发明内容

为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供固定半乳糖氧化酶的方法及其产品和应用，通过将半乳糖氧化酶与二价铜离子、四价锆离子于磷酸盐缓冲液中固定，或是将半乳糖氧化酶与二价铜离子、羟高铁血红素于磷酸盐缓冲液中固定，制备得到金属蛋白框架材料。半乳糖氧化酶是一种铜依赖性酶，活性中心的铜为二价时半乳糖氧化酶才具有活性，发挥催化转化作用，因此，能够持续将半乳糖氧化酶活性中心的一价铜氧化为二价铜，是半乳糖氧化酶持续发挥催化转化作用的关键。利用二价铜离子和四价锆离子以及二价铜离子和羟高铁血红素均可以使半乳糖氧化酶持续发挥催化转化作用，进而提高催化转化效率。

更为具体的，本发明采用的技术方案如下：一种固定半乳糖氧化酶的方法，包括以下步骤：

（1）使用大肠杆菌作为表达菌株，将半乳糖氧化酶进行诱导培养，通过镍柱亲和层析法进行纯化，得到半乳糖氧化酶；

（2）将半乳糖氧化酶、二价铜离子和四价锆离子，以及半乳糖氧化酶、二价铜离子和羟高铁血红素分别加入到PBS缓冲液中；

（3）将混合后的溶液混匀，形成固定后的金属蛋白框架材料；

（4）将金属蛋白框架材料与溶液分离。

作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（1）中，选用大肠杆菌BL21（DE3）作为表达菌株，pET28（a）为载体，利用IPTG进行诱导表达，通过镍柱进行纯化，使用酶标仪测试半乳糖氧化酶的浓度。

作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，四价锆离子离子浓度为0.05-1.5mM；步骤（2）中，半乳糖氧化酶浓度为0.02-0.5mg/ml，二价铜离子浓度为0.15-10mM，羟高铁血红素浓度为0.0025-1mM；所述的PBS缓冲液的pH为7.0-7.8。

作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（3）中，将混合后溶液轻轻上下颠倒数次使之混合均匀，在15℃-30℃条件下静置16h-72h，形成金属蛋白框架颗粒。

作为本发明进一步改进的技术方案，步骤（4）中，采用离心分离，在转速为3000rpm -6000 rpm，温度为4℃-15℃的条件下将固定后金属蛋白框架颗粒与溶液分离。

另一方面，本发明还保护所述的方法制备得到的基于二价铜离子和四价锆离子固定半乳糖氧化酶的金属蛋白框架材料。

另一方面，本发明还保护所述的方法制备得到的基于二价铜离子和羟高铁血红素固定半乳糖氧化酶的金属蛋白框架材料。

本发明还保护上述的金属蛋白框架材料在催化转化5-羟甲基糠醛中的应用。

本发明还保护上述的金属蛋白框架材料用于多种醇类和醛类的氧化。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

一方面，本发明通过将二价铜离子、四价锆离子与半乳糖氧化酶于磷酸盐缓冲液中固定，得到双金属蛋白框架材料，发挥催化转化作用，提高了半乳糖氧化酶的活性，转化率比游离半乳糖氧化酶催化转化5-羟甲基糠的效率提高5-6倍。且具有多底物适用性，具有广泛的应用前景。

另一方面，本发明通过将二价铜离子、羟高铁血红素与半乳糖氧化酶于磷酸盐缓冲液中固定，得到金属蛋白羟高铁血红素框架材料，发挥催化转化作用，将羟基氧化为醛基时，提高了半乳糖氧化酶的活性，转化率比游离半乳糖氧化酶催化转化5-羟甲基糠醛的效率提高5-6倍。且可以用于多种醇类和醛类的氧化，具有广泛的应用前景。