芩苏散及其制剂的质量控制方法
阅读说明：本技术 芩苏散及其制剂的质量控制方法 (Quality control method of Qinqiu powder and its preparation ) 是由 黄广伟 孙仁弟 杨素德 马云飞 杨瑞花 张媛媛 保红云 韦悦 高志泓 张玥莉 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了芩苏散及其制剂的质量控制方法。具体地,本发明提供了一种中药有效部位的质量控制方法,其中,所述中药包括以下药材：黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参。本发明通过控制代表性活性成分在所述有效部位中的百分含量和/或利用指纹图谱的相似性来进行芩苏散及其制剂的质量控制,从而达到准确、全面的质量控制。(The invention provides quality control methods of Qinqiu powder and a preparation thereof. Specifically, the invention provides a quality control method of effective parts of a traditional Chinese medicine, wherein the traditional Chinese medicine comprises the following medicinal materials: scutellariae radix, fructus Perillae, caulis Perillae, radix Sophorae Flavescentis and Saviae Miltiorrhizae radix. The quality control of the Qinsu powder and the preparation thereof is carried out by controlling the percentage content of the representative active ingredients in the effective parts and/or utilizing the similarity of fingerprint spectrums, thereby achieving accurate and comprehensive quality control.)
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及芩苏散及其制剂的质量控制方法。
背景技术
由黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参、丹参五味中药组成的中药组方具有解热、镇痛、消炎等多种功效。方中黄芩为君药，紫苏(子、梗)、苦参为臣药，丹参为佐使药。将上述组方中的中药材经提取、分离纯化得到的提取物(芩苏散)具有杂质少、副作用低等优点，而且可方便进一步制备成各种便于服用的制剂(如芩苏胶囊)。
但中药提取物尤其是多种药材的中药提取物成分非常复杂，杂质干扰多，对其真伪鉴别、成分分析、药理研究和质量控制带来很大困难。且同种中药材的产地、生长年限、药用部位等不同都会对药品产生影响。
所以本领域急需提供一种能够准确、全面控制芩苏散及其制剂的质量控制方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、全面的芩苏散及其制剂质量控制方法。
本发明的目的是提供一种芩苏散及其制剂的指纹图谱构建方法及基于其的质量控制方法。
本发明的又一目的是提供一种包括多种合理配比的中药单体的活性成分的组合、药物组合物及它们的用途。
本发明第一方面，提供了一种中药有效部位的质量控制方法，
其中，所述中药包括以下药材：黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参；
所述方法包括步骤：
(a)测定所述中药有效部位中活性成分的重量百分含量，以所述中药有效部位的干重计，其中，所述活性成分包括下述A组：黄芩苷、丹酚酸B、迷迭香酸和苦参碱；
(b)根据步骤(a)中的测定结果，判定所述活性成分含量是否符合下述标准含量范围：
当各活性成分含量都符合相应的标准含量范围时为合格，否则为不合格。
在另一优选例中，所述质量控制方法还包括步骤：
(c)当步骤(b)中判定结果为不合格，且当中药有效部位中超出所述标准含量范围的相应活性成分的含量C1与相应的标准含量范围的最接近的端值C0符合|C1-C0|/C0≤10％时，调整所述中药有效部位的组成，使之合格。
在另一优选例中，所述“调整所述中药有效部位的组成”指对一个或多个所述药材或组分调整以下一个或多个参数：药材来源、药材用量、提取方法、活性成分，或其组合。
在另一优选例中，步骤(c)中，|C1-C0|/C0≤5％，更佳地≤3％、≤2％或≤1％。
在另一优选例中，步骤(b)中，还包括判定(A1)-(A4)四种成分含量之和是否符合下述标准含量范围：
(A1)-(A4)四种成分含量之和26-36wt％。
在另一优选例中，所述方法中还包括测定下述B组活性成分中的一个或多个，并判断其是否符合下列相应的标准含量范围：
在另一优选例中，所述方法中还包括测定下述C组活性成分中的一个或多个，并判断其是否符合下列相应的标准含量范围：
在另一优选例中，所述中药为黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参。
在另一优选例中，所述中药包括以下组分：
紫苏子为400-600重量份；
紫苏梗为400-600重量份；
苦参为600-800重量份；
