抗lag-3抗体与shp-2抑制剂联合治疗肿瘤的用途
阅读说明：本技术 抗lag-3抗体与shp-2抑制剂联合治疗肿瘤的用途 (Use of anti-LAG-3 antibodies in combination with SHP-2 inhibitors for the treatment of tumors ) 是由 马一明 李家鹏 于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：提供了SHP-2抑制剂与LAG-3抗体联合治疗肿瘤,尤其是非小细胞肺癌的用途。(Uses of SHP-2 inhibitors in combination with LAG-3 antibodies for the treatment of tumors, particularly non-small cell lung cancer, are provided.)
技术领域
本发明涉及LAG-3抗体与SHP-2抑制剂在肿瘤治疗中的用途。
背景技术
淋巴细胞活化基因3（1ymphocyte activation gene-3，LAG-3，CD223）属于免疫球蛋白超家族（immunoglobulins superfamily，IgSF）成员，是免疫负性调控因子。其主要在活化的T细胞和NK细胞上高表达。研究表明，LAG-3的胞内段参与下调CD3/TCR活化途径（Iouzalen等，Eur. J. Immunol. 2001，2885-2891）和/或参与LAG-3运输到T细胞质膜的过程（Bae等，J. Immunol. 2014，193: 3101-3112）和/或在激活的T细胞中参与调节STAT5下游信号（Durham等，Plos One 2014，9: e109080）。目前发现的LAG-3的配体包括MHCII（Workman等，Eur. J. Immunol.，2003，33: 970-979）、LSECtin（Feng Xu等，Cancer Res.2014，74: 3418-3428）、Galectin-3（Theodore Kouo等，Cancer Immunol Res. 2015: 412-423）和FGL-1（Jun Wang等，Cell 2019: 334-347.e12）。LAG-3通过与相关配体的相互作用对T细胞和NK细胞的免疫活性进行负性调节。体外研究显示，LAG-3可抑制抗原依赖性T细胞增殖、活化和动态平衡，其在肿瘤、病毒感染和自身免疫性疾病等免疫相关疾病的发生发展中发挥重要作用。LAG-3在耐受的肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）上高表达，介导了肿瘤对TIL细胞免疫活性的抑制作用。用抗-LAG-3抗体阻断LAG-3与MHCII的结合后，T细胞的增殖、活化以及Th1细胞因子的分泌均有改善，有助于T细胞免疫功能的恢复，从其可以获得治疗益处（Grosso等，J Clin Invest 2007，117:3383-3392；Gandhi等，Blood 2006，108:2280-2289）。
Relatlimab是由BMS公司开发的靶向人LAG-3蛋白的抗体。Relatlimab通过阻断LAG-3与其配体MHCII结合，进而阻断肿瘤细胞表面过表达的LAG-3对人T细胞的免疫负性调控通路的激活，从而增强人T细胞的免疫活性，起到杀伤肿瘤的作用。目前，Relatlimab已经处于临床II/III期阶段，主要的适应症包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、胃癌、直结肠癌和头颈部鳞状细胞癌等。
含Src同源区2蛋白质酪氨酸磷酸酶2（Src homology domain 2 containingtyrosine phosphatase-2，SHP-2）是由PTPN11基因编码的一种进化保守的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP），主要由两个SH2结构域（N-SH2，C-SH2）和一个PTP催化结构域组成，在人类各个组织中广泛表达，在维持组织发育和细胞稳态等方面发挥重要作用。SHP-2是原癌蛋白，与多种癌症的发生发展密切相关。在一些人类癌症中，比如肺癌、肝癌、乳腺癌、白血病和胃癌，SHP-2被过表达的内皮生长因子受体（EGFR）或人表皮生长因子受体2（HER2）等RTKs所激活，继而促进肿瘤生长。
