成插入基因蛋白质的基因。

插入基因可以不与来源生物固有的基因(即野生型基因)完全相同。插入基因只要是至少编码具有上述规定活性和/或功能的蛋白质的基因，也可以是具有在严格条件下与互补于野生型基因的碱基序列的碱基序列杂交的碱基序列的DNA。

本说明书中的“在严格条件下杂交的碱基序列”是指将具有野生型基因的碱基序列的DNA用作探针，使用杂交法得到的DNA的碱基序列。作为杂交法，可以举出菌落杂交法、噬菌斑杂交法、印迹杂交法等。

本说明书中的“严格条件”是指特异性杂交信号与非特异性杂交信号清楚地区分的条件。严格条件根据所使用的杂交系统以及探针的类型、序列和长度的不同而不同。该条件可以通过改变杂交温度、洗涤温度和盐浓度来确定。例如，当强烈地检测到非特异性杂交信号时，可以通过提高杂交和洗涤的温度，并且根据需要降低洗涤的盐浓度来提高特异性。此外，如果还未检测到特异性杂交信号，则可以通过降低杂交和洗涤温度，并且根据需要增加洗涤的盐浓度来稳定杂交。

严格条件的具体实例如下：使用DNA探针作为探针；使用5×SSC、1.0％(w/v)核酸杂交封闭剂(Beringa Manheim公司)、0.1％(w/v)N－月桂酰肌氨酸、0.02％(w/v)SDS，进行杂交过夜(约8-16小时)；使用0.1～0.5×SSC、0.1％(w/v)SDS，优选使用0.1×SSC、0.1％(w/v)SDS，执行2次洗涤，每次15分钟。杂交和洗涤温度为65℃以上，优选68℃以上。

作为具有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，例如可以列举出：具有来自菌落或菌斑的野生型基因的碱基序列的DNA、或者通过使用固定了该DNA片段的过滤器，在上述严格条件下杂交而获得的DNA，以及在0.5～2.0M的NaC1存在下，在40-75℃下实施杂交后，优选地在0.7～1.0M的NaC1存在下，在65℃下进行杂交后，通过使用0.1～1×SSC溶液(1×SSC溶液含有150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠)，在65℃条件下洗涤滤膜可鉴定的DNA。探针的制作或杂交是可以根据Molecular Cloning：A laboratory Manual，2nd-Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY.，1989，Current Protocols in MolecularBiology，Supplement 1-38，John Wiley&Sons，1987-1997(下面，有时将这些文献称为“参考技术文献”。)等的记载进行实施。另外，本领域技术人员可以适当设定用于获得具有在严格条件下与互补于野生型基因的碱基序列的碱基序列杂交的碱基序列的DNA的条件，该条件除了上述缓冲液的盐浓度和温度等条件外，还包括探针浓度、探针长度、反应时间等其他各种条件。

作为含有在严格条件下杂交的碱基序列的DNA，可以举出：与具有用作探针的野生型基因的碱基序列的DNA的碱基序列具有一定以上的序列同一性的DNA。作为其更详细的实例，可以举出：与野生型基因的碱基序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上，更优选99.5％以上的序列同一性的DNA。上限没有特别限制，典型地为100％。

作为在严格条件下与互补于野生型基因的碱基序列的碱基序列杂交的碱基序列，可以举出：例如在野生型基因的碱基序列中缺失、置换或添加了碱基的碱基序列。作为更详细的实例，可以举出：在野生型基因的碱基序列中，每100个碱基组成的一个单位内，为1～数个，优选为1～50个，更优选为1～30个，进一步优选为1～20个，进一步更优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个具有碱基缺失、置换、添加等的碱基序列。“碱基缺失”是指序列中的碱基存在缺少或消失。“碱基置换”是指序列中的碱基被其他碱基置换。“碱基添加”是指以插入的方式添加新的碱基。

由在严格条件下与互补于野生型基因的碱基序列的碱基序列杂交的碱基序列编码的蛋白质可能是由野生型基因的碱基序列编码的蛋白质所具有的氨基酸序列中具有一个或数个氨基酸的缺失、置换、添加等的氨基酸序列的蛋白质，具有与由野生型基因的碱基序列编码的蛋白质相同的活性和/或功能。

插入基因蛋白质的氨基酸序列只要具有与由插入基因编码的蛋白质相同的活性和/或功能，也可以由野生型酶所具有的氨基酸序列中具有1～数个氨基酸的缺失、置换、添加等的氨基酸序列构成。氨基酸序列的“1～数个氨基酸的缺失、置换、添加”中的“1～数个”的范围没有特别限制，例如，氨基酸序列中，每100个氨基酸组成的一个单位内，为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个，优选为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个左右，更优选1个、2个、3个、4个或5个左右。“氨基酸的缺失”是指序列中的氨基酸残基的缺少或消失。“氨基酸的置换”是指序列中的氨基酸残基被其他氨基酸残基置换。“氨基酸的添加”是指以在序列中插入新的氨基酸残基的方式添加。

作为“1～数个氨基酸的缺失、置换、添加”的具体实例，可以举出：1～数个氨基酸被其他化学上类似的氨基酸置换。例如，在将某疏水性氨基酸置换为其他疏水性氨基酸的情况下，作为其实例，可以举出：将某极性氨基酸置换成与其具有相同电荷的其他极性氨基酸的情况。在该技术领域中，这种在化学上类似的氨基酸对于每种氨基酸是已知的。具体而言，作为非极性(疏水)氨基酸，可以举出：丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸等。作为极性(中性)氨基酸，可以举出：甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨酸等。作为带正电的碱性氨基酸，可以举出：精氨酸、组氨酸、赖氨酸等。作为带负电荷的酸性氨基酸，可以举出：天冬氨酸、谷氨酸等。

作为野生型酶具有的氨基酸序列中具有1～数个氨基酸的缺失、置换、附加等的氨基酸序列的实例，可以举出：与野生型酶具有的氨基酸序列具有一定以上的序列同一性的氨基酸序列。作为更详细的实例，可以举出：与野生型酶具有的氨基酸序列具有80％以上、优选85％以上、更优选90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或者99％以上，更优选99.5％以上的序列同一性的氨基酸序列。

(计算序列同一性的方法)

对计算碱基序列或氨基酸序列的序列同一性的方法不作特别限制。

例如，可以使用通常公知的方法。详细而言，通过使用如下程序来求取序列同一性，该程序用于将野生型基因或野生型基因编码的蛋白质的氨基酸序列与作为对象的碱基序列或氨基酸序列进行比对并计算出两个序列之间的匹配率。

作为用于确定2个氨基酸序列或碱基序列的序列同一性的程序，已知有例如Karlin和Altschul的算法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：2264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877，1993)。Altschul开发了使用该算法的BLAST程序(J.Mol.Biol.215：403-410，1990)。进而，还已知Gapped BLAST，其是一种比BLAST更灵敏地确定序列同一性的程序(Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997)。

因此，本领域技术人员可以通过使用例如上述程序，在数据库中搜索相对于给定的序列表现出高序列同一性的序列。这种数据库例如可以在美国National Center forBiotechnology Information的互联网上的网站(html：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上使用。

上述每种方法通常可用于在数据库中搜索表现序列同一性的序列，但作为确定个别序列的序列同一性的方法，也可以使用Gennetyx网络版本version12.0.1(Genetyx公司)的同源性分析。该方法基于Lipman-Pearson法(Science227：1435-1441，1985)。在分析碱基序列的序列同一性时，如果可能，则使用编码蛋白质的区域(CDS或ORF)。

(插入基因的来源)

插入基因例如来源于具有麦角硒因或麦角硫因生产能力的物种或观察到插入基因表达的物种等。作为插入基因的来源生物，可以举出例如微生物。在微生物中，由于已知具有麦角硫因生成能力的菌种很多，因此优选丝状菌。作为丝状菌的具体实例，可以举出：曲霉(Aspergillus)属丝状菌，作为更具体实例，可以举出酱油曲霉(Aspergillus sojae)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、黑曲霉(Aspergillus niger)、溜曲霉(Aspergillustamarii)、琉球曲霉(Aspergillus luchuensis)、宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)、斋藤曲霉(Aspergillus saitoi)、构巢曲霉(Aspergillusnidulans)等。

