羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用

文档序号：1841881 发布日期：2021-11-16 浏览：11次 >En<

阅读说明：本技术 羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用 (Carbonyl reductase mutant and application thereof in asymmetric synthesis of bi-chiral compound ) 是由王亚军程峰翟秋瑶邱帅郑裕国于 2021-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用,所述突变体是将SEQ ID NO.1所示野生型羰基还原酶KmCR-WT氨基酸序列第100位进行单突变获得的。本发明突变体A100S活力较野生型提高了0.8倍,且具有严格的S-构型立体选择性。对其他本发明所述的脂肪族酮化合物,催化活力均有提升,其中对异丁酰乙酸乙酯、丁酰乙酸乙酯的酶活高于目前报道的文献水平。(The invention discloses a carbonyl reductase mutant and application of asymmetric synthesis of a bi-chiral compound thereof, wherein the mutant is obtained by performing single mutation on the 100 th site of a wild carbonyl reductase KmCR-WT amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1. Compared with the wild type, the activity of the mutant A100S is improved by 0.8 times, and the mutant has strict S-configuration stereoselectivity. The catalytic activity of other aliphatic ketone compounds is improved, wherein the enzyme activity of isobutyryl ethyl acetate and butyryl ethyl acetate is higher than the level of the literature reported at present.)

(一)

技术领域

本发明涉及一种属于短链脱氢酶/还原酶超家族(SDR)的羰基还原酶KmCR的半理性改造策略，其突变体催化合成双手性二醇6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯，具体涉及利用计算机辅助选择合适的区域进行易错PCR，并建立合适的筛选方法。

(二)

背景技术

羰基还原酶(Carbonyl reductase,EC 1.1.1.184)属于氧化还原酶大类，在自然界中非常常见，广泛存在于各种植物、微生物、哺乳动物组织中，依赖NADP(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)或NAD(H)(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为辅酶。按照其氨基酸的序列长度和催化活性位点的差别，羰基还原酶主要分布于三个超家族：醛酮还原酶超家族(Aldo-keto reductases，AKRs)、中链脱氢酶/还原酶超家族(Medium-chain dehydrogenases/reductases，MDRs)、短链脱氢酶/还原酶超家族(Short-chain dehydrogenases/reductases，SDRs)。

AKRs通常以单聚体形式存在，约含有320个左右的氨基酸，大小约为35kDa，是一类非金属依赖型还原酶。它不需要Rossmann折叠就能够与烟酰胺类辅酶结合。AKRs的序列相似度较高，且具有典型的(α/β)₈桶状结构，Y(酪氨酸)-K(赖氨酸)-H(组氨酸)-D(天冬氨酸)是其催化活性四联体。MDRs通常以二聚体或四聚体的形式存在，单亚基大约为350个氨基酸，是一类锌-或非锌-依赖型脱氢酶，取决于是否具有保守的G-H-E Zn²⁺结合位点。它们的序列同源性较高，一般可达到40～90％。其三维结构含有Rossmann折叠，TGxxxGxG是其保守辅酶结合域，D(天冬氨酸)-Y(酪氨酸)-K(赖氨酸)-H(组氨酸)是其催化活性四联体。

SDRs是迄今为止已知的最大、最古老的蛋白质超家族之一，它的来源非常丰富，广泛分布于各种生物体中，从古细菌到高等的真核生物和病毒。SDRs通常为单聚体、二聚体或四聚体蛋白，单亚基约含有250个氨基酸残基，但也有350个残基的SDR形式，这些亚基在C端延伸。SDRs是一类非金属依赖型脱氢酶。尽管大部分短链脱氢酶的序列同源性较低，一般只有15～30％，但是它们的三级结构具有一些共同的特性：(i)具有保守的3D结构Rossmann折叠，通常为β折叠与α螺旋形成的β-α-β-α-β拓扑结构；(ii)N端具有核苷酸辅因子结合基序TGxxxGxG；(iii)具有YxxxK活性位点载体。SDR经典的催化三联体被定义为“S-Y-K”，但是这并不是绝对的。其中，Ser有时候被Thr取代，Tyr有时候被Met取代。随着结晶技术的发展，越来越多短链脱氢酶的结构被鉴定，Asn被发现对短链脱氢酶催化三联体中的Lys有一定的激活作用，由此形成了大多数SDR形式的催化活性中心“N-S-Y-K”。

羰基还原酶能够催化脂肪酮、芳香酮、醛和醌等不对称还原生成相应的手性醇。而手性醇在医药制造、食品健康、农用化学品等领域扮演着非常重要的角色。在本发明中，我们设计一种区域epPCR(error-prone PCR)的定向进化策略，并通过薄层色谱的筛选方法获得较野生型菌株羰基还原酶KmCR具有更高活力和立体选择性的突变体。

(三)

发明内容

本发明目的是针对现有羰基还原酶KmCR催化还原6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯(A6)活性不高、立体选择性不高、底物谱范围狭窄等问题，提供一种立体选择性羰基还原酶突变体及利用该羰基还原酶突变体基因重组菌及其酶液作为生物催化剂，用于不对称还原脂肪族酮化合物制备手性化合物，特别是突变体还原6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯(A6)生成6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯，立体选择可以达到光学纯的要求，催化活力提升了约0.8倍，并用该突变体测试不同的脂肪族酮化合物，其催化活力均获得了一定程度的提升。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种羰基还原酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.1所示野生型羰基还原酶KmCR-WT氨基酸序列第100位进行单突变获得的，优选所述突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列第100位丙氨酸突变为丝氨酸、苏氨酸或半胱氨酸中的一种，更优选突变为丝氨酸(相应突变体记为KmCR-A100S)。

SEQ ID NO.1：

MTFTVVTGANGYIAKHILKSLLEDGHRVIGTVRNSKKAEELKRTVNDENLIVELVPDMLVENAFDELFKKYNTQIKYVFHTASPVLETSKDYEKSLIEPAITGAKSMVEAIRKYSLTSVEHIVYTSSIAASSLESEFTDPTLVVSEDSWNPQGLEEAKTEFFTAYSYSKKIAEKTMWDFVEEYKGTEHEIKLTTVNPCFNIGPQAYEADVTETMNFTAELINHVVKSKVGDPLPPTRIVPYVDVRDTARAHVDALKNEKLAFQRLLVVGPFLSSQQIYDIVNERFPQLRGKIARGEPGSDKLDPAKLAKFDHARTTQALGWEFTPIEKAIADEVAQILRVGAYRG。

