具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、盐螺旋菌JH的分离、鉴定和保藏

一、分离

取碱湖样品50μL，加入碱湖滤液450μL，吹打混匀得到10^-1浓度样品，依次稀释得到10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5浓度的样品。取碱湖水样原液20μL、40μL及稀释得到的样品，分别涂布到YMAH、TSAH、LBH、2216EH等固体培养基中，在35℃恒温培养箱中培养3-4d后，观察生长情况。挑取颜色不同、形态差异的菌落，通过三区划线法进行纯化和培养，重复划线纯化过程3-4次后，得到纯种的菌落。

二、鉴定

将纯化后的菌株于LBH固体培养基中进行三区划线，35℃培养2d，使用透射电子显微镜观察细胞的形态、大小、有无鞭毛等特征。挑取LBH固体平板上的单菌落按照标准方法进行革兰氏染色处理，使用倒置荧光显微镜观察细菌的革兰氏染色情况。采用穿刺法将菌株置入半固体培养基中进行接种，然后放入37℃的培养箱中培养2d，观察菌株的运动性和好氧性情况。

配制不同浓度NaCl(0％、1.0％、3.0％、5.0％和10.0％(w/v))的LBH液体培养基，接种后置于35℃的摇床中振荡培养7d，每隔24h取一次样，使用UV-2450分光光度计在OD₆₀₀处检测细菌的生长情况，以确定菌株的最适盐度以及盐度生长范围；对于菌株pH值的测定，需配制不同pH值(7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、11.5、12.0) 的液体LBH培养基。接种后，置于37℃摇床中培振荡培养7d，每隔24h取一次样，以培养条件相同的不接菌培养基作为空白对照，以确定最佳生长pH范围；分别设置温度梯度为4℃、10℃、25℃、28℃、30℃、37℃、40℃、45℃和50℃，以确定菌株的最佳生长温度范围。

利用Biolog GEN III鉴定板检测菌株对不同碳源的利用情况。

使用API 20NE和API 32GN试剂盒对菌株进行鉴定，如硝酸盐还原试验、亚硝酸盐还原试验、酶活特性及碳源利用试验等。菌株Salinispirillum sp.JH和参考菌株Salinispirillum marinum GCWy1^T的结果见表1。

表1

利用基因组提取试剂盒提取菌株的基因组DNA，并利用PCR技术扩增菌株的16SrDNA序列。本实验采用的PCR体系为：4μL模板DNA、1μL引物27F、1μL引物1492R、5μL 10×TaqBuffer、4μL dNTP、0.8μL Taq DNA聚合酶、34.2μL灭菌超纯水。利用琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行验证，若条带大小符合预期实验结果，则将PCR扩增产物送商业测序。如果测序结果正确，则对PCR扩增产物进行切胶回收，并利用pClone007 Simple Vector Kit克隆试剂盒克隆目的条带，再将克隆后的目的基因与质粒pMD18-T连接，最后将重组质粒转入大肠杆菌E.coli DH5α中，转化过程严格按照感受态细胞E.coli DH5α的使用操作说明进行。将测得的16S rDNA序列结果上传至https://www.ezbiocloud.net/网站进行序列对比分析，确定分离细菌的种属，并下载与菌株亲缘性较高的细菌的16S rDNA序列。通过选择合适的外群，并基于分离菌株及其相关菌株的16S rDNA基因序列，使用MEGA 7.0软件构建菌株的系统发育树。使用近邻连接法(NJ)进行细菌的系统发育分析。基于1000次重复，使用Bootstrap分析确定系统发生树的拓扑结构。见图2。

以上鉴定结果表明，菌株JH属于糖螺旋菌科(Saccharospirillaceae)，盐螺旋菌属 (Salinispirillum)。

三、保藏

盐螺旋菌JH(Salinispirillum sp.JH)已于2020年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国，武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO:M 2020375。

实施例2、D-乳酸脱氢酶(SaDLD蛋白)的制备

经过大量序列分析、比对和功能验证，从盐螺旋菌JH中发现一个新蛋白，将其命名为 SaDLD蛋白，如序列表的序列1所示。将盐螺旋菌JH中编码SaDLD蛋白的基因命名为SaDLD基因，其编码框如序列表的序列2所示。