在上面列举出的曲霉属丝状菌的具体实例中，酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、琉球曲霉、宇佐美曲霉、棘孢曲霉和斋藤曲霉在调味酱、酱油、清酒和烧酒等酿造食品的制造、柠檬酸制造、淀粉酶等酶制剂制造中具有丰富的使用记录，并且凭借对其高度酶生产力和长年使用带来安全性的高度信赖，是能够应用于工业的微生物。

如上所述，插入基因的来源生物没有特别限制，在转化体中表达的插入基因蛋白质根据宿主生物的生长发育条件而有可能不失活，或者表现各自的活性或功能。因此，插入基因的来源生物优选为与通过插入插入基因而转化的宿主生物有着近似生长发育条件的微生物。

(利用遗传工程技术克隆插入基因)

插入基因可以插入在合适的公知的各种载体中。此外，可以将该载体导入到合适的公知的宿主生物中以制作转化体，其中该转化体已导入含有插入基因的重组载体(重组体DNA)。本领域技术人员可以适当选择插入基因的取得方法、插入基因序列信息和插入基因蛋白质的氨基酸序列信息的取得方法、各种载体的制作方法、以及转化体的制作方法等。在本说明书中，转化及转化体分别包含转化导入及转化导入体。稍后将描述克隆插入基因的非限制性实例。

为了克隆插入基因，可以适当地使用常用的基因克隆方法。例如，可以通过常规方法，例如参考技术文献中描述的方法，从具有插入基因蛋白质生产能力的微生物或各种细胞中提取染色体DNA或mRNA。可以以提取的mRNA为模板合成cDNA。可以使用由此获得的染色体DNA或cDNA来制作染色体DNA或cDNA文库。

例如，插入基因可以通过克隆来获得，在该克隆中以来自具有插入基因的微生物的染色体DNA或cDNA为模板。插入基因的来源生物如上所述，作为其具体实例包括但不限于酱油曲霉NBRC4239菌株、米曲霉RIB40菌株等。例如，染色体DNA可以按如下方式获得：培养酱油曲霉NBRC4239菌株；从得到的菌体中除去水分；将菌体在液氮中冷却，并且用研钵等进行物理磨碎，得到细粉末状的菌体片；通过常规方法从该菌体片中提取染色体DNA组分。在染色体DNA提取操作中，可以使用DNeasy Plant Mini Kit(凯杰公司)等市售的染色体DNA提取试剂盒。

接着，以所述染色体DNA为模板，使用与5'末端序列和3'末端序列互补的合成引物，进行聚合酶链反应(以下记作“PCR”)，从而扩增DNA。引物没有特别限制，只要其可以扩增包含插入基因的DNA片段即可。作为其实例，可以举出参考酱油曲霉的基因组序列而设计的序列号19～20、45～46、54～55和58～59的引物等。另外，使用这些引物时，目的基因的全长被扩增，因此可以省略RACE。作为其他方法，可以通过5'RACE法和3'RACE法等适当的PCR，扩增含有目的基因片段的DNA，并将它们连接以得到全长的含有目的基因的DNA。

此外，取得插入基因的方法没有特别限制。插入基因的取得可以不依赖于基因工程方法，例如可以使用化学合成法构建插入基因。

通过PCR扩增的扩增产物和化学合成的基因中的碱基序列的确认例如可以按照如下方式进行。首先，将想要确认序列的DNA按照常规方法插入到适当的载体中以制作重组体DNA。在载体的克隆中，可以使用TA Cloning Kit(Invitrogen公司)等市售试剂盒、pUC119(TakaraBio公司)、pUC18(TakaraBio公司)、pBR322(TakaraBio公司)、pBluescript SK+(Stratagene公司)和pYES2/CT(Invitrogen公司)等市售质粒载体DNA、λEMBL3(Stratagene公司)等市售的噬菌体载体DNA。使用该重组体DNA转化宿主生物，例如大肠杆菌(Escherichia coli)，优选为大肠杆菌JM109菌株(TakaraBio公司)或者大肠杆菌DH5α菌株(TakaraBio公司)。使用QIAGEN Plasmid Mini Kit(Qiagen公司)等纯化得到的转化体包含的重组体DNA。

通过双脱氧测序技术(Methods in Enzymology，101，20-78，1983)等确定插入在该重组体DNA中的每个基因的碱基序列。在确定碱基序列时使用的序列分析装置没有特别限制。作为其实例，可列举出：包括Li-COR MODEL 4200L测序仪(阿洛卡公司)、370DNA测序系统(珀金埃尔默公司)、CEQ2000XL DNA分析系统(贝克曼公司)等。基于所确定的碱基序列，可以得知所翻译的蛋白质、即插入基因蛋白质的氨基酸序列。

(含有插入基因的重组载体的构建)

可以通过将含有任何插入基因的PCR扩增产物和各种载体以可表达插入基因的形式结合来构建含有插入基因的重组载体(重组体DNA)。例如，可以通过与质粒连接来构建含有插入基因的重组载体，所述质粒通过采用合适的限制性酶切出含有任意插入基因的DNA片段，再采用合适的限制性酶切断该DNA片段而形成。或者，可以通过使用In-Fusion HDCloning Kit(Clontech公司)等市售的重组载体制作试剂盒连接含有在两末端附加了与质粒同源性的序列的该基因的DNA片段和通过反向PCR扩增的来自质粒的DNA片段，得到含有插入基因的重组载体。

(转化体的制作方法)

转化体的制作方法没有特别限制。例如，可以按照常规方法，通过以插入基因表达的方式在宿主生物中插入基因，制作转化体。具体而言，制作DNA构建体，所述DNA构建体是在表达诱导型启动子和终止子之间插入任意一个插入基因而形成的，然后使用含有插入基因的DNA构建体转化宿主生物，从而得到过量表达插入基因的转化体。在本说明书中，有时将为了转化宿主生物而制作的、由表达诱导型启动子－插入基因－终止子构成的DNA片段以及含有该DNA片段的重组载体统称为“DNA构建体”或“插入基因表达盒”。

将插入基因以插入基因表达的方式插入到宿主生物的方法没有特别限制。作为其实例，可以列举出：通过利用同源重组或非同源重组直接插入到宿主生物的染色体上的方法、通过连接在质粒载体上而导入到宿主生物内的方法等。

在利用同源重组的方法中，通过在与染色体上的重组部位的上游区域及下游区域同源的序列之间，连接DNA构建体，可以在宿主生物的基因组中插入目的基因。通过在自身的高表达启动子控制下在宿主生物内过量表达插入基因，可以得到自我克隆的转化体。高表达启动子没有特别限制。作为其实例，可以列举出：作为翻译伸长因子的TEF1基因(tef1)的启动子区域、α-淀粉酶基因(amy)的启动子区域、碱性蛋白酶基因(alp)启动子区域等。

在利用载体的方法中，可以通过常规方法将DNA构建体融合到用于转化宿主生物的质粒载体中，并且可以通过常规方法使用该质粒载体转化相应的宿主生物。

这种合适的载体-宿主系统没有特别限制，只要其可以在宿主生物中生产插入基因蛋白质即可。作为其实例，可以列举出：pUC19及丝状菌的系统、pSTA14(Mol.Gen.Genet.218，99-104，1989)及丝状菌的系统等。

优选将DNA构建体导入到宿主生物的染色体中进行使用。作为其他方法，也可以通过将DNA构建体融合到自主复制型载体(Ozeki et al.Biosci.Biotechnol.Biochem.59，1133(1995))而不导入染色体的形式使用DNA构建体。