本发明羰基还原酶突变体KmCR-A100S严格遵循Prelog规则，氨基酸序列为SEQ IDNO.3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ IDNO.3所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其突变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该肽蛋白的片段或肽蛋白变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上，均属于本发明保护范围之内。具体的所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中对于变体保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的化学结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明同步提升羰基还原酶立体选择性和催化活力的羰基还原酶突变体的改造策略为：1)通过SEQ ID NO.1所示野生型羰基还原酶KmCR-WT同源建模和分子对接分析，根据底物(脂肪族酮酯化合物)被还原的羰基与各氨基酸之间的距离，对野生型羰基还原酶的氨基酸进行统计和分类(根据选取距离底物上羰基氧原子范围内的氨基酸残基进行分类)，综合考虑epPCR区域片段长短和所分类的氨基酸的数目，选择范围内的氨基酸设计引物，以建立区域epPCR；区域epPCR片段优选覆盖底物作用原子附近或酶催化口袋附近氨基酸的片段，所设计引物应具有合适的长度，在缩小突变文库范围的同时保证合理易于操作的突变率。2)建立薄层色谱的筛选方法对区域epPCR所获得的突变文库进行筛选，并通过高效液相色谱进行复筛；薄层色谱的筛选方法应选择合适的展开剂，使底物与产物完全分离，并控制一定的点样体积，以便进行含量鉴定。3)对步骤2所获突变位点进行定点饱和突变，确定最优突变体。

本发明还提供一种所述羰基还原酶突变体编码基因，编码基因构建的重组载体以及重组载体转化制备的基因工程菌。重组载体的基础载体优选pET-28a(+)，用于构建工程菌的宿主菌优选E.coli BL21(DE3)。

本发明还提供一种所述羰基还原酶突变体在不对称还原脂肪族酮化合物合成双手性化合物中的应用，所述脂肪族酮化合物为6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸叔丁酯、乙酰丙酸乙酯、异丁酰乙酸甲酯、异丁酰乙酸乙酯、4-氯-乙酰乙酸甲酯、丁酰乙酸乙酯。

本发明所述羰基还原酶突变体不对称还原脂肪族酮化合物的方法为：将羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心，收集湿菌体，以湿菌体破碎提取的纯酶液为催化剂，以NADPH为辅酶，以脂肪族酮化合物为底物，以pH 7.0-8.0缓冲液为反应介质构成转化体系，在35～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性化合物。当底物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，产物双手性化合物为6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

所述底物添加终浓度以缓冲液体积计为1-50mM，优选10mM；辅酶加入终浓度以缓冲液体积计为0.5-5mM，优选1mM；所述催化剂加入终浓度以缓冲液体积计为0.1-20g/L，优选纯酶加入量以蛋白含量计为0.1-10g/L缓冲液，优选1-2g/L。所述反应条件优选为35℃、600rpm。所述缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液、磷酸钾缓冲液、Tris-HCl缓冲液，优选pH 7.0、100mM的磷酸钾缓冲液。

本发明另外一种所述羰基还原酶突变体不对称还原脂肪族酮化合物的方法为：分别将羰基还原酶突变体基因工程菌和葡萄糖脱氢酶基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集的湿菌体混合，以混合菌体为催化剂，以脂肪族酮化合物为底物，以葡萄糖为辅助底物，以pH 7.0-8.0缓冲液为反应介质构成转化体系，在35～40℃、600～800rpm条件下进行反应，反应结束，反应液分离纯化，获得手性化合物。当底物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯时，产物双手性化合物为6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯；所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌是将SEQ ID NO.6所示葡萄糖脱氢酶EsGDH基因插入到pET28a(+)的Nco I、XhoI位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，制得E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh。所述转化体系中，催化剂加入量以缓冲液体积计0.1-20g/L(优选4.5g/L)，混合菌体中羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集湿菌体与葡萄糖脱氢酶基因工程菌经发酵培养后的发酵液离心收集湿菌体以湿重比1-5:1(优选5:1)混合；所述底物加入量以缓冲液体积计1-150g/L，优选10g/L；所述葡萄糖加入量以缓冲液体积计1-150g/L，优选15g/L。

本发明羰基还原酶突变体基因工程菌和葡萄糖脱氢酶基因工程菌的接种、转接、诱导、菌体回收，培养基可为本领域任何可使菌体生长并产生本发明的培养基，优选LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，121℃蒸汽灭菌20min。培养方法和培养条件没有特殊的限制，培养方法和条件可以根据宿主类型和培养方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择。

本发明所述羰基还原酶突变体基因工程的构建方法为：将羰基还原酶KmCR突变体基因插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)制得含羰基还原酶突变体基因的工程菌。

本发明所述羰基还原酶突变体基因工程菌经发酵培养的湿菌体或湿菌体提取的纯酶液按如下方法制备：

(1)湿菌体：将羰基还原酶突变体基因工程菌接种到终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12～16h，获得种子液；将种子液以2.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6-0.8)，培养液中加入终浓度为0.15-0.2mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12～14h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含羰基还原酶突变体的湿菌体。

(2)粗酶液：将步骤(1)湿菌体用100mM PB缓冲液重悬(优选以20g/L的量重悬)，置于冰上超声破碎10min；超声破碎条件：功率设定为400W，破碎1s暂停5s；并在4℃下，以12000rpm离心10～15min，上清用0.22μm的滤膜过滤，滤液即为粗酶液。

(3)纯酶液

结合液(Binding Buffer)组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠，溶剂为超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0。

洗涤液(Washing Buffer)组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠和50mM咪唑，溶剂是超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0。

洗脱液(Elution Buffer)组成：20mM二水合磷酸二氢钠、300mM氯化钠和500mM咪唑，溶剂为超纯水，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0。