一、构建重组质粒

1、以盐螺旋菌JH的基因组DNA为模板，采用DL-F和DL-R组成的引物对进行PCR 扩增，回收PCR扩增产物。

DL-F：5’-GGAATTCATGAAAATCGCCGTCT-3’；

DL-R：5’-CCCAAGCTTTTATATCTTAACGACGTGA-3’。

2、取步骤1得到的PCR扩增产物，与pET-28a载体连接，得到重组质粒pET-28a-SaDLD。

pET-28a载体(pET-28a Vector)：Novagen，产品目录号69864-3。

经测序，重组质粒pET-28a-SaDLD中具有序列表的序列2所示的DNA分子。

二、制备重组菌

将重组质粒pET-28a-SaDLD导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌甲。

将pET-28a载体导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌乙。

三、表达蛋白

1、将重组菌接种至含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基，37℃、150rpm振荡培养12h，得到种子液。

2、将1体积份种子液接种至99体积份含50μg/mL卡那霉素的液体LB培养基中，37℃、 200rpm振荡培养至OD_600nm值约为0.6，此时加入IPTG诱导剂并使其在体系中的浓度为0.5 mmol/L，然后25℃、200rpm振荡培养6h(诱导表达)，然后4℃、8000×g离心10min，收集菌体沉淀。

3、取步骤2得到的菌体沉淀，用20mL磷酸钠缓冲液洗涤2-3次，再用10mL缓冲液悬浮菌体，然后在冰浴条件下进行超声破碎，破碎条件为：超声破碎3s，间隔3s，破碎时间20min，功率300W。超声破碎结束后，将样品在4℃、10000×g条件下离心10min，收集上清。

重组菌甲进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液甲。

重组菌乙进行上述步骤得到的上清液，命名为粗酶液乙。

四、纯化蛋白

取步骤三得到的粗酶液甲，用孔径为0.22μm的微滤滤膜过滤，收集滤液。取滤液，采用Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱进行分离纯化。将Superdex^TM 200 10/60凝胶层析柱连接到快速蛋白液相系统，以1×PBS缓冲液(pH 8.0)作为流动相，流速为0.05mL/min。收集保留体积为18-20mL对应洗脱峰的过柱后溶液，即为SaDLD蛋白溶液。SaDLD蛋白溶液的电泳图见图3，仅一条蛋白带，且符合预估分子量(约36.6kDa)。

实施例3、D-乳酸脱氢酶(SaDLD蛋白)的酶学性质

PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)：称取2.88g磷酸二氢钠，0.48g磷酸二氢钾，0.40g氯化钾，16.00g氯化钠，溶于800mL超纯水中，用HCl调节pH至6.0，定容至1L。

丙氨酸钠反应液(20mM)：称取2.2g丙氨酸钠，采用PBS缓冲液溶解，并定容至1L。

NADH溶液(10mM)：称取6.6343g NADH，采用PBS缓冲液溶解，并定容至1L。

一、pH对D-乳酸脱氢酶活性的影响

1、最适pH

取实施例2制备的SaDLD蛋白溶液，用PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)稀释至 2倍体积，将稀释液作为供试液。

检测方法：加入供试液10μL、丙酮酸钠溶液10μL(20mM)、NADH溶液10μL (10mM)、PBS缓冲溶液170μL(100mM，pH 6.0)，30℃反应5min，连续记录340 nm处的吸光度。一个活性单位被定义为在30℃和pH 6.0的情况，每分钟催化1mol NADH氧化需要的酶量。

分别采用如下缓冲液：pH 3.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 4.0的柠檬酸盐缓冲液、pH5.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的柠檬酸盐缓冲液、pH 6.0的磷酸盐缓冲液、pH 7.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的磷酸盐缓冲液、pH 8.0的碳酸盐缓冲液、pH 9.0的碳酸盐缓冲液、pH10.0的碳酸盐缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的配方见表2。磷酸盐缓冲液的配方见表3。碳酸盐缓冲液的配方见表4。