DNA构建体中可以包含标记基因以允许选择转化的细胞。标记基因没有特别限制。作为其实例，可以列举出：如pyrG、niaD、adeA等与宿主生物营养需求互补的基因，如乙胺嘧啶、潮霉素B、寡霉素等对药剂具有耐药性的基因等。此外，DNA构建体优选含有能够在宿主生物中过量表达插入基因的启动子、终止子、或其他控制序列(例如增强剂、聚腺苷酸化序列等等)。启动子没有特别限制。作为其实例，可以列举出：合适的表达诱导启动子、组成型启动子等，作为更具体的实例，可以列举出：tef1启动子、alp启动子、amy启动子等。终止子也没有特别限制，作为其实例，可以列举出：alp终止子、amy终止子、tef1终止子等。

在DNA构建体中，当包含插入基因的DNA片段包含具有表达控制功能的序列时，未必需要对插入基因表达的控制序列。此外，当通过共转化方法进行转化时，DNA构建体可以不具有标记基因。

可以将带有用于纯化插入基因蛋白质的标签添加到DNA构建体中。例如，通过在插入基因的上游或下游连接合适的连接序列，并将编码组氨酸的碱基序列连接6密码子以上，从而可以使用镍柱进行纯化。

DNA构建体的一实例是使tef1基因启动子、插入基因、alp基因终止子和pyrG标记基因与pUC19的多克隆位点上的In-Fusion Cloning Site连接而成的DNA构建体。

作为用于转化成丝状菌的方法，可以适当选择本领域技术人员已知的方法，例如，可以使用原生质体PEG方法(例如，参照Mol.Gen.Genet.218，99-104，1989，申请公开号为2007-222055的日本专利申请等)，在该方法中，在制备宿主生物的原生质体后，用聚乙二醇和氯化钙处理原生质体。作为用于再生转化体的培养基，根据使用的宿主生物和转化标记基因，使用适当的培养基。例如，在使用酱油曲霉作为宿主生物，并使用pyrG基因作为转化标记基因的情况下，可以在含有0.5％琼脂和1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco公司)中再生转化体。

此外，例如，为了获得转化体，也可以通过同源重组，将宿主生物本来在染色体上具有的插入基因的启动子置换为tef1等高表达启动子。此时，除了高表达启动子之外，还优选插入pyrG等转化标记基因。例如，为了该目的，可以使用由插入基因的上游区域－转化标记基因－高表达启动子－插入基因的全部或部分构成的转化盒(参照日本特开2011-239681中记载的实施例1和图1)。在这种情况下，将插入基因的上游区域和全部或部分插入基因用于同源重组。所使用的全部或部分插入基因也可以包含从开始密码子到插入基因内的中途的区域。适用于同源重组的区域的长度为0.5kb。

可以通过以下步骤确认已制作了转化体：在确认插入基因蛋白质的活性或功能的条件下培养转化体，然后，确认在培养后得到的培养物中检测到麦角硒因；或者，确认检测出的麦角硒因的量多于在相同条件下培养的宿主生物的培养物中的麦角硒因的量。

或者，可以通过以下步骤确认已制作了转化体：从转化体中提取染色体DNA，将其作为模板进行PCR，确认在发生转化的情况下产生可扩增的PCR产物。

例如，通过针对所使用的启动子的碱基序列的正向引物和针对转化标记基因的碱基序列的反向引物的组合来进行PCR，确认生成了预期长度的产物。

当通过同源重组进行转化时，优选通过使用位于所使用的上游侧的同源区域的上游的正向引物和位于所使用的下游侧的同源区域的下游的反向引物的组合进行PCR，确认在发生同源重组时生成了预期长度的产物。

通过对插入了第1插入基因的转化体再插入第2插入基因，从而可以制作插入了第1插入基因和第2插入基因的转化体。重复该步骤，可以制作被插入多个插入基因的转化体。

在制作插入有多个插入基因的转化体时，在与第1插入基因一起插入的标记基因和与第2插入基因一起插入的标记基因相同的情况下，优选在插入第1插入基因后，除去与第1插入基因一起插入的标记基因。

例如，在依次连接并包含第1插入基因、用于环出的区域以及标记基因的插入基因表达盒中，当具有与用于环出的区域相同序列的区域位于宿主生物的染色体上的可通过同源重组导入的部位的下游时，在通过同源重组将插入基因表达盒插入到宿主生物的染色体上之后，在用于环出的区域和下游的相同序列区域之间发生同源重组，从而通过环出除去标记基因。由此，在插入第1插入基因后，可以得到除去了与第1插入基因一起插入的标记基因的转化体。

(宿主生物)

宿主生物没有特别限制，只要是能够通过利用含有插入基因的DNA构建体的转化来生产插入基因蛋白质的微生物即可。作为其实例，从硒化合物的有毒性的观点出发，可以举出能够代谢硒的微生物。宿主生物优选为表达硒酸还原酶(EC1.97.1.9)、硒代半胱氨酸裂解酶(EC4.4.1.16)或丝氨酸脱水酶(EC4.3.1.17)或这些酶中的两种以上的微生物，更优选为曲霉(Aspergillus)属微生物、埃希氏菌(Escherichia)属微生物、木霉(Trichoderma)属微生物、镰孢菌(Fusarium)属微生物、青霉(Penicillium)属微生物、根霉(Rhizopus)属微生物、链孢霉(Neurospora)属微生物等丝状菌、光合微生物和益生菌微生物等。

例如，已知不动杆菌属微生物(Acinetobacter)、气单胞菌属微生物(Aeromonas)、节杆菌属微生物(Arthrobacter)、芽孢杆菌属微生物(Bacillus)、念珠菌属微生物(Candida)、头孢霉属微生物(Cephalosporium)、柠檬酸杆菌属微生物(Citrobacter)、棒状杆菌属微生物(Corynebacterium)、黄杆菌属微生物(Flavobacterium)、镰刀菌属微生物(Fusarium)、微球菌属微生物(Micrococcus)、链孢霉属微生物(Neurospora)、青霉菌属微生物(Penicillium)、假单胞菌属微生物(Pseudomonas)、沙门氏菌属微生物(Salmonella)、帚霉属微生物(Scopulariopsis)、月形单胞菌属微生物(Selenomonas)等微生物具有氧化或还原硒化合物的能力(参照D.T.MAIERS et al.，APPLIED AND ENVIRONMENTALMICROBIOLOGY，Oct.1988，p.2591-2593)。尤其，从硒酸索氏菌(Thauera selenatis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)和小芽孢杆菌(Bacillusselenatarsenatis)发现硒酸还原酶或编码该酶的基因(阪口利文，“硒氧阴离子还原酶及其基因”，生物培养基，Biomedea，2012年，第3卷，第133页)。此外，还已知粘乳产碱菌(Alcaligenes viscolactis)、弗罗因德氏埃希氏杆菌(Escherichia freundii)、假白喉棒状杆菌(Corynebacterium pseudodiphtheriticum)、解碱假单胞菌(Pseudomonasalkanolytica)、噬亮氨酸短杆菌(Brevibacterium leucinophagum)、大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwinia carotovora)、粘质沙雷菌(Serratiamarcescens)、白克氏产硷杆菌(Alcaligenes bookeri)、无花果曲霉(Aspergillusficuum)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、伞枝犁头霉(Absidia corymbifera)、红面包霉菌(Neurospora crassa)、番薯青霉病菌(Penicillium expansum)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、白色念珠菌(Candida albicans)、贝氏汉逊酵母(Hansenula beckii)、西方许旺酵母菌(Schwanniomyces occidentalis)具有硒代半胱氨酸裂解酶活性，或者可能具有该活性(PATRICK CHOCAT et al.，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Oct.1983，p.455-457)。因此，这些微生物可用作宿主生物。或者，可以将强化或异源表达硒代谢基因的微生物用作宿主生物。进而，存在可以将插入基因的来源生物用作宿主生物的可能性。