用结合液冲洗镍柱，流速为0.4mL/min，直到UV基线平衡后，将粗酶液以0.2mL/min的流速上样，使目的蛋白和镍柱充分结合；用洗涤液冲洗杂蛋白，流速为0.3mL/min，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；用洗脱液洗脱目的蛋白，流速为0.25mL/min，当UV达到200mAU时开始收集，当UV再次降至200mAU时停止收集，获得目的蛋白洗脱液；将收集的目的蛋白洗脱液置于20mM的pH 7.0磷酸钾缓冲液中透析(MD34，Viskase，美国)过夜，截留液即为纯酶液。

本发明所述葡萄糖脱氢酶基因工程菌湿菌体的制备方法为：将NCBI数据库中来自微小杆菌(Exiguobacterium sibirium)DSM 17290的葡萄糖脱氢酶EsGDH基因(GenBankNO.KM817194.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)制得E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh；将E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh接种到终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将种子液以2.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6)，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含葡萄糖脱氢酶的湿菌体。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明开发了一种区域epPCR的定向进化策略，与传统全基因epPCR策略相比，该法能有效缩小基因突变文库的规模，降低筛选的难度和时间成本，适用于大部分酶基因的分子改造。将该法成功应用于一条来自马克斯克鲁维酵母K.marxianus的羰基还原酶KmCR的分子改造中。改造获得的突变体可用于催化合成6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯、(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯、(S)-3-羟基丁酸乙酯、4,4,4-三氟-(S)-3-羟基丁酸乙酯、(S)-3-羟基丁酸叔丁酯、(S)-4-羟基戊酸乙酯、(S)-3-羟基-4-甲基戊酸甲酯、(S)-3-羟基-4-甲基戊酸乙酯、4-氯-(S)-3-羟基丁酸甲酯、3-羟基己酸乙酯。其中，野生型羰基还原酶KmCR偏好Prelog规则，但仅具有中等的立体选择性(de_P 66.6％,S)。KmCR的突变体A100S活力较野生型提高了0.8倍，且具有严格的S-构型立体选择性。对其他本发明所述的脂肪族酮化合物，催化活力均有提升，其中对异丁酰乙酸乙酯、丁酰乙酸乙酯的酶活高于目前报道的文献水平。

(四)

附图说明

图1、实施例1区域epPCR残基的分类图。

图2、实施例1区域epPCR的设计图。

图3、实施例2薄层色谱筛选图，标签1为底物对照品，标签2-4为不同突变体的反应液，标签5为产物对照品；1a代表底物对照品6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯，1b代表6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯。

图4、实施例1中epPCR(A)和大引物PCR(B)产物电泳图，泳道M为标准DNA marker，泳道1为区域epPCR片段，泳道2为大引物PCR基因片段。

图5、实施例4中SDS-PAGE蛋白电泳图，A为羰基还原酶KmCR及其突变体粗酶液蛋白电泳图，泳道M为标准蛋白质marker，泳道1为KmCR粗酶液上清，泳道2为KmCR粗酶液沉淀，泳道3为突变体粗酶液上清，泳道4为突变体粗酶液沉淀；B为羰基还原酶KmCR及其突变体纯酶液蛋白电泳图，泳道1为KmCR纯酶液，泳道2为突变体纯酶液。

图6、实施例4中蛋白质标准曲线图。

图7、实施例4中NADPH标准曲线图。

(五)

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：区域epPCR的设计

(1)区域epPCR片段的扩增(483bp)

从PDB蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，简称PDB)中筛选得到与来自马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces.marxianus)CICC32920的羰基还原酶KmCR(记为野生型KmCR-WT，GenBank NO.AB183149.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示)具有42％相似度的蛋白KpADH(PDB ID：5ZEC)。通过Modeller 9.20对野生型羰基还原酶KmCR-WT进行同源建模，利用YASARA将底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(A6)与野生型羰基还原酶KmCR-WT进行分子对接，并分析底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(A6)被还原羰基与周围各氨基酸的距离。根据底物被还原的羰基与各氨基酸之间的距离不同，对野生型羰基还原酶KmCR-WT的氨基酸进行统计和分类(图1)。综合考虑epPCR片段长短和所分类的氨基酸的数目，选定范围内的氨基酸进行区域epPCR的引物设计(图2)：epPCR-F：ACACTGCGTCCCCGGTTCT；epPCR-R：GACGTATGGCACAATTCTCGTTG。采用易错PCR试剂盒(购自天恩泽公司《即用型易错PCR试剂盒》)，以E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmcr(实施例3方法构建)为模板，以epPCR-F和epPCR-R为引物进行PCR反应。反应体系如表1所示。epPCR反应程序：94℃预变性3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸50s，30～60个循环。

PCR扩增结束后，用琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物大小(图4中A)。并采用胶回收试剂盒(购自杭州Axygen生物技术有限公司)对阳性PCR产物进行切胶回收以作为第二轮大引物PCR的模板。切胶回收步骤如下：在紫外灯下切下含有目的DNA条带的凝胶，用吸水纸吸尽表面水分并切成小块，称量记录下凝胶的重量，装入2mL洁净的EP管中；向EP管中加入3个凝胶体积的Buffer DE-A，75℃水浴加热至凝胶完全熔化，此过程约持续8min；再向EP管中加入0.5个Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀后转移至含有制备管的2mL洁净的EP管中，12000rpm离心1min，弃上清液；将制备管置回2mL EP管中，加入500μL Buffer W1，12000rpm离心1min，弃上清液；将制备管置回2mL EP管中，加入700μL含体积浓度75％乙醇的Buffer W2，12000rpm离心1min，弃上清液，并再次重复该步骤1次；将制备管置于新的洁净的1.5mL EP管中，加入预热的60℃去离子水，静置1min，12000rpm离心1min，弃制备管，得到纯化的DNA片段，即区域epPCR阳性产物。

表1区域epPCR反应体系

(2)大引物PCR扩增

以E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-kmcr为模板，以步骤(1)中区域epPCR阳性产物为引物，进行第二轮大引物PCR，体系如表2所示。

表2大引物epPCR反应体系

大引物PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；55～57℃退火30s；72℃延伸6.5min，共30个循环；72℃终延伸10min。大引物PCR结束后，用琼脂糖凝胶电泳验证得到明亮且单一的条带，大小约为6500bp(图4中B)。