SHP099是诺华制药开发的靶向SHP-2的小分子抑制剂。SHP099能够使SHP-2保持关闭构象而活性位点保持自抑制状态，从而抑制其对肿瘤细胞生长的促进作用。研究证实，SHP099能够选择性地强力抑制SHP-2（IC50 = 0.071 μM）。动物实验中，通过口服给药的方式，SHP099能够杀死移植肿瘤小鼠体内的癌细胞。（Chen等，Nature 2016，535：148-152；Jorge Garcia Fortanet等，J. Med. Chem. 2016, 59, 17, 7773-7782）。
临床数据显示，Relatlimab单独给药缓解率不高（NCT02460224），而Relatlimab和PD-1抗体O药联合使用则能够克服PD-1耐药并缩小肿瘤体积。因此，Relatlimab常常与其他药物联合给药治疗肿瘤。因此，寻找能与Relatlimab联合给药的新的抗肿瘤药物，对于肿瘤的药物开发和临床治疗意义重大。
发明内容
本发明首先提供了一种LAG-3抗体与SHP-2抑制剂联合治疗肿瘤的方法。
LAG-3：由编码的受体。
SHP-2：由PTPN11编码的含Src同源序列的酪氨酸磷酸酶。
进一步的，所述LAG-3抗体Relatlimab是阻断LAG-3与MHCII结合的药物。
进一步的，所述SHP2抑制剂SHP099是降低SHP2酶活的药物。
进一步的，所述肿瘤为肺癌，所述肺癌为非小细胞肺癌，优选为EGFR活化的非小细胞肺癌。
实验结果表明，Relatlimab有效结合LAG-3抗原蛋白。
实验结果表明，Relatlimab有效阻断LAG-3结合MHCII。
实验结果表明，Relatlimab能够激活TCR信号通路。
实验结果表明，Relatlimab能够促进原代T细胞分泌IFNγ。
生化实验结果表明，SHP099有效抑制SHP-2活性。
体外药效实验结果表明，SHP099有效抑制NSCLC细胞株NCI-H3255细胞增殖。
体内药效实验结果表明，SHP099有效抑制NSCLC细胞NCI-H3255移植瘤生长。
体内药效实验结果表明，SHP099与协同抑制3LL肿瘤生长。
在一些具体实施方案中，本发明提供了用于抑制肿瘤生长的方法。癌症的实例包括但不限于原发性和/或复发性癌症，包括黑色素瘤、皮肤癌、乳腺癌、间皮瘤、脑癌（例如，多形性胶质母细胞瘤）、头颈部鳞状细胞癌、甲状腺癌、口腔癌、食管癌、胃癌、肺癌（例如，非小细胞肺癌）、肝癌、肾癌、膜腺癌、子宫癌、子宫颈癌、卵巢癌、睾丸癌、前列腺癌、肠癌、膀胱癌、骨癌以及血液学恶性肿瘤（例如淋巴瘤、骨髓瘤或白血病）。
附图说明
图1. LAG-3抗体Relatlimab激活人T细胞免疫活性。（A）Relatlimab与人LAG-3结合；（B）Raji细胞表达MHCII类分子HLA-DR；（C）human LAG-3与Raji细胞（MHCII类分子）结合；（D）Relatlimab阻断人LAG-3结合Raji细胞（MHCII类分子）；（E）Relatlimab激活T细胞内NFAT信号通路；（F）MLR实验证实，Relatlimab促进T细胞分泌IFNγ。
图2. SHP-2抑制剂SHP099抑制NSCLC细胞株NCI-H3255生长。（A）SHP099抑制SHP-2酶活；（B）SHP099抑制NCI-H3255细胞增殖（体外）；（C）SHP099抑制NCI-H3255移植瘤生长（体内）；（D）SHP099没有影响小鼠体重（体内）。
图3. 体外药效评价结果显示，SHP-2抑制剂SHP099不能抑制肺癌细胞3LL细胞增殖。
图4. 体内药效结果显示，SHP-2抑制剂和LAG-3抗体协同抑制肿瘤生长。（A）阴性对照组的肿瘤体积生长曲线；（B）SHP099单独给药组的肿瘤体积生长曲线；（C）mLAG-3抗体单独给药组的肿瘤体积生长曲线；（D）SHP099和mLAG-3抗体联合给药组的肿瘤体积生长曲线。
具体实施方式
实施例一 SHP-2抑制剂对非小细胞肺癌NCI-H3255细胞株生长抑制活性评价
重组表达蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-2。简言之，将SHP-2 cDNA序列克隆至pGEX-4T-2质粒之中，随后转化BL21（DE3）pLyss感受态细胞，涂板，37摄氏度培养过夜。第二天，挑取菌落，于37度250rpm摇菌，直至OD600值介于0.6~0.8之间，加入1mM IPTG，于37摄氏度180rpm诱导过夜。第二天离心收菌，超声，随后于4摄氏度20000rpm离心60分钟。随后，收集上清，过Ni NTA亲和柱。随后经洗涤杂蛋白后，用250mM咪唑缓冲液洗脱目的蛋白。进一步，用脱盐柱置换buffer，并用Q柱和分子筛进一步纯化，最终得到重组SHP-2蛋白。