其中，更优选确认有麦角硫因生成的丝状菌，以及在基因组DNA上具有插入基因的丝状菌。作为丝状菌的具体实例，可以列举出：Donald等人的文献(Donald B.Melville etal，J.Biol.Chem.1956，223：9-17)或Dorothy等人的文献(Dorothy S.Genghof，J.Bacteriology，Aug.1970，p.475-478)中所述的丝状菌，例如属于曲霉属、链孢霉属、青霉菌属、镰刀菌(Fusarium)属、木霉(Trichoderma)属、毛霉菌(Mucor)属等的丝状菌。作为在基因组DNA上插入了基因的丝状菌，例如可以列举出属于：新萨托菌(Neosartorya)属、丝衣霉菌(Byssochlamys)属、黄丝曲霉(Talaromyces)属、阿耶罗菌(Ajellomyces)属、副球孢子菌(Paracoccidioides)属、非致病真菌(Uncinocarpus)属、球孢子菌(Coccidioides)属、节皮菌(Arthroderma)属、毛癣菌(Trichophyton)属、外瓶霉(Exophiala)属、卡普龙(Capronia)属、枝孢瓶霉属(Cladophialophora)属、壳球孢(Macrophomina)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、平脐蠕孢(Bipolaris)属、松座囊菌(Dothistroma)属、核腔菌(Pyrenophora)属、新壳梭孢菌(Neofusicoccum)属、毛球腔菌(Setosphaeria)属、酒气菌(Baudoinia)属、禾顶囊壳(Gaeumannomyces)属、盘二孢(Marssonina)属、亚球壳(Sphaerulina)属、核盘菌(Sclerotinia)属、稻温病菌(Magnaporthe)属、轮霉菌(Verticillium)属、假尾孢菌(Pseudocercospora)属、炭疽菌(Colletotrichum)属、蛇口壳(Ophiostoma)属、绿僵菌(Metarhizium)属、孢子丝菌(Sporothrix)属、粪壳菌(Sordaria)属等的丝状菌等。

即使在丝状菌中也考虑安全性或培养的容易性，优选上述作为插入基因的来源生物而列举的酱油曲霉、米曲霉、黑曲霉、溜曲霉、琉球曲霉、宇佐美曲霉、棘孢曲霉、斋藤曲霉、构巢曲霉等曲霉属微生物。

宿主生物可以是野生菌株，或者也可以是预先转化野生菌株的转化体。被用作宿主生物的、预先转化野生菌株的转化体没有特别限制。

例如，以曲霉属微生物为首的丝状菌具有同源重组频率低的倾向。因此，在通过同源重组制作转化体时，优选使用与非同源重组机制相关的Ku70、Ku80等Ku基因受到抑制的转化丝状菌。

可以通过本领域技术人员公知的任意方法来抑制这种Ku基因。例如，通过使用Ku基因破坏载体来破坏Ku基因，或者采用利用Ku基因的反义表达载体的反义RNA法，使Ku基因失活等，可以抑制Ku基因。这样获得的转化曲霉属微生物的同源重组频率与原始曲霉属微生物在进行与抑制Ku基因有关的基因操作之前的同源重组频率相比，显著上升，具体而言，至少上升2倍，优选至少上升5倍，优选至少上升10倍，优选至少上升约50倍。

此外，作为宿主生物，优选使用标记基因例如pyrG等被抑制的转化体。可以根据DNA构建体中包含的标记基因适当选择需抑制的标记基因。

(插入基因的具体实例)

作为来自酱油曲霉NBRC4239菌株的插入基因的实例，例如可以举出后述的实施例中记载的AsEgtA基因、AsSatA基因、AsCysB基因和AsMetR基因等。AsEgtA基因、AsSatA基因、AsCysB基因和AsMetR基因的碱基序列分别是序列表中的序列号1～4的序列。另外，由AsEgtA基因、AsSatA基因、AsCysB基因和AsMetR基因编码的AsEgtA蛋白质、AsSatA蛋白质、AsCysB蛋白质和AsMetR蛋白质的氨基酸序列分别是序列表中的序列号5～8的序列。

从酱油曲霉以外的微生物获得插入基因的方法没有特别限制。例如，通过基于AsEgtA基因、AsSatA基因、AsCysB基因和AsMetR基因的碱基序列(序列号1～4)、以及AsEgtA蛋白质、AsSatA蛋白质、AsCysB蛋白质和AsMetR蛋白质的氨基酸序列(序列号：5～8)，对酱油曲霉以外的微生物的基因组DNA进行BLAST同源性检索，以确定具有与AsEgtA基因、AsSatA基因、AsCysB基因和AsMetR基因序列同一性较高的碱基序列的基因，从而可以从酱油曲霉以外的微生物得到插入基因。此外，通过基于酱油曲霉以外的微生物的总蛋白质确定具有与AsEgtA蛋白质、AsSatA蛋白质、AsCysB蛋白质和AsMetR蛋白质序列同一性较高的氨基酸序列的蛋白质，并确定编码该蛋白质的基因，从而可以从酱油曲霉以外的微生物获得插入基因。可以通过以下步骤确认所获得的基因相当于插入基因：通过所获得的基因将基因的来源生物转化为宿主生物，并确认在所获得的转化体中生成了麦角硒因，或者与宿主生物相比增加了麦角硒因的生产量。

例如，作为来源于米曲霉RIB40菌株的EgtA基因，可以列举出：WO2017/026173号中序列表中的序列号23的AoEgtA基因等。此外，AoEgtA蛋白质的氨基酸序列在WO2017/026173号中记载为序列表的序列号24。

由于酱油曲霉、米曲霉和黑曲霉的生长发育条件近似，所以通过将它们中的1种微生物具有的基因插入到它们中的1种微生物中，有可能能够相互转化这些微生物。例如，可以将从酱油曲霉中获得的插入基因作为宿主生物导入到米曲霉或黑曲霉中进行转化。鉴于插入基因蛋白质能够可靠地具有所期望的活性或功能，优选插入基因的来源生物与宿主生物是相同的。例如，优选将来自酱油曲霉的插入基因转化为酱油曲霉。

插入基因可以是基于来自酱油曲霉等的插入基因蛋白质的氨基酸序列，为了在宿主生物中表达而对密码子、二级结构、GC含量等进行优化的基因。作为这种基因的具体实例，可以举出：在WO2017/026173号中分别记载为序列表的序列号27和28的、在大肠杆菌中表达而合成EcEgtA和EcEgtC等。

(转化体的一个实施方式)

转化体的一个实施方式是通过将2-4个拷贝的AsEgtA基因插入到酱油曲霉中，以过量表达AsEgtA蛋白质而转化的转化酱油曲霉。转化体的另一个实施方式是通过将1-4个拷贝的AsEgtA基因、1-2个拷贝的AsSatA基因和1-2个拷贝的AsCysB基因插入到酱油曲霉中，过量表达AsEgtA蛋白质、AsSatA蛋白质和AsCysB蛋白质而转化的转化酱油曲霉。转化体的另一个实施方式是通过将1-4个拷贝的AsEgtA基因和1-2个拷贝的AsMetR基因插入到酱油曲霉中，以过量表达AsEgtA蛋白质和AsMetR蛋白质而转化的转化酱油曲霉。转化体的另一个实施方式是通过将1-4个拷贝的AsEgtA基因、1-2个拷贝的AsSatA基因、1-2个拷贝的AsCysB基因和1-2个拷贝的AsMetR基因插入到酱油曲霉，以过量表达AsEgtA蛋白质、AsSatA蛋白质、AsCysB蛋白质和AsMetR蛋白质而转化的转化酱油曲霉。转化体的另一个实施方式是通过将2-4个拷贝的AoEgtA基因插入到米曲霉中，以过量表达AoEgtA蛋白质而转化的转化米曲霉。

上述转化酱油曲霉和转化米曲霉通过过量表达插入基因蛋白质，能够以可检测的水平生成在宿主生物中不生成或者即使生成也是微量的麦角硒因。进而，如稍后在实施例中所描述的，转化酱油曲霉不仅可以由硒代半胱氨酸或胱氨酸这样的有机硒化合物、亚硒酸等生成麦角硒因，而且还可以由硒酸等无机硒化合物生成麦角硒因。因此，转化体优选为增强插入基因的表达以使麦角硒因的量相比宿主生物增加了的转化体。