实施例2：高通量筛选方法与突变文库的建立

对实施例1中大引物PCR产物进行纯化与转化，获得区域epPCR突变文库，并建立薄层色谱的筛选方法对突变文库进行初筛，再利用高效液相色谱(HPLC)进行复筛，具体步骤如下：

(1)大引物PCR产物纯化与转化

实施例1步骤(2)获得大引物PCR阳性电泳产物后，先用Dpn I酶进行消化，去除原模板：向25μL的大引物PCR产物中加入1μL Dpn I酶，并在37℃下孵育1.5h，获得酶切后的产物。

PCR产物的纯化采用《Axygen Clean Up Kit》试剂盒(购自杭州Axygen生物技术有限公司)，步骤如下：将PCR酶切后的产物转移至1.5mL EP管，加入3倍体积的PCR-A，若PCR-A不足100μL，则加至100μL；组装2mL EP管(含制备管)，将上述PCR-A与PCR产物的混合液转移进来，12000rpm离心1min，弃上清液；用700μL含体积浓度75％乙醇的Buffer W2洗脱制备管，12000rpm离心1min，弃上清液；再次用400μL含体积浓度75％乙醇的Buffer W2洗脱制备管，12000rpm离心1min，弃上清液；将制备管转移至新的洁净的1.5mL EP管中，加入预热的60℃去离子水30μL，静置1min，以同样方式离心，弃制备管，即为纯化的PCR产物。

从-80℃冰箱取出预先制备好的E.coli BL21(DE3)感受态细胞，在冰上稍微化开，约5min；在超净台中，向融化的感受态细胞中加入10μL已纯化的PCR产物，在冰上静置30min；42℃下热击90s后立即冰浴5min；在超净台中加入800μL灭菌后的LB液体培养基，37℃、200rpm下培养40～60min；培养结束后，以8000rpm离心1min，弃部分上清，留100μL充分悬浮菌体后涂布于含50μg·mL^-1卡那霉素(Kan)的LB平板上，37℃培养12～16h，获得单菌落。LB液体培养基组成：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L，蒸馏水溶解，121℃蒸汽灭菌20min。LB平板组成是在LB液体培养基组成的基础上添加20g/L琼脂。

(2)挑取步骤(1)的单菌落于48深孔培养板中，加入含50μg·mL^-1Kan的LB液体培养基3mL，37℃、150rpm扩培12h，并在28℃、150rpm下添加终浓度为0.15mM IPTG诱导14h。4000rpm离心10min后，弃上清。

(3)薄层色谱初筛方法的建立

在步骤(2)的48孔板中，每个孔加入320μL100 mM的PB缓冲液(pH 7.5)，再加入终浓度为10g/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，终浓度为20g/L葡萄糖，终浓度为5g/L葡萄糖脱氢酶，用排枪反复吹打混匀后，35℃，600rpm下反应15min，各孔分别取上清200μL并分别用200μL乙酸乙酯萃取后，分别取10μL乙酸乙酯层点样薄层色谱板进行筛选。

展开剂采用正己烷与乙酸乙酯(1:1，v/v)，显色剂选用碱性高锰酸钾(1.5g KMnO₄+10g K₂CO₃+1.25mL质量浓度10％NaOH水溶液+200mL H₂O)，待层析缸中的展开剂爬至硅胶板顶端0.5～1cm后将硅胶板取出，数秒后用镊子夹取适宜的棉球蘸取染色剂涂布于硅胶板，并用吹风机的热风充分吹干硅胶板，此时含还原性基团化合物的底物与产物在淡紫红色背景上会显现出黄色斑点，根据底物与产物的Rf值(溶质移动的距离/溶液移动的距离)不同进行鉴定(图3)。

(4)高效液相色谱复筛方法的建立。

根据步骤(3)初筛结果，取50μL步骤(2)相应培养孔的菌液，送杭州擎科生物科技公司进行测序(表3)，并取50μL菌液接种至10·mL含50μg·mL^-1Kan的LB液体培养基的试管中，37℃培养12h，获得种子液。将种子液以2.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL Kan的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h至OD₆₀₀＝0.6，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得各个含羰基还原酶突变体的湿菌体。

复筛在5mL反应体系中：以5mL pH 7.0的100mM磷酸钾缓冲液为反应介质，混合菌体加入终浓度为4.5g DCW·L^-1(含羰基还原酶突变体基因的湿菌体与实施例3方法制备的含葡萄糖脱氢酶基因的湿菌体质量比为5:1，w/w)，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯加入终浓度为10g·L^-1，葡萄糖加入终浓度为15g·L^-1。35℃、600rpm下反应15min，加入1mL乙醇终止反应。12000rpm离心4min，上清用0.22μm有机膜过滤，滤液利用高效液相色谱进行检测产物6-氰基-(3S,5R)-二羟基己酸叔丁酯(S-构型)和产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯(R-构型)的峰面积，根据S-构型产物标准曲线y＝170.98x-12.8与R-构型产物标准曲线y＝181.1x+18.04换算出产物的浓度。

其中，C_R和C_S分别表示R-构型产物和S-构型产物的摩尔浓度，单位为M。

高效液相色谱检测条件：色谱柱采用J&K Scientific C18反向柱(4.6mm×150mm，5μm)，流动相由体积比为1:3(v/v)的乙腈与水组成，流速为1.0mL·min^-1，检测波长设定为210nm，进样量为10μL，柱温箱设置为40℃，底物保留时间为15.353min，产物保留时间为9.057min(S-构型)与9.501min(R-构型)。

通过初筛与复筛(表3)，获得催化活力提高0.4倍的突变体KmCR-A100T，立体选择性de_p>99.5％(S)。

表3复筛突变文库

实施例3：定点饱和突变文库的建立及筛选

1、定点饱和突变文库的建立

通过区域epPCR获得立体选择性和催化活力均有提升的突变体KmCR-A100T，按照短链脱氢酶催化四联体理论，此点为催化四联体的第一个位点，由此对SEQ ID NO.1所示氨基酸序列第100、127、165、169这四个位点设计定点饱和突变策略进行研究。相关引物设计如表4所示，N代表碱基A、T、C、G；M代表碱基A、C；K代表碱基G、T。

表4定点饱和突变引物

定点饱和PCR反应体系与程序参照实施例1中大引物PCR体系与程序，其中50μL体系中定点饱PCR的上、下游引物分别添加1μL，反应程序中的退火温度参考各引物的T_m值。PCR产物的纯化与转化参照实施例2中大引物的纯化与转化。