表2

表3

表4

SaDLD蛋白的最适pH为6。将采用最适pH对应的酶活数值作为100％，计算采用各种缓冲液时的相对值，作为相对酶活。结果见图4。

二、温度对D-乳酸脱氢酶活性的影响

1、最适反应温度

取实施例2制备的SaDLD蛋白溶液，用PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)稀释至 2倍体积，然后作为供试液。

检测方法：加入供试液10μL、丙酮酸钠溶液10μL(20mM)、NADH溶液10μL (10mM)、PBS缓冲溶液170μL(100mM，pH 6.0)，30℃反应5min，连续记录340 nm处的吸光度。一个活性单位被定义为在30℃和pH 6.0的情况，每分钟催化1mol NADH氧化需要的酶量。

最适反应温度为40℃。将采用最适反应温度时的酶活数值作为100％，计算采用各种反应温度时的相对值，作为相对酶活。结果见图5。

三、金属离子对D-乳酸脱氢酶活性的影响

取实施例2制备的SaDLD蛋白溶液，用PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)稀释至 2倍体积，然后作为供试液。

检测方法：加入供试液10μL、丙酮酸钠溶液10μL(20mM)、NADH溶液10μL (10mM)、PBS缓冲溶液170μL(100mM，pH 6.0)，30℃反应5min，连续记录340 nm处的吸光度。一个活性单位被定义为在30℃和pH 6.0的情况，每分钟催化1mol NADH氧化需要的酶量。

以不加入金属离子时的酶活作为100％，分别计算加入各种金属离子后的相对酶活。金属离子的测试浓度为5mM，实验结果见表5。

表5

四、酶活力的测定

酶活(1U)定义为：在30℃和pH 6.0的情况，每分钟催化1mol NADH氧化需要的酶量。

检测方法：加入供试液10μL、丙酮酸钠溶液10μL(20mM)、NADH溶液10μL (10mM)、PBS缓冲溶液170μL(100mM，pH 6.0)，30℃反应5min，连续记录340 nm处的吸光度。

采用实施例2制备的粗酶液甲作为供试液，酶活为568U/mL。

采用实施例2制备的粗酶液乙作为供试液，酶活为0U/mL。

采用实施例2制备的SaDLD蛋白溶液作为供试液，检测单位体积供试液的酶活。检测实施例2制备的SaDLD蛋白溶液中的蛋白浓度。将单位体积供试液的酶活除以单位体积供试液的蛋白含量，得到蛋白比活力，数值为973U/mg。

实施例4、D-乳酸脱氢酶(SaDLD蛋白)用于制备苯乳酸

1、实验过程

(1)取实施例2制备的SaDLD蛋白溶液，用PBS缓冲液(100mM，pH 6.0)稀释至400U/mL，然后作为供试液；

(2)反应物总体积为100mL，含有150mM的苯丙酮酸、200mM NADH、400 U/mL的SaDLD蛋白溶液，采用PBS缓冲液(100mM、pH 6.0)，反应温度为40℃，搅拌速率为150rpm，反应时间为12h。

(3)反应混合物在ZorbaxSB-C18(4.6mm×150mm)柱中分析，柱温为20℃，流速为1.0mL/min，甲醇/0.05％三氟乙酸：水/0.05％三氟乙酸＝10：90作为流动相，进样为5μL，紫外检测保持在210nm。

2、D-乳酸脱氢酶(SaDLD蛋白)用于制备苯乳酸

反应结束后，经HPLC分析得知，苯丙酮酸的转化率为95.7％，这说明该酶在苯乳酸的制备方面具有较大的应用潜力。

序列表

<110> 中国石油大学（华东）

<120> 乳酸脱氢酶SaDLD及其编码基因和应用

<130> 2021.6.8

<141> 2021-06-16

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)

<400> 1

Met Lys Ile Ala Val Phe Ser Ala Lys Pro Tyr Asp Glu Gln His Leu

1 5 10 15

Asn His Phe Asn Glu Val Gly His Thr Leu Thr Phe Phe Glu Pro His

20 25 30

Leu Asn His Lys Thr Ala Ala Leu Ala Ala Asp His Asp Val Val Cys

35 40 45

Cys Phe Val Asn Asp Thr Leu Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ile Leu Ala