此外，如下文的实施例所述，以过量表达插入基因而转化的转化酱油曲霉能够生成麦角硒因。更具体而言，通过使用适合作为宿主生物的酱油曲霉生长发育的DPY培养基将该转化酱油曲霉在30℃下培养约1～3日，促进细胞增殖，然后在该培养系统中加入硒酸钠，再在37℃下培养约3～5日，从而可以生成麦角硒因。所生成的麦角硒因分泌到菌体外，或者通过菌体溶解等蓄积在培养液中。

转化体的麦角硒因的生产能力没有特别限制。例如，使用DPY培养基将转化体在30℃下培养2日后，向该培养体系中加入硒酸钠，再在37℃下培养4日，此时麦角硒因的生产量例如为5mg/l以上，优选为10mg/l以上，更优选为15mg/l以上，进一步优选为17mg/l以上，更进一步优选为20mg/l以上。以这种方式培养时的麦角硒因的生产量的上限没有特别限制，典型为约100mg/l。

此外，如下文的实施例所述的，以过量表达插入基因而转化的转化酱油曲霉存在麦角硒因的量与所生成的麦角硒因和麦角硫因的总量的比率增大的倾向。关于转化体的麦角硒因的生成能力，例如，使用DPY培养基将转化体在30℃下培养2日后，向该培养体系中加入硒酸钠，再在37℃下培养4日，此时生成的麦角硒因的量相对于麦角硒因和麦角硫因的总量的比例(比率)例如为5％以上，更优选为10％以上，进一步优选为20％以上，更进一步优选为40％以上。以这种方式培养时的上述比率的上限没有特别限制，典型为100％。

转化体有时在生产由插入基因生产的插入基因蛋白质的同时，还通过宿主生物原本保有的基因生产结构特性与插入基因蛋白质的结构特性相同或不同的野生型插入基因蛋白质。结果，例如，即使不是导入了插入基因的转化体，转化体也可以生产麦角硒因。

(方法)

本发明的一方面提供一种麦角硒因制造方法，其至少包括使组氨酸和硒化合物作用于转化体以得到麦角硒因的步骤，所述转化体被插入插入基因，并且过量表达插入基因。

使组氨酸和硒化合物作用于转化体的方法没有特别限制，只要是能使组氨酸和硒化合物与转化体接触，以通过插入基因蛋白质的活性或功能生产麦角硒因即可。例如，通过使用含有组氨酸和硒化合物且适合转化体生长发育的培养基，在适合转化体生长发育的培养条件下培养转化体，可以使组氨酸和硒化合物作用于转化体。通过使组氨酸和硒化合物作用在转化体上来制造麦角硒因。培养方法没有特别限制，作为其实例，可以举出：在曝气或非曝气条件下进行的固体培养方法和液体培养方法。硒化合物的添加量没有特别限制，只要不抑制转化体生长发育即可。例如，培养开始时的硒化合物的添加量是相对于菌体浓度为足够小的量，优选为0mM。在想要得到大量的麦角硒因时，优选在培养开始后将硒化合物添加到培养系统中，或者在培养开始后随着菌体浓度的升高而增加培养系统的硒化合物量。例如，优选在培养开始约1～3日后向培养液中额外地添加0.01～10mM、优选为0.1～5mM的硒化合物。

培养基如果是培养宿主生物的常规培养基、即含有适当比例的碳源、氮源、无机物、其他营养素的培养基，则可以使用合成培养基和天然培养基中的任一种。在宿主生物为曲霉属微生物的情况下，可以使用如下文实施例中描述的DPY培养基等，但使用的培养基并不特别限定于此。培养基优选包含激活EgtA蛋白质所需的铁(II)。铁(II)可以作为化合物添加到培养基中，也可以作为含矿物质的物质进行添加。

硒化合物只要含有硒作为构成元素，就不作特别限制，例如是有机硒化合物、无机硒化合物及其盐。其中，作为有机硒化合物及其盐，优选为硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、Se-(甲基)硒代-L-半胱氨酸、硒肽、硒蛋白质及其盐、硒酵母等，无机硒化合物及其盐优选为硒酸、亚硒酸、氯化硒、硒、硒化物、硫化硒、二甲基硒、硒磷酸、二氧化硒及其盐。此外，硒化合物可以是含有选自有机硒化合物、无机硒化合物及其盐中的一种或多种的有机物。作为该有机物，例如可以举出：鲣鱼(加工品和干鲣鱼)、芥末(粉、颗粒芥末和膏状芥末)、猪肉(肾、肝和生肉)、牛肉(肾、生肉)、鮟鱇鱼(肝、生肉)、鳕鱼(鳕鱼子，生肉)、蓝鳍金枪鱼(红肉、生肉)、比目鱼(生肉)、鲣鱼(秋季捕捞、生肉)、帝王蟹(生肉)、葵花籽(油炸、调味)、竹荚鱼(烤)、方头鱼(生肉)、粒状调味料、黄鳍金枪鱼(生肉)、长鳍金枪鱼(生肉)、牡蛎(水煮)等已知含丰富硒的食品等，但不限于此。硒化合物可以单独使用这些材料中的一种，或组合使用两种以上。

被插入插入基因，并且过量表达插入基因的转化体适用于由硒酸、硒酸钠、硒酸钾等硒酸盐生成麦角硒因。此外，硒酸和硒酸盐比硒代半胱氨酸和硒代胱氨酸等有机硒化合物更经济。并且，和亚硒酸相比，硒酸和硒酸盐对细胞的敏感性低，并且对麦角硒因的生产可能具有较小的不利影响。因此，作为要使用的硒化合物，优选硒酸和硒酸盐。

转化体的培养条件可以采用本领域技术人员通常已知的宿主生物的培养条件。例如，当宿主生物为丝状菌时，培养基的初始pH可以为约5～10，培养温度可以为约20～40℃，并且培养时间可以为数小时～数日，优选为1～7日。培养方法没有特别限制，可以采用曝气搅拌深层培养、振荡培养、静止培养等。在这些培养方法中的任何一种方法中，都优选在充分的溶解氧条件下进行培养。例如，培养曲霉属微生物时的培养基和培养条件的一个实例如下：使用下面实施例中所述的DPY培养基，以菌体增殖为目的，在30℃下，以10-300rpm搅拌或振荡培养1～3日，以生产麦角硒因为目的，在37℃下，以10-300rpm搅拌或振荡培养3-5日。

培养结束后从培养物中提取麦角硒因的方法没有特别限制。为了提取，可以直接使用从培养物中经过滤、离心分离等操作收集的培养上清液，或者为了提取，也可以使用所收集的培养上清液经干燥和/或浓缩后生成的培养上清液。

提取溶剂没有特别限制，只要其是麦角硒因溶解的溶剂即可，作为其实例，可以列举出：甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等有机溶剂；通过混合这些有机溶剂和水而获得的含水有机溶剂；水、温水和热水等。在向培养上清液或培养上清液浓缩物中添加溶剂后，适当地进行菌体破碎处理，同时提取麦角硒因。提取溶剂温度可以为室温～100℃。

将得到的提取液用于离心分离、过滤器过滤、超滤、凝胶过滤、基于溶解度差的分离、溶剂提取、色谱(吸附色谱、疏水色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、反相色谱等)、结晶化、活性炭处理、膜处理等纯化处理中，由此可以纯化麦角硒因。

可以根据WO2017/026173号或Yamashita等人的文献(THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.285，NO.24，pp.18134-18138，June 11，2010、“EXPERIMENTALPROCEDURES”、“Selenium Determination”)中记载的条件，通过LC-ICP-MS、LC-MS/MS、LC-MS、HPLC等进行麦角硒因的定性或定量分析。本领域技术人员可以适当地选择这些分析条件，例如可以在实施例中后述的条件下实施。

根据本发明一方面的方法，可以高产量地获得麦角硒因。例如，在专利文献2的WO2017/026173号中记载的方法中，从培养菌体中获得麦角硒因，而在本发明的一方面的方法中，可以从培养上清液中获得麦角硒因。在本发明的一方面的方法中，也可以通过根据专利文献2的WO2017/026173号中记载的方法，从培养菌体中适当地提取而得到麦角硒因。