2、羰基还原酶与葡萄糖偶联反应体系的建立

羰基还原酶在进行反应时，依赖辅酶作为氢传递体，然而辅酶的价格昂贵又不能保持良好的稳定性，故采用酶偶联法构建辅酶循环体系。利用葡萄糖脱氢酶EsGDH，以价格低廉的葡萄糖为辅底物，构建辅酶循环系统。

(1)葡萄糖脱氢酶EsGDH基因工程菌湿菌体的制备：1)工程菌构建：将NCBI数据库中来自微小杆菌(Exiguobacterium sibirium)DSM 17290的葡萄糖脱氢酶EsGDH基因(GenBank NO.KM817194.1，氨基酸序列如SEQ ID NO.5，核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)制得E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh。2)湿菌体的制备：将E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-esgdh接种到终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将种子液以2.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6)，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含葡萄糖脱氢酶的湿菌体。

(2)羰基还原酶突变体基因工程菌湿菌体的制备：1)工程菌的构建：将步骤1定点饱和突变获得的羰基还原酶KmCR突变体基因插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coli BL21(DE3)，制得羰基还原酶突变体基因工程菌。2)湿菌体的制备：将羰基还原酶突变体基因工程菌接种到终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养12h，获得种子液；将种子液以2.0％(v/v)的接种量接种到新鲜的含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养2h(OD₆₀₀＝0.6)，培养液中加入终浓度为0.15mM异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside，IPTG)，28℃培养12h后，4℃、8000rpm离心10min，获得含羰基还原酶突变体的湿菌体。

(3)野生型羰基还原酶基因工程菌湿菌体的制备：1)工程菌的构建：将实施例1所述的野生型羰基还原酶KmCR基因(GenBank NO.AB183149.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)插入到pET28a(+)的Nco I、Xho I位点，构建重组表达载体，并将此表达载体转入E.coliBL21(DE3)，制得E coli BL21(DE3)/pET28b(+)-kmcr。2)湿菌体的制备同步骤(2)含羰基还原酶突变体的湿菌体的制备。

(4)偶联反应体系的建立：5mL反应体系：以5mL pH 7.0的100mM磷酸钾缓冲液为反应介质，混合菌体加入终浓度为4.5g DCW·L^-1(含羰基还原酶突变体的湿菌体与含葡萄糖脱氢酶的湿菌体质量比为5:1，w/w)，6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯终加入浓度为10g·L^-1，葡萄糖加入终浓度为15g·L^-1。35℃、600rpm下反应15min，加入1mL乙醇终止反应。12000rpm离心4min，上清用0.22μm有机膜过滤，滤液利用实施例2所述高效液相色谱检测条件进行检测，结果见表5。同样条件下，以羰基还原酶基因工程菌湿菌体替换羰基还原酶突变体基因工程菌湿菌体作为对照。

3、定点饱和突变文库的筛选

表5表明，对“催化四联体”的四个位点进行定点饱和突变，A100位点具有良好的突变效果，除完全S-选择性且催化活力有所提升的KmCR-A100T之外，还获得完全S-选择性的KmCR-A100S(氨基酸序列如SEQ ID NO.3，核苷酸序列如SEQ ID NO.4)，活力相较于野生型KmCR-WT提高了0.8倍，这是目前为止获得的活力最高的突变体。

从A100位点的饱和突变结果来看，非极性的丙氨酸突变为极性不带电的丝氨酸后活力最高，且立体选择性达到光学纯的要求，除丝氨酸外，极性不带电的苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)活力也比野生型KmCR-WT高。由此可见，100位点偏好极性不带电类型的氨基酸。分析酶表面静电势能，选取100位点附近的氨基酸进行比较，共计筛选17个氨基酸，将突变前后静电势能变化较大的氨基酸标记出来。定义静电势能在-500～-375kJ/mol区间显示为深红，-375～-250kJ/mol区间显示为浅红，-250～-125kJ/mol区间显示为浅蓝，-125～0kJ/mol区间显示为亮蓝。除位于α1螺旋的突变位点100变化较大之外，与其相邻的Loop A环上的A82和α2螺旋上的S168、K169也发生了较大的变化，而K169在催化机理中与辅酶形成氢键，起着稳定辅酶的作用。突变使得K169表面的静电势能变大，从而更好得稳定辅酶，并进一步增强了酶对底物的催化活性。

表5催化活性位点的改造

注：a*表示S127位点的其余未检测到活力的突变体，A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、V、W、Y；b*表示K169位点的其余未检测到活力的突变体，C、D、E、F、G、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W；c*表示Y165位点的部分未检测到活力的突变体，C、F、G、H、I、N、P、R、S、W。

实施例4：羰基还原酶及其突变体酶活的测定

1、野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S纯酶液的制备

(1)湿菌体

采用实施例3方法构建羰基还原酶突变体KmCR-A100S基因工程菌，将羰基还原酶突变体KmCR-A100S基因工程菌按实施例3所述方式获得含羰基还原酶突变体KmCR-A100S的湿菌体。

(2)粗酶液

将湿菌体以20g/L的量用pH 7.0、100mM PB缓冲液重悬，置于冰上超声破碎10min。超声破碎条件：功率设定为400W，破碎1s，暂停5s。并在4℃下，以12000rpm离心15min，上清用0.22μm的滤膜过滤，滤液即为粗酶液(图5中A)。

(3)纯酶液

结合液(Binding Buffer)：称取3.1g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)和17.5g的氯化钠(终浓度为300mM)置于1L的烧杯中，加入超纯水充分溶解并定容到1L，用磷酸或氢氧化钠调节pH至7.0。

洗涤液(Washing Buffer)：称取3.1g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)、17.5g的氯化钠(终浓度为300mM)和3.4g的咪唑(终浓度为50mM)置于1L的烧杯中，加入超纯水充分溶解并定容到1L，按照同样方式调节pH至7.0。

洗脱液(Elution Buffer)：称取3.1g的二水合磷酸二氢钠(终浓度为20mM)、17.5g的氯化钠(终浓度为300mM)和34.0g的咪唑(终浓度为500mM)置于1L的烧杯中，加入超纯水充分溶解并定容到1L，按照同样方式调节pH至7.0。