黄芩为600-800重量份；和
丹参为1000-1400重量份。
在另一优选例中，所述中药有效部位为所述中药的提取物或所述提取物的制剂形式。
在另一优选例中，所述中药提取物为所述中药通过水和有机溶剂的混合溶剂提取获得。
在另一优选例中，所述混合溶剂中的有机溶剂选自下组：C1-C6低级醇醇、乙腈，或其组合。
在另一优选例中，所述中药提取物为将各药材分别提取后合并获得的或将各药材合并后再提取获得的。
在另一优选例中，，步骤(a)中，包括步骤：
(a1)对照品溶液的制备：精密称定各活性成分的对照品，溶剂稀释并定容，微孔滤膜过滤，得对照品混合溶液；
(a2)供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，溶剂稀释并定容，微孔滤膜过滤，得供试样品溶液；
(a3)将所述对照品溶液和供试样品溶液上样至高效液相色谱检测，
其中，所述高效液相色谱检测包括：
(a3-1)当检测的活性成分不为生物碱时，液相条件具有以下特征：
(i)色谱柱为十八烷基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈(A)和0.04-0.06wt％磷酸水溶液(B)；和
(iii)梯度洗脱；
(a3-2)当检测的活性成分为生物碱时，液相条件具有以下特征：
(i)色谱柱为氨基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈-无水乙醇-2.5-3.5wt％磷酸水溶液；
(iii)洗脱程序为等度洗脱；
(a4)根据步骤(a3)中所得色谱图，计算得到供试样品中各活性成分重量百分含量，以所述中药有效部位干重计。
在另一优选例中，步骤(a3-1)中，所述流动相为乙腈(A)和0.05wt％磷酸水溶液(B)。
在另一优选例中，步骤(a3-2)中，所述流动相为乙腈-无水乙醇-2.8-3.2wt％磷酸水溶液，较佳地，乙腈-无水乙醇-3wt％磷酸水溶液。
在另一优选例中，步骤(a3-1)中，所述梯度洗脱包括如下连续的过程，其中％为相对于总流量的体积百分比：
在另一优选例中，所述等度洗脱为乙腈：无水乙醇：磷酸水溶液体积比为：75-85:8-15:6-12；较佳地，75-85:8-12:6-10。
在另一优选例中，所述等度洗脱为乙腈：无水乙醇：3wt％磷酸水溶液体积比为81：11：8。
在另一优选例中，所述生物碱选自下组的一种或多种：苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和氧化槐定碱。
在另一优选例中，所述步骤(a1)中，所述对照品溶液包括5-10个具有梯度浓度的对照品溶液。
在步骤(a3-2)中，所述供试样品溶液的前处理方法包括如下步骤：
生物碱供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，使用浓氨水和二氯甲烷稀释，定容，得稀释液；精密量取所述稀释液，蒸干，得残渣，溶剂溶解残渣并定容，微孔滤膜过滤，得生物碱供试样品溶液
在另一优选例中，步骤(a4)中，使用外标法和/或外标一点法计算各活性成分的含量。
在另一优选例中，步骤(a4)中，各活性成分的峰面积以其最大紫外吸收波长确定。
在另一优选例中，步骤(a1)中，所述溶剂选自下组：C1-C6低级醇、乙腈、或它们与水的混合溶剂。
在另一优选例中，所述混合溶剂中水的体积为5-40％，较佳地，10-25％，以所述混合溶剂的总体积计。
在另一优选例中，所述浓氨水为15-30wt％的氨水，较佳地，20-28wt％，更佳地，25-28wt％。
在另一优选例中，所述色谱柱的柱长为20-25cm。
在另一优选例中，所述色谱柱的填料粒径为5-10μm。
在另一优选例中，所述色谱柱的柱径为4mm-6mm，较佳地4.6mm。
在另一优选例中，所述洗脱的柱温为10-40℃，更佳地，20-35℃。
在另一优选例中，所述样品的进样量为10μL-50μL，更佳地，10μL-20μL。
在另一优选例中，步骤(a3-1)中，色谱柱以黄芩苷计算理论塔板数不低于1500，较佳地，2000、2500或3000。
在另一优选例中，步骤(a3-2)中，色谱柱以苦参碱计算理论塔板数不低于1500，较佳地，2000、2500或3000。
在另一优选例中，所述洗脱程序之前和/或之后还包括5-20min的平衡过程，其中所述平衡过程洗脱程序为：乙腈5％和磷酸水溶液95％。
在另一优选例中，所述洗脱的流动相总流速为0.8-1.2mL/min，较佳地0.8-1.0mL/min。
在另一优选例中，所述高效液相色谱的紫外检测波长为250-300nm，较佳地，260-280nm，更佳地270-275nm。
在另一优选例中，所述制剂选自下组：液体制剂(悬液、溶液)、固体制剂，或其组合。
在另一优选例中，所述液体制剂选自下组：口服液、注射液、酊剂，或其组合。
在另一优选例中，所述固体制剂选自下组：片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂，或其组合。
本发明第二方面，提供了一种中药有效部位的指纹图谱构建方法，
其中，所述中药包括以下药材：黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参；
所述指纹图谱构建方法包括步骤：
(I)供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，溶剂稀释并定容，微孔滤膜过滤，得供试样品溶液；
(II)将所述对照品溶液和供试样品溶液上样至高效液相色谱并分离，
其中，所述高效液相色谱的分离条件具有以下特征：
(i)色谱柱为十八烷基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈(A)0.04-0.06wt％磷酸水溶液(B)；