本发明的一方面的方法只要可以解决本发明的问题，可以在上述步骤之前或之后或在这些步骤期间包括各种附加步骤或操作。

(麦角硒因的用途)

利用本发明的一方面的方法或转化体所得到的麦角硒因是充分利用其作为具有各种生理活性的功能性生体物质，以及作为耐热的水溶性物质的特征，从而可用于各种用途。例如，所得到的麦角硒因可以用于制作一般食品和饮品、功能性食品和饮品、功能性声明的食品和饮品、特定保健用途的食品和饮品、营养功能食品和饮品、保健功能食品和饮品、特殊用途的食品和饮品、营养补充食品和饮品、健康补充食品和饮品、补充剂、美容食品和饮品、化妆品、医药产品、准医药产品或动物饲料等，或者生产这些产品的原材料。

特别是已知麦角硒因具有抗氧化活性，据悉该抗氧化活性达到其硫代类似物即麦角硫因的1000倍。因此，例如麦角硒因可以用作表现出捕获羟基自由基的能力、抑制亚铁的自动氧化的能力等生体抗氧化能力的物质，非常有用。此外，作为含有麦角硒因的具体产品，可以列举出：代替亚硒酸和硒代蛋氨酸的营养补充剂、用于癌症或缺血性心脏病等和生活方式相关疾病的预防剂或治疗剂、以及用于甲基汞的解毒剂等，但不限于此。

以下将通过实施例更详细地描述本发明。但是本发明并不受这些实施例的限制，只要能够解决本发明的问题，本发明可以采取各种形态。

实施例

[例1.插入了插入基因AsEgtA的EgtA表达盒的制作]

(1)在酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA的提取用的容量150ml的锥形烧瓶中，使用蒸馏水制备30ml的多聚蛋白胨糊精培养基(1％(w/v)多胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)KH₂PO₄、0.1％(w/v)NaNO₃、0.05％(w/v)MgSO₄·7H₂O、0.1％(w/v)氮杂氨基酸、pH6.0)，接种酱油曲霉NBRC4239菌株的分生孢子，在30℃条件下振荡培养过夜。通过过滤所得的培养液来收集菌体，并将其置于纸巾片之间以除去水分，然后使用事先由液氮冷却过的研钵和研杵在液氮中冷却的同时粉碎菌体。使用DNeasy Plant Mini Kit(Kiagen公司)，从得到的粉碎菌体中提取染色体DNA。

(2)用于构建体的质粒的制作

按下文的方法制作用于构建体的质粒，其是将翻译延伸因子基因tef1的启动子序列Ptef(tef1基因的上游748bp、序列号9)、碱性蛋白酶基因alp的终止子序列Talp(在alp基因的下游800bp、序列号10)、以及与尿苷需求互补的转化标记基因pyrG(包含pyrG基因的上游407bp、编码区域896bp和下游535bp的1838bp、序列号11)连接至质粒pUC19而形成。

通过PCR扩增Ptef、Talp和pyrG。使用上述得到的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA、使用KOD-Plus-DNA Polymerase(东洋纺公司)作为PCR的酶、使用该酶所附带的反应试剂、使用Mastercycler gradient(艾本德公司)作为装置，根据该酶中所附的协议实施该PCR。用于扩增Ptef、Talp和pyrG的引物如下表1～3所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于将Ptef、Talp和pyrG各扩增片段以此顺序连接而成的片段进一步连接至pUC19的附加序列。将扩增的DNA片段在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Kiagen公司)进行纯化。

[表1]

[表2]

[表3]

所使用的pUC19是附属于In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech公司)的pUC19linearized Vector。在pUC19的多克隆位点处的In-Fusion Cloning Site上，使用上述In-Fusion HD Cloning Kit，根据试剂盒附带的协议连接扩增的Ptef、Talp和pyrG，得到用于构建体的质粒。

通过所得到的用于构建体的质粒，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(NipponGene公司)进行转化，以获得转化大肠杆菌。

将所得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。离心分离培养液以收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini Kit(日本遗传学公司)，根据试剂盒所附的协议从获得的菌体中提取质粒DNA。

(3)插入目的基因的构建体的制作

按照以下方法制作将目的基因AsEgtA连接到用于构建体的质粒的Ptef和Talp之间的DNA构建体。

使用上述得到的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用KOD-Plus-DNA Polymerase(东洋纺公司)作为PCR酶，使用该酶所附带的反应试剂，使用Mastercycler gradient(艾本德公司)作为装置，根据该酶中所附的协议实施反向PCR，从而得到用于构建体的质粒的载体片段。所使用的引物如下表4所示。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离扩增的载体片段，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Kiagen公司)进行纯化。

[表4]

为了扩增来自酱油曲霉的基因AsEgtA(序列号1)，使用上述得到的曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用KOD-Plus-DNA Polymerase(东洋纺公司)作为PCR的酶，使用该酶所附带的试剂作为反应试剂，使用Mastercycler gradient(艾本德公司)作为装置，根据酶中所附的协议实施PCR。用于扩增AsEgtA的引物如下表5所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于连接到用于构建体的质粒(Ptef和Talp之间)的附加序列。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离扩增的DNA片段，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Kiagen公司)进行纯化。

[表5]

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据试剂盒所附的协议，连接上述扩增的载体片段和AsEgtA，以得到被插入AsEgtA的、插入了目的基因的DNA构建体。由此获得的DNA构建体是通过在5'→3'方向上连接源自pUC19的DNA片段、Ptef的DNA片段、AsEgtA的DNA片段、Talp的DNA片段、pyrG的DNA片段和源自pUC19的DNA片段而形成的。即，是在pUC19的MCS中插入了Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG的序列的DNA构建体。

通过所得到的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，以获得转化大肠杆菌。

将所得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR，以获得Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG的扩增片段。所使用的引物如下表6所示。在1％(w/v)琼脂糖凝胶中分离扩增的DNA片段，并使用QIAquick Gel Extraction Kit(Kiagen公司)进行纯化。

[表6]

为了扩增区域1(用于同源重组的区域1)和区域2(用于同源重组的区域2)以与酱油曲霉同源重组，使用上述获得的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR。

扩增用于同源重组的区域1和用于同源重组的区域2所使用的引物分别如下表7和表8所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于连接到与pUC19、Ptef或pyrG的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表7]

[表8]

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据该试剂盒所附的协议，连接上述所得的用于同源重组的区域1、Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG和用于同源重组的区域2、pUC19 linearizedVector，以获得在pUC19的MCS中插入了用于同源重组的区域1-Ptef-AsEgtA-Talp-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

通过所得到的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，以获得转化大肠杆菌。

将所得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

为了使上述获得的用于构建体的质粒的Talp和pyrG之间开裂，使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施反向PCR，以获得用于构建体的质粒的载体片段。所使用的引物如下表9所示。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表9]

为了扩增环出区域，使用上述获得的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR。扩增环出区域使用的引物如表10所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于连接到用于构建体的质粒(Talp和pryG之间)的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表10]

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据该试剂盒所附的协议，连接上述所得的用于构建体的质粒的载体片段和环出区域，以获得DNA构建体，该DNA构建体在pUC19的MCS中插入有用于同源重组的区域1-Ptef-AsEgtA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列。

通过所得到的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，以获得转化大肠杆菌。

将所获得的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

通过以下步骤除去所获得的质粒DNA中用于同源重组的区域1的一部分。详细而言，使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用KOD-Plus-Mutagenesis Kit(东洋纺公司)，根据该试剂盒所附的协议，进行从PCR到自连接的步骤。使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置。所使用的引物如下表11所示。

[表11]

使用自连接反应溶液，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOS CompetentE.coli JM109(日本基因公司)进行转化，以获得转化大肠杆菌。

将所获得的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

已确认：通过确定插入到所提取的质粒DNA中的每个DNA片段的碱基序列，获得插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-AsEgtA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

由此获得在pUC19的MCS中插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-AsEgtA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。将用于所获得的DNA构建体的质粒命名为pEgtA_sLO_Py。