所述纯酶按如下方式获得：

用结合液冲洗镍柱(1.6×10cm，Bio-Rad公司，美国)，流速为0.4mL/min，直到UV基线平衡；用结合液将基线冲平后，将10mL步骤(2)的粗酶液以0.2mL/min的流速上样，使目的蛋白和镍柱充分结合；用洗涤液冲洗杂蛋白，流速为0.3mL/min，将杂蛋白冲洗干净，直到UV基线平衡；用洗脱液洗脱目的蛋白，流速为0.25mL/min，当UV达到200mAU时开始收集，当UV再次降至200mAU时停止收集，获得目的蛋白洗脱液；继续用洗脱液冲洗，流速调为0.3mL/min，直至基线走平；将洗脱液换为结合液继续冲洗平衡镍柱，流速调为0.35mL/min，直至基线走平；用10倍柱体积的体积浓度20％乙醇水溶液保存镍柱并保存于4℃冰箱中。将收集的目的蛋白洗脱液置于20mM的pH 7.0磷酸钾缓冲液中透析(MD34，Viskase，美国)过夜，截留液即为羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(图5中B)。

同样条件下，制备野生型羰基还原酶KmCR-WT纯酶液。

2、采用BCA试剂盒测定纯酶液的蛋白浓度，具体实施步骤如下：

表6蛋白标准溶液配制

(1)工作液的配制：BCA试剂盒(KGPBCA，购自凯基生物)中工作液A液与工作液B液按50:1(v/v)的比例进行配制，充分混合，作为工作液，现配现用。(2)取洁净的酶标板，加入上述蛋白标准溶液和去离子水，总体积20μL，再加入200μL工作液，在振荡器上震荡30s，37℃保温30min后，在562nm下测定吸光度，纵坐标为蛋白紫外吸光值，横坐标为对应的蛋白含量，绘制标准曲线(图6)。(3)将样品用去离子水稀释20倍，取样20μL加至酶标板中，同时加入200μL的工作液，以同样方式测定吸光度，将测得的吸光值带入标准曲线，计算获得野生型羰基还原酶KmCR-WT纯酶液的蛋白浓度为5.3g/L，羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液的蛋白浓度为4.9g/L。

3、酶活检测条件：300μL反应体系：10mM底物(表11中底物1a，即6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯)，1mM NADPH，100μL纯酶液(步骤1制备的KmCR-WT纯酶液及KmCR-A100S纯酶液)，35℃下、600rpm反应5min，取反应液在340nm下检测吸光值，根据NADPH标准曲线(图7)获得反应液中NADPH含量。

酶活定义为在标准条件下，每分钟消耗1μmol的NADPH所需的酶量定义为一个酶活单位U。比酶活定义为每毫克蛋白所具有的酶活单位数，记作U·mg^-1。

相对酶活：相同条件下野生型羰基还原酶KmCR-WT纯酶液对底物的活力设为100％，突变体酶相对于野生型酶活为相对酶活。野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力可达到36.8U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的催化活力可达到66.5U/mg。结果见表11。

实施例5：羰基还原酶及其突变体动力学参数的测定

检测野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S的动力学参数。

1、KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S对底物A6的动力学参数

在1mL离心管中，分别以不同浓度的6-氰基-(5R)-3-羰基己酸叔丁酯(0.5mM、1mM、2mM、4mM、6mM、10mM)为底物，添加终浓度为5mM的NADPH和100μL实施例4方法制备的纯酶液(野生型羰基还原酶KmCR-WT纯酶液、羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液)构成转化反应体系0.5mL，在35℃、600rpm下反应10min，加入1～2μL 6M HCl终止反应，利用实施例2所述高效液相色谱进行检测。

利用Origin 9.1拟合Michaelis-Menten函数非线性曲线，获得米式常数K_m和最大反应速率v_max。结果见表7所示。

表7野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S对底物的动力学参数

2、KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S对NADPH的动力学参数

同步骤1，分别以不同浓度的NADPH(0.1mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM)在同等条件下进行反应，底物浓度为5mM。其他同步骤1，结果见表8所示。

表8羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S对NADPH的动力学参数

由表7和表8可知，突变体对底物A6和NADPH的K_m值分别为0.54mM和0.14mM，相较于野生型的0.62mM和0.19mM均有所下降，说明其对底物的亲和力有所提升，导致催化效率k_cat/K_m增大。

实施例6：野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S热稳定性的表征

野生型羰基还原酶KmCR-WT和突变体KmCR-A100S的热稳定性主要通过解链温度T_m、半失活温度半衰期t_1/2来进行考察。

1、解链温度T_m

将实施例4方法制备的纯酶液500μL用pH 7.0、20mM的磷酸钾释至终浓度(0.15mg·mL^-1)，作为样品。将样品置于10mm石英管中，利用圆二色性(CD)光谱仪对酶进行圆二色谱分析，温度变化控制在10～90℃，紫外光谱设定范围为180～260nm。根据公式α＝(θ_t-θ_U)/(θ_F-θ_U)计算在222nm波长下的圆二色谱数值α，并利用Origin 9.1非线性曲线拟合获得T_m。其中，θ_t对应任意温度下的椭圆率，θ_F对应完全折叠形式的椭圆率，θ_U对应非折叠形式的椭圆率。

2、半失活温度

检测野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S的半失活温度将实施例4方法制备的纯酶液分别取100μL在20℃、35℃、39℃、43℃、47℃、51℃、55℃、59℃下、保温15min后立即放置冰上。35℃，600rpm下反应10min，加入1～2μL 6M HCl终止反应，按照实施例2中的高效液相色谱检测条件测定残余酶活。将最适温度下保温的酶活记为初始酶活100％。利用Origin 9.1非线性曲线拟合获得

3、半衰期t_1/2

检测野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S的半衰期t_1/2，将实施例4方法制备的纯酶液分别取1mL分别在35℃、40℃、45℃下持续保温，每隔3h间隔取出部分酶样品。35℃、600rpm下反应10min，加入1～2μL HCl(6M)终止反应，用实施例2所述HPLC检测分析，测定残余酶活。利用Origin 9.1拟合Boltzmann函数非线性曲线。t_1/2定义为酶残留活性下降至原始活性50％所需的时间。