SHP099对蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP-2抑制活性的评价。进一步用上述纯化到的SHP-2蛋白对SHP-2抑制剂SHP099进行活性评价。简言之，磷酸酶生化反应是在室温下进行，使用96孔黑色平底板，总体积100ul，缓冲液为50mM HEPES, pH 7.2, 100mM NaCl, 0.5mMEDTA, 0.05% P-20, 1mM DTT。0.2nM SHP2与0.5uM多肽（H2N-LN(pY)IDLDLV(dPEG8)LST(pY)ASINFQK-amide）于25摄氏度孵育30分钟。随后将底物DiFMUP(Invitrogen，货号D6567)加入至上述反应体系，用酶标仪动态模式读数，激发波长和发射波长分别为340nm和450nm。进一步计算IC50。SHP099对SHP2的抑制活性如图1A所示。
SHP099对非小细胞肺癌NCI-H3255细胞株生长抑制活性的评价。将非小细胞肺癌NCI-H3255细胞按3000个细胞每孔的密度接种到96孔细胞培养板中，用培养基（DMEM/10%FBS/1%青链霉素）培养。24小时后，加入浓度梯度SHP-2抑制剂SHP099（10uM起始浓度，1：4倍比稀释，共7个浓度），放回培养箱中继续培养。等到药物处理5天后，每孔加入10ul CCK8，混匀后，于37度继续孵育3小时，酶标仪于450nm处检测吸光度。SHP099对非小细胞肺癌NCI-H3255生长抑制活性如图1B所示。
SHP099对非小细胞肺癌NCI-H3255移植瘤生长抑制的评价。将非小细胞肺癌NCI-H3255接种于6-8周周龄的C57BL/6J小鼠。待形成肿瘤后，开始注射SHP099，并定期检测小鼠体重变化以及肿瘤体积变化。结果显示，SHP099有效抑制肿瘤生长（图1C和图1D）。
实施例二 LAG-3抗体Relatlimab增强T细胞免疫活性
Relatlimab结合人LAG-3重组蛋白。重组表达人LAG-3蛋白并进一步使用ELISA评价Relatlimab与人LAG-3的结合。将10ug/mL人LAG-3重组蛋白于4摄氏度包板过夜。第二天，用1×PBST洗板3次后，加入5% BSA/1×PBST封闭3小时，1×PBST洗板3次，随后加入浓度梯度Relatlimab，室温孵育2小时；1×PBST洗板3次，加入HRP标记抗人IgG二抗，室温孵育2小时，1×PBST洗板3次，每孔加入50ul TMB，反应10分钟，2N硫酸终止反应，酶标仪读数。结果显示，LAG-3抗体Relatlimab与LAG-3结合（图2A）。
配体阻断实验。将Relatlimab与生物素标记的人LAG-3重组蛋白于室温孵育30分钟，随后将上述混合体系与Raji细胞进一步孵育，室温30分钟，FACS缓冲液洗3遍后，加入PE标记Streptavidin（1：1000），室温30分钟，FACS缓冲液洗3遍后，流式细胞仪检测。结果显示，Relatlimab阻断LAG-3与HLA-DR结合（图2B）。
NFAT荧光素报告体系评价Relatlimab对T细胞的激活作用。为评价Relatlimab对T细胞的激活作用，将浓度梯度Relatlimab加入到Jurkat/LAG-3/NFAT-luc与Raji的混合细胞体系之中，12小时后，加入SteadyGlo底物，室温振荡10分钟后，酶标仪检测化学发光。结果显示，Relatlimab激活人T细胞株Jurkat的NFAT信号通路（图2C）。
实施例三体外药效实验中SHP-2抑制剂没有抑制肺癌细胞株3LL细胞增殖
SHP099对非小细胞肺癌3LL细胞株生长抑制活性的评价。将非小细胞肺癌3LL细胞按3000个细胞每孔的密度接种到96孔细胞培养板中，用培养基（DMEM/10%FBS/1%青链霉素）培养。24小时后，加入浓度梯度SHP-2抑制剂SHP099（10uM起始浓度，1：4倍比稀释，共7个浓度），放回培养箱中继续培养。等到药物处理5天后，每孔加入10ul CCK8，混匀后，于37度继续孵育3小时，酶标仪于450nm处检测吸光度。SHP099对非小细胞肺癌3LL生长抑制活性如图3所示，SHP099没有抑制肺癌细胞株3LL细胞增殖。
实施例四体内药效实验中SHP-2抑制剂和LAG-3抗体协同抑制3LL肺癌移植瘤生长
体内药效实验中SHP-2抑制剂和LAG-3抗体协同抑制3LL肺癌移植瘤生长。将非小细胞肺癌3LL细胞接种于6-8周周龄的C57BL/6J小鼠。待形成肿瘤后，开始注射SHP099，并定期检测小鼠体重变化以及肿瘤体积变化。结果显示（图4），与对照组（图4A）相比，SHP-2抑制剂或LAG-3抗体单独给药对肿瘤生长抑制较弱（图4B和4C），两者联合给药对肿瘤生长抑制明显增强（图4D），表明两者协同抑制肿瘤生长，SHP-2抑制剂与LAG-3抗体对肿瘤生长的协同抑制可能是由对小鼠机体免疫活性的激活所介导。
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