使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶附加的协议实施PCR，从而得到EgtA表达盒。所使用的引物如下表12所示。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表12]

由此获得包含用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-AsEgtA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的EgtA表达盒。

[例2.导入了1-4个拷贝的EgtA表达盒的转化酱油曲霉的制作]

(1)酱油曲霉KP-del菌株的制作

根据日本发明专利号6261039公报的实施例2的记载，制作了酱油曲霉KP-del菌株，其中酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体上的pyrG基因和ku70基因被破坏。

(2)酱油曲霉KP-del菌株的转化

500ml容量的锥形烧瓶中的含有20mM尿苷和20mM尿嘧啶的多聚蛋白胨糊精液体培养基100ml中接种酱油曲霉KP-del菌株的分生孢子，在30℃下振荡培养约20小时后，收集菌体。从收集的菌体中制备原生质体。使用20μgEgtA表达盒，通过原生质体PEG法转化所获得的原生质体。然后使用含有0.5％(w/v)琼脂和1.2M山梨糖醇的Czapek-Dox基本培养基(Difco公司，pH6)，将该转化体在30℃下孵育5日以上，得到具有菌落形成能力的转化酱油曲霉。

通过导入补偿尿苷/尿嘧啶需求的基因pyrG，可以使得所得到的转化酱油曲霉在无尿嗪/尿嘧啶添加的培养基中生长发育，从而所获得的转化酱油曲霉可以被选作为导入了目的基因的菌株。

(3)使用1个拷贝的EgtA表达盒选择转化酱油曲霉

酱油曲霉染色体上有八个位点，每个位点可通过同源重组导入EgtA表达盒。因此，通过使用根据实施例1提取的转化酱油曲霉的染色体DNA作为模板进行PCR，从而选择在任何一个位点都导入了1个拷贝的EgtA表达盒的菌株。所使用的引物如下表13所示。

[表13]

在8种正向引物和1种反向引物的8种组合中，获得了一种在一个位置通过同源重组导入了EgtA表达盒的菌株，该EgtA表达盒用1种组合产生PCR产物。

(4)EgtA表达盒中已去除pyrG标记的pyrG去除菌株的制作

与EgtA表达盒中的“用于环出的区域”具有相同序列的区域在8个位点的下游是通用的，这8个位点可以通过同源重组导入。在通过同源重组导入EgtA表达盒的区域中，当在“用于环出的区域”和下游的相同序列区域之间发生同源重组时，通过环出去除由pyrG-用于同源重组的区域2组成的区域。因此，通过以下步骤得到从导入的EgtA表达盒中去除了pyrG的菌株。

将上述获得的、通过同源重组导入了1个拷贝的EgtA表达盒的菌株的分生孢子接种到含有3mg/ml 5-氟磷酸(5-FOA)的带有20mM尿嘧啶的Czapek-Dox琼脂培养基中进行培养，从而获得5-FOA抗性菌株。下述方案(V)中示出了从导入EgtA表达盒到取得5-FOA抗性菌株的步骤的概要。另外，在方案(V)中，“上”表示用于同源重组的区域1，“下1”表示用于同源重组的区域2，“下2”表示用于环出的区域。

[化学式5]

已确认：所获得的5-FOA抗性菌株在添加了20mM尿嘧啶的Czapek-Dox琼脂培养基中生长发育，而不在无尿嘧啶的Czapek-Dox琼脂培养基中生长发育，即呈现出尿嘧啶需求性。

已确认：对确认了尿嘧啶需求性的菌株进行PCR，不会产生pyrG衍生物。所使用的引物如下表14所示。

[表14]

已确认：表13所示的、使用选择同源重组菌株所使用的引物组进行PCR，产生了PCR产物的引物的组合在去除pyrG前的菌株和去除pyrG后的菌株中相同，没有变化。

下面将获得的pyrG去除菌株用作宿主，以进一步导入EgtA表达盒。

(5)导入了2至4个拷贝的EgtA表达盒的转化酱油曲霉的制作

通过重复上述步骤(2)至(4)的基于EgtA表达盒的转化、导入EgtA表达盒的转化酱油曲霉的选择以及pyrG去除菌株的制作，依次得到导入了2个、3个以及4个拷贝的EgtA表达盒的菌株。此时，将通过环出去除pyrG的菌株用作下一次的宿主。此外，在进行PCR选择同源重组菌株时，选择其中产生产物的引物的组合与宿主相比新增加了1组的菌株。

在导入了4个拷贝的EgtA表达盒的菌株中，将在去除pyrG之前保留pyrG的菌株设为sA4菌株。

[例3.导入基因EgtA、SatA和CysB的转化酱油曲霉的制作]

(1)SatA表达盒的制作

为了扩增来自酱油曲霉的基因SatA(序列号2)，使用例1中获得的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X MasterMix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR。用于扩增SatA的引物如下表15所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于与载体片段连接的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表15]

使用例1中得到的pEgtA_sLO_Py作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施反向PCR，以获得用于构建体的质粒的载体片段。所使用的引物如下表16所示。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的载体片段。

[表16]

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据该试剂盒所附的协议，连接上述扩增的载体片段、SatA，得到在pUC19的MCS中插入有用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

通过所得到的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，从而获得转化大肠杆菌。

将所获得的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

通过确定插入到所提取的质粒DNA中的每个DNA片段的碱基序列，得到插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

将所获得的DNA构建体命名为pSatA_sLO_Py。

(2)SatA表达盒的2分割

使用上述获得的pSatA_sLO_Py作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR，从而得到用于构建体的质粒的2种载体片段。所使用的引物如下表17和表18所示。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的载体片段。

[表17]

[表18]

由此得到DNA构建体(SatA表达盒1)和DNA构建体(SatA表达盒2)，其中该DNA构建体(SatA表达盒1)插入了pUC19(部分)-用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp的序列，该DNA构建体(SatA表达盒2)插入了用于环出的区域-pyrG-用于同源重组的区域2-pUC19(部分)的序列。

(3)CysB表达盒的制作

为了扩增来自酱油曲霉的基因Pgpd(启动子)、基因Tamy(终止子)和基因CysB(序列号3)，使用例1中获得的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用Q5 HotStart High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR。用于扩增各基因的引物如下表19～21所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于与pUC19、Pgpd或Tamy连接的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表19]

[表20]

[表21]

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据试剂盒所附的协议，连接上述所获得的Pgpd、Tamy和CysB、pUC19 linearized Vector，以获得在pUC19的MCS中插入了Pgpd-CysB-Tamy序列的DNA构建体。

通过所获得的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，从而得到转化大肠杆菌。

将所获得的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养的培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

已确认：通过确定插入到所提取的质粒DNA中的每个DNA片段的碱基序列，获得插入了Pgpd-CysB-Tamy序列的DNA构建体。

使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR，从而得到Pgpd-CysB-Tamy的扩增片段。所使用的引物如下表22所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于与SatA表达盒1和SatA表达盒2连接的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表22]

由此获得其中插入Pgpd-CysB-Tamy序列的CysB表达盒。

(4)SaCb表达盒的制作

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据该试剂盒所附的协议，连接上述得到的SatA表达盒1、SatA表达盒2和CysB表达盒，以获得pUC19的MCS中插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp-Pgpd-CysB-Tamy-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

通过所得到的DNA构建体，根据制造商的指示，将E.coli HST08 PremiumCompetent Cells(宝生物公司)转化为大肠杆菌宿主，从而得到转化大肠菌。

将所得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养的培养液离心分离，收集菌体。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Kiagen公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

已确认：通过确定插入到所提取的质粒DNA中的每个DNA片段的碱基序列，获得插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp-Pgpd-CysB-Tamy-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

将所获得的DNA构建体命名为pSatA_CysB_sLO_Py。

使用上述获得的用于构建体的质粒作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR，从而得到SaCb表达盒。此时，使用表12所示的引物。使用QIAEX II Gel Extraction Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

由此获得插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-SatA-Talp-Pgpd-CysB-Tamy-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的SaCb表达盒。