表9野生型羰基还原酶KmCR-WT及其突变体KmCR-A100S的半失活常数及解链温度

表10野生型羰基还原酶及其突变体A100S的半衰期及失活常数

由表9与表10可知野生型与突变体的半失活温度分别为55.4℃和53.8℃；解链温度分别为59.9℃和58.4℃。在35℃时，野生型与突变体的半衰期分别为19.6h和18.2h，当温度增加至45℃时，其半衰期下降至不足35℃时的一半。与野生型相比，突变体的热稳定性仅有轻微程度的下降。

实施例7：野生型羰基还原酶及其突变体KmCR-A100S催化还原4-氯乙酰乙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物4-氯乙酰乙酸乙酯(表11中2a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4方法计算羰基还原酶突变体对4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到6.2U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物4-氯乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到18.5U/mg，结果示于表11。

实施例8：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原乙酰乙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物乙酰乙酸乙酯(表11中3a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4方法计算羰基还原酶突变体对乙酰乙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到29.5U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到35.1U/mg。结果示于表11。

实施例9：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯(表11中4a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4方法计算羰基还原酶突变体对4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到23.1U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物4,4,4-三氟乙酰乙酸乙酯的催化活力可达到28.4U/mg。结果示于表11。

实施例10：羰基还原酶及其突变体催化还原乙酰乙酸叔丁酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物乙酰乙酸叔丁酯(表11中5a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4所述方法计算羰基还原酶突变体对乙酰乙酸叔丁酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物乙酰乙酸叔丁酯的催化活力可达到9.2U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物乙酰乙酸叔丁酯的催化活力可达到12.7U/mg。结果示于表11。

实施例11：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原乙酰丙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物乙酰丙酸乙酯(表11中6a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4所述方法计算羰基还原酶突变体对乙酰丙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物乙酰丙酸乙酯的催化活力可达到6.6U/mg，突变体KmCR-A100S对底物乙酰丙酸乙酯的催化活力可达到11.1U/mg。结果示于表11。

实施例12：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原异丁酰乙酸甲酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物丁酰乙酸甲酯(表11中7a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，根据实施例4所述方法计算羰基还原酶突变体对丁酰乙酸甲酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物异丁酰乙酸甲酯的催化活力可达到152.6U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物异丁酰乙酸甲酯的催化活力可达到153.1U/mg。这是目前文献报道的生物酶法催化该底物的最高水平，结果示于表11。

实施例13：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原异丁酰乙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物异丁酰乙酸乙酯(表11中8a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4所述方法计算羰基还原酶突变体对异丁酰乙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物异丁酰乙酸乙酯的催化活力可达到3.2U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物异丁酰乙酸乙酯的催化活力可达到6.2U/mg。结果示于表11。

实施例14：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原4-氯-乙酰乙酸甲酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物4-氯-乙酰乙酸甲酯(表11中9a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4方法计算羰基还原酶突变体对4-氯-乙酰乙酸甲酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物4-氯乙酰乙酸甲酯的催化活力可达到37.6U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物4-氯乙酰乙酸甲酯的催化活力可达到40.7U/mg。结果示于表11。

实施例15：野生型羰基还原酶及其突变体催化还原丁酰乙酸乙酯

在300μL pH 7.0、100mM磷酸钾缓冲液中，加入终浓度为1mM的NADPH、终浓度为10mM的底物丁酰乙酸乙酯(表11中10a)，100μL实施例4方法制备的羰基还原酶突变体KmCR-A100S纯酶液(蛋白浓度为4.9g/L)构成反应体系。在35℃、600rpm下反应5min，取样通过酶标仪在340nm下检测吸光值，同实施例4所述方法计算羰基还原酶突变体对丁酰乙酸乙酯的催化活力。同样条件下，检测实施例4方法制备的野生型羰基还原酶KmCR-WT(蛋白浓度为5.3g/L)的催化活力。

该条件下，野生型羰基还原酶KmCR-WT对底物丁酰乙酸乙酯的催化活力可达到39.4U/mg，羰基还原酶突变体KmCR-A100S对底物丁酰乙酸乙酯的催化活力可达到55.5U/mg。这是目前文献报道的生物酶法催化该底物的最高酶活，结果示于表11。

表11野生型羰基还原酶及其突变体A100S对不同底物的活性

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 羰基还原酶突变体及其不对称合成双手性化合物的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 345

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces. marxianus)

<400> 1

Met Thr Phe Thr Val Val Thr Gly Ala Asn Gly Tyr Ile Ala Lys His

1 5 10 15

Ile Leu Lys Ser Leu Leu Glu Asp Gly His Arg Val Ile Gly Thr Val

20 25 30

Arg Asn Ser Lys Lys Ala Glu Glu Leu Lys Arg Thr Val Asn Asp Glu

35 40 45

Asn Leu Ile Val Glu Leu Val Pro Asp Met Leu Val Glu Asn Ala Phe

50 55 60

Asp Glu Leu Phe Lys Lys Tyr Asn Thr Gln Ile Lys Tyr Val Phe His

65 70 75 80

Thr Ala Ser Pro Val Leu Glu Thr Ser Lys Asp Tyr Glu Lys Ser Leu

85 90 95

Ile Glu Pro Ala Ile Thr Gly Ala Lys Ser Met Val Glu Ala Ile Arg

100 105 110

Lys Tyr Ser Leu Thr Ser Val Glu His Ile Val Tyr Thr Ser Ser Ile

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Glu Phe Thr Asp Pro Thr Leu Val Val

130 135 140

Ser Glu Asp Ser Trp Asn Pro Gln Gly Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu

145 150 155 160

Phe Phe Thr Ala Tyr Ser Tyr Ser Lys Lys Ile Ala Glu Lys Thr Met

165 170 175

Trp Asp Phe Val Glu Glu Tyr Lys Gly Thr Glu His Glu Ile Lys Leu

180 185 190

Thr Thr Val Asn Pro Cys Phe Asn Ile Gly Pro Gln Ala Tyr Glu Ala

195 200 205

Asp Val Thr Glu Thr Met Asn Phe Thr Ala Glu Leu Ile Asn His Val

210 215 220

Val Lys Ser Lys Val Gly Asp Pro Leu Pro Pro Thr Arg Ile Val Pro

225 230 235 240

Tyr Val Asp Val Arg Asp Thr Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Lys