50 55 60

Ser Leu Lys Ile Arg Met Ile Ala Met Arg Cys Ala Gly Phe Asn Asn

65 70 75 80

Val Asp Leu Val Ala Ala Glu Gln Tyr Gly Ile Pro Val Ala Arg Val

85 90 95

Pro Glu Tyr Ser Pro His Ala Val Ala Glu His Ala Val Ala Leu Ile

100 105 110

Leu Asp Leu Asn Arg Asn Ile His Arg Ala Phe Asn Arg Val Arg Glu

115 120 125

Asn Asp Tyr Ser Leu Asn Gly Leu Leu Gly Phe Asp Leu Tyr Arg Lys

130 135 140

Thr Val Gly Val Val Gly Thr Gly Lys Ile Gly Ala Thr Phe Ala Gly

145 150 155 160

Ile Met Gln Gly Phe Gly Cys Gln Val Ile Ala Tyr Asp Pro Phe Pro

165 170 175

Asn Pro Gln Val Gln Ala Met Asn Ile Asp Tyr Val Pro Leu Glu Glu

180 185 190

Leu Trp Arg Arg Ser Asp Val Ile Ser Leu His Cys Pro Leu Met Pro

195 200 205

Glu Thr His His Leu Val Asn Ala Asp Ser Ile Ala Ala Met Lys Arg

210 215 220

Gly Thr Met Leu Ile Asn Thr Ser Arg Gly Ala Leu Ile Asp Thr Arg

225 230 235 240

Ala Val Ile Ala Gly Leu Lys Ser Gly Gln Ile Gly Tyr Leu Gly Leu

245 250 255

Asp Val Tyr Glu Glu Glu Ala Asp Leu Phe Phe Glu Asp Phe Ser Asn

260 265 270

His Leu Leu Gln Asp Asp Val Phe Ala Arg Leu Leu Thr Phe Pro Asn

275 280 285

Val Ile Ile Thr Gly His Gln Ala Phe Phe Thr Arg Glu Ala Leu Asp

290 295 300

Ala Ile Ala Arg Thr Thr Met His Asn Ile Asn Ala Leu Ala Glu Gly

305 310 315 320

Glu Leu Ser Lys Ala His Val Val Lys Ile

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 盐螺旋菌(Salinispirillum sp.)

<400> 2

atgaaaatcg ccgtcttcag tgccaaacca tacgacgaac aacacctaaa ccacttcaat 60

gaggtcgggc acacgctgac cttttttgag ccacacctga accacaaaac agctgcactg 120

gcagctgatc atgacgtggt gtgctgtttc gtcaacgaca ccttggacgc ccccacgatc 180

gaaatattgg caagcctaaa gatccgcatg atagctatgc gttgcgctgg gtttaacaac 240

gttgacttgg tcgccgctga gcaatatggc attccggttg cgcgcgtccc tgagtattca 300

ccgcatgccg tagcagaaca cgctgttgcc ctgattcttg accttaatcg aaacatccac 360

cgcgcattca accgtgtacg agagaacgac tactcgctca atgggttgct gggctttgac 420

ctttatcgga aaaccgtggg cgtagtgggt accggtaaaa tcggtgcaac ctttgctggc 480

atcatgcagg ggttcgggtg ccaggtgatt gcgtacgatc ccttccccaa tcctcaggtt 540

caggccatga acattgacta cgtgccccta gaagaattgt ggcgccgctc ggatgttatt 600

tcactgcact gccctctgat gcccgagacc catcacctcg tcaatgcaga ctccattgcg 660

gccatgaaac gaggcactat gctgatcaac accagtcgcg gggctctgat cgacacccgt 720

gccgttatcg caggtttgaa aagtggtcag ataggctatt taggactaga cgtgtatgag 780

gaagaggccg atttattttt tgaggacttc tccaaccatt tactacaaga cgatgtattc 840

gcccgtctgt tgacgttccc caacgtcatc attactggcc accaagcatt ttttacccgc 900

gaggctttag atgccatcgc acgtacgaca atgcataaca tcaacgctct tgccgagggc 960

gagctatcga aagctcacgt cgttaagata taa 993

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggaattcatg aaaatcgccg tct 23

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

cccaagcttt atatcttaac gacgtga 27