(5)导入了4个拷贝的EgtA表达盒和1个拷贝的SaCb表达盒的转化酱油曲霉的制作

使用SaCb表达盒对从例2中制备的sA4菌株中去除pyrG而得到的菌株进行转化。根据在EgtA表达盒导入菌株的制作中所示的方法选择该转化体，从而获得通过同源重组进一步导入了1个拷贝的SaCb表达盒的菌株。将保持着环出前的pyrG的菌株命名为SaCb菌株。

[例4.导入了基因EgtA和MetR的转化酱油曲霉的制作]

(1)MetR表达盒的制作

为了扩增来自酱油曲霉的基因MetR(序列号4)，使用例1中获得的酱油曲霉NBRC4239菌株的染色体DNA作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X MasterMix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR。用于扩增MetR的引物如下表23所示。另外，在表中的序列中，小写序列示出了用于与载体片段连接的附加序列。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

[表23]

使用在例1中获得的pEgtA_sLO_Py作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施反向PCR，从而得到用于构建体的质粒的载体片段。所用引物如表16所示。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的载体片段。

使用In-Fusion HD Cloning Kit，根据该试剂盒所附的协议，连接上述扩增的载体片段、MetR，以获得在pUC19的MCS中插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-MetR-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

通过所获得的DNA构建体，根据制造商的指示，对作为感受态细胞的ECOSCompetent E.coli JM109(日本基因公司)进行转化，从而得到转化大肠杆菌。

将所得到的转化大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄西林的LB液体培养基中于37℃振荡培养过夜。将培养液离心分离，收集菌体。使用FastGene Plasmid Mini试剂盒(日本遗传学公司)，根据该试剂盒所附的协议，从获得的菌体中提取质粒DNA。

通过确定插入到所提取的质粒DNA中的每个DNA片段的碱基序列，获得插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-MetR-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的DNA构建体。

将所获得的DNA构建体命名为pMetR_sLO_Py。

使用上述获得的DNA构建体作为模板DNA，使用Q5 Hot Start High-Fidelity 2XMaster Mix(新英格兰生物实验室公司)作为PCR酶，使用T100热循环仪(伯乐公司)作为装置，根据该酶所附的协议实施PCR，从而得到MetR表达盒。此时，使用表12所示的引物。使用QIAquick PCR Purification Kit(Kiagen公司)，纯化扩增的DNA片段。

由此获得插入了用于同源重组的区域1(部分去除)-Ptef-MetR-Talp-环出区域-pyrG-用于同源重组的区域2的序列的MetR表达盒。

(2)导入了4个拷贝的EgtA表达盒和1个拷贝的MetR表达盒的转化酱油曲霉的制作

使用MetR表达盒对从例2中制备的sA4菌株中去除pyrG而得到的菌株进行转化。根据在EgtA表达盒导入菌株的制作中所示的方法选择该转化体，从而获得通过同源重组进一步导入了1个拷贝的MetR表达盒的菌株。将保持着环出前的pyrG的菌株命名为MetR菌株。

[例5.导入了基因EgtA、SatA、CysB和MetR的转化酱油曲霉的制作]

使用MetR表达盒对从例3中制作的SaCb菌株中去除pyrG而得到的菌株进行转化。根据在EgtA表达盒导入菌株的制作中所示方法选择该转化体，从而获得通过同源重组进一步导入了1个拷贝的MetR表达盒的菌株。将保持着环出前的pyrG的菌株命名为SaCbMetR菌株。

[例6.使用了转化酱油曲霉的麦角硒因生产]

对例2-5中制作的各转化酱油曲霉的麦角硒因生产能力进行如下比较。所使用的转化酱油曲霉的概要如下表24所示。

[表24]

在容量200ml的锥形烧瓶中的40ml的DPY液体培养基(0.5％(w/v)组氨酸、0.5％(w/v)丝氨酸、1％(w/v)酪蛋白胨、2％(w/v)糊精、0.5％(w/v)酵母提取物、0.5％(w/v)KH₂PO₄、0.05％(w/v)MgCl₂·6H₂O；使用自来水调制；pH值未调整)中接种每种菌株的分生孢子，并在30℃下以160rpm振荡培养2日。然后，将硒酸钠添加到培养液中，使培养后的培养液的最终浓度为1mM，再在37℃下以160rpm振荡培养4日。

然后，通过用桐山漏斗(过滤器NO.3)从培养后的培养物中过滤培养液，分成菌体和上清液。通过0.45μm过滤器过滤获得的上清液，以获得上清液组分。

另一方面，通过向获得的菌体中添加8ml水并搅拌，得到菌悬浊液。将得到的菌悬浊液在100℃下、15分钟的条件下进行加热处理。该处理后，将通过离心分离收集的上清液用0.45μm过滤器过滤，得到菌体组分的提取液。

对于上述获得的上清液组分和菌体组分的提取液，在WO2017/026173号(申请号：PCT/JP2016/068128)及Yamashita等人的文献(THE JOURNAL OF BIOLOGAL CHEMISTRYVOL.285，NO.24，pp.18134-18138，June 11，2010、“EXPERIMENTAL PROCEDURES”、“SeleniumDetermination”)中记载的条件，通过LC-ICP-MS，对麦角硒因进行定量。此外，通过WO2017/026173号(申请号：PCT/JP2016/068128)中记载的HPLC分析麦角硒因和麦角硫因的总量。

麦角硒因的量的测量结果如图1A和图1B所示，麦角硒因和麦角硫因的总量的测量结果如图2所示。此外，根据图1A和图2的结果，在图3中示出了麦角硒因的量相对于麦角硒因和麦角硫因的总量的比例。

如图1A和图1B所示，在使用任一菌株的情况下，大部分的麦角硒因在上清液组分中被检测出。此外，与sA4菌株相比，SaCb菌株、MetR菌株和SaCbMetR菌株均产生大量的麦角硒因。因此，在导入EgtA表达盒的菌株中，可以通过强化硒代半胱氨酸合成系统和硒酸盐同化系统来增强从硒酸钠中生产麦角硒因。另外，同样地，即使使用硒酸钾，也可以生产麦角硒因。

此外，如图2和图3所示，发现SaCbMetR菌株以高比例生产麦角硒因。麦角硒因和麦角硫因的结构和分子量相似，难以分离和纯化，可知如果使用SaCbMetR菌株，则通过简化了麦角硒因的分离或纯化的步骤，可以得到麦角硒因含量较高的物质。

[例7.硒化合物的毒性]

硒酸钠的细胞毒性测试如下。为了对细胞增殖进行定量，使用了alamarBlue CellViability Reagent(赛默飞世尔公司)。

将由2×DPY液体培养基(2％(w/v)多胨、4％(w/v)糊精、1％(w/v)酵母提取物、1％(w/v)KH₂PO₄、0.1％(w/v)MgSO₄·7H₂O、pH值未调整)、2×alamarBlue和酱油曲霉NBRC4239菌株的分生孢子2×10⁴个/ml组成的混合溶液分别以100μl注入到微孔板的每个孔中。类似地，向每个孔中添加100μl的硒酸钠水溶液，以使最终浓度为0、0.125、0.25、0.5、1以及2mM。另外，将不添加分生孢子和硒酸钠水溶液的物质作为空白。

将微孔板在30℃下孵育30小时后，测量570nm的吸光度。图4示出了根据alamarBlue试剂的使用说明书从测量结果中减去空白的600nm的吸光度而得到的值的图。

如图4所示，没有发现硒酸钠对生长发育的阻碍。另外，即使用肉眼观察，也没有发现菌丝的生长发育程度的差异。

工业实用性

本发明的一方面的方法或转化体，可以用于大量制造具有生物体抗氧化作用及细胞增殖促进作用等的麦角硒因。因此，本发明可以用于以工业规模制造用于制造赋予了抗氧化功能的化妆品或补充剂等抗氧化产品的原料。

(相关申请的交叉引用)

本申请要求2018年6月15日申请的日本特愿2018-114919号的优先权，其全部记载在此作为公开引用。