245 250 255

Asn Glu Lys Leu Ala Phe Gln Arg Leu Leu Val Val Gly Pro Phe Leu

260 265 270

Ser Ser Gln Gln Ile Tyr Asp Ile Val Asn Glu Arg Phe Pro Gln Leu

275 280 285

Arg Gly Lys Ile Ala Arg Gly Glu Pro Gly Ser Asp Lys Leu Asp Pro

290 295 300

Ala Lys Leu Ala Lys Phe Asp His Ala Arg Thr Thr Gln Ala Leu Gly

305 310 315 320

Trp Glu Phe Thr Pro Ile Glu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Val Ala Gln

325 330 335

Ile Leu Arg Val Gly Ala Tyr Arg Gly

340 345

<210> 2

<211> 1038

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces. marxianus)

<400> 2

atgacattta cagtggtgac aggcgcaaat ggctacattg ccaagcacat tcttaaatcg 60

ttattagaag atggtcatcg cgtaattggg accgtgagaa acagcaagaa ggccgaggaa 120

ttgaaaagga ctgtcaatga tgagaatttg atagtggagt tggttcccga catgttagtg 180

gaaaacgcat ttgacgagtt gttcaagaag tacaacaccc aaatcaagta tgtgttccac 240

actgcgtccc cggttctcga gacgtcaaag gactatgaga aaagcttgat cgagcccgcg 300

attaccggtg cgaagtcaat ggtggaagct atcaggaagt actcattgac atcggtcgag 360

cacattgtgt atacgtcatc gattgctgcc agctcgctgg aatctgagtt taccgatcca 420

acgctcgttg tcagcgagga tagttggaac ccacaaggtt tggaagaggc aaagacggag 480

tttttcaccg cttactcgta ctcgaagaaa atcgccgaga agacgatgtg ggattttgtt 540

gaggaataca aggggactga gcacgaaata aagctcacta cggtcaaccc atgcttcaac 600

attgggcccc aggcgtacga ggcggacgtt accgagacta tgaacttcac ggcggagttg 660

atcaaccacg ttgtgaaaag caaagtgggc gatccgcttc ctccaacgag aattgtgcca 720

tacgtcgatg tcagggacac tgcgagagcg catgtcgatg cgttgaagaa cgagaagctg 780

gcattccaaa gactgttggt ggtggggccc tttttgtcga gccagcagat ctacgatatt 840

gtgaacgagc gcttcccgca attgcggggc aagatcgcgc ggggcgagcc tggcagcgac 900

aagctggacc ctgcgaagct ggccaagttc gaccacgccc ggaccacgca agctctcggg 960

tgggagttca cgcctatcga gaaggctata gctgacgagg tggcccagat cctccgtgtg 1020

ggcgcgtacc gtgggtaa 1038

<210> 3

<211> 345

<212> PRT

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces. marxianus)

<400> 3

Met Thr Phe Thr Val Val Thr Gly Ala Asn Gly Tyr Ile Ala Lys His

1 5 10 15

Ile Leu Lys Ser Leu Leu Glu Asp Gly His Arg Val Ile Gly Thr Val

20 25 30

Arg Asn Ser Lys Lys Ala Glu Glu Leu Lys Arg Thr Val Asn Asp Glu

35 40 45

Asn Leu Ile Val Glu Leu Val Pro Asp Met Leu Val Glu Asn Ala Phe

50 55 60

Asp Glu Leu Phe Lys Lys Tyr Asn Thr Gln Ile Lys Tyr Val Phe His

65 70 75 80

Thr Ala Ser Pro Val Leu Glu Thr Ser Lys Asp Tyr Glu Lys Ser Leu

85 90 95

Ile Glu Pro Ser Ile Thr Gly Ala Lys Ser Met Val Glu Ala Ile Arg

100 105 110

Lys Tyr Ser Leu Thr Ser Val Glu His Ile Val Tyr Thr Ser Ser Ile

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Leu Glu Ser Glu Phe Thr Asp Pro Thr Leu Val Val

130 135 140

Ser Glu Asp Ser Trp Asn Pro Gln Gly Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu

145 150 155 160

Phe Phe Thr Ala Tyr Ser Tyr Ser Lys Lys Ile Ala Glu Lys Thr Met

165 170 175

Trp Asp Phe Val Glu Glu Tyr Lys Gly Thr Glu His Glu Ile Lys Leu

180 185 190

Thr Thr Val Asn Pro Cys Phe Asn Ile Gly Pro Gln Ala Tyr Glu Ala

195 200 205

Asp Val Thr Glu Thr Met Asn Phe Thr Ala Glu Leu Ile Asn His Val

210 215 220

Val Lys Ser Lys Val Gly Asp Pro Leu Pro Pro Thr Arg Ile Val Pro

225 230 235 240

Tyr Val Asp Val Arg Asp Thr Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Lys

245 250 255

Asn Glu Lys Leu Ala Phe Gln Arg Leu Leu Val Val Gly Pro Phe Leu

260 265 270

Ser Ser Gln Gln Ile Tyr Asp Ile Val Asn Glu Arg Phe Pro Gln Leu

275 280 285

Arg Gly Lys Ile Ala Arg Gly Glu Pro Gly Ser Asp Lys Leu Asp Pro

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305 310 315 320

Trp Glu Phe Thr Pro Ile Glu Lys Ala Ile Ala Asp Glu Val Ala Gln

325 330 335

Ile Leu Arg Val Gly Ala Tyr Arg Gly

340 345

<210> 4

<211> 1038

<212> DNA

<213> 马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces. marxianus)

<400> 4

atgacattta cagtggtgac aggcgcaaat ggctacattg ccaagcacat tcttaaatcg 60

ttattagaag atggtcatcg cgtaattggg accgtgagaa acagcaagaa ggccgaggaa 120

ttgaaaagga ctgtcaatga tgagaatttg atagtggagt tggttcccga catgttagtg 180

gaaaacgcat ttgacgagtt gttcaagaag tacaacaccc aaatcaagta tgtgttccac 240

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