(iii)梯度洗脱；
(iv)紫外检测波长为250-300nm；和
(III)将步骤(II)得到的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的HPLC的样品指纹图谱和对照指纹图谱。
在另一优选例中，步骤(III)中，使用多点校正法生成共有特征峰，用平均值法生成对照指纹图谱。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤:
(IV)将对照品溶液上样至所述高效液相色谱，并通过比较对照品与指纹图谱中的峰的保留时间，从而确定各峰代表的活性成分。
在另一优选例中，步骤(IV)中，所述对照品溶液的制备方法包括：
对照品溶液的制备：精密称定一种或多种对照品，溶剂定容，微孔滤膜过滤，得含有一种或多种对照品的对照品溶液。
在另一优选例中，步骤(IV)中，所述对照品选自下组：迷迭香酸、黄芩苷、三叶豆紫檀苷、千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、丹酚酸、汉黄芩苷、丹酚酸、木犀草素、黄芩素、汉黄芩素、苦参酮、隐丹参酮和丹参酮ⅡA，或其组合。
在另一优选例中，所述梯度洗脱的洗脱程序包括如下连续的过程，其中％为相对于总流量的体积百分比：
时间/min乙腈(A)％磷酸水溶液(B)％
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
(E)构建所述中药有效部位的生物碱的指纹图谱；
所述生物碱指纹图谱的构建包括以下子步骤：
(E1)生物碱供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，使用浓氨水和氯甲烷稀释，定容，得稀释液；精密量取所述稀释液，蒸干，得残渣，溶剂溶解残渣并定容，微孔滤膜过滤，得生物碱供试样品溶液；
(E2)将所述生物碱对照品溶液和生物碱供试样品溶液上样至高效液相色谱并分离，
其中，所述高效液相色谱的分离条件具有以下特征：
(i)色谱柱为氨基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈-无水乙醇-2.5-3.5wt％磷酸水溶液；
(iii)洗脱程序为等度洗脱：
(iv)紫外检测波长为200-230nm；和
(E4)将步骤(E3)得到的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的HPLC的样品生物碱指纹图谱和对照生物碱指纹图谱。
在另一优选例中，步骤(E4)中，使用多点校正法生成共有特征峰，用平均值法生成对照指纹图谱。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤:
(E4)将生物碱对照品溶液上样至所述高效液相色谱，并通过比较对照品与指纹图谱中的峰的保留时间，从而确定各峰代表的活性成分。
在另一优选例中，步骤(E4)中，所述生物碱对照品溶液的制备方法包括：生物碱对照品溶液的制备：精密称定一种或多种生物碱对照品：溶剂定容，微孔滤膜过滤，得含有一种或多种对照品的生物碱对照品溶液。
在另一优选例中，所述生物碱选自下组：苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱和氧化槐定碱。
在另一优选例中，所述等度洗脱为乙腈：无水乙醇：磷酸水溶液体积比为：75-85:8-15:6-12；较佳地，75-85:8-12:6-10。
在另一优选例中，步骤(E3)中，所述流动相为乙腈-无水乙醇-2.8-3.2wt％磷酸水溶液，较佳地，乙腈-无水乙醇-3wt％磷酸水溶液。
在另一优选例中，所述等度洗脱的洗脱条件为乙腈：无水乙醇：3wt％磷酸水溶液体积比为81：11：8。
在另一优选例中，所述方法还包括一个或多个以下步骤：
(F)使用相似度软件对各指纹图谱进行相似度评价；
(G)取同一供试品溶液连续进样3-6次，根据所得指纹图谱评价所述方法的精密度、重现性和/或稳定性。
本发明第三方面，提供了一种中药有效部位的质量控制方法，
其中，所述中药包括以下药材：黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参；
所述方法包括步骤：
(Z1)使用如本发明第二方面所述的方法构建所述中药有效部位的指纹图谱；
(Z2)使用相似度软件对所述指纹图谱进行相似度评价，样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.95。
在另一优选例中，所述质量控制方法还包括生物碱的质量控制：
(Z4)构建所述中药有效部位的生物碱指纹图谱；
(Z5)使用相似度软件对所述指纹图谱进行相似度评价，样品生物碱指纹图谱与对照生物碱指纹图谱的相似度不得低于0.95。
在另一优选例中，相似度≥0.96，较佳地，≥0.97、≥0.98或≥0.99。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
取同一供试品溶液连续进样3-6次，根据所得指纹图谱评价所述方法的精密度、重新性和/或稳定性，其中，各共有峰面积比值的RSD≤3％。
在另一优选例中，各共有峰的相对保留时间在平均相对保留时间±2min内，较佳地，±1min。
本发明第四方面，提供了一种活性成分的组合，所述组合包括下述A组的活性成分：
在另一优选例中，所述组合还包括下B组中的一种或多种活性成分：
在另一优选例中，所述组合还包括下C组中的一种或多种活性成分：
在另一优选例中，所述黄芩苷为15.5～19.5重量份。
在另一优选例中，所述汉黄芩苷为3.3～4.0重量份。
在另一优选例中，所述黄芩素为0.6～1.3重量份。
在另一优选例中，所述汉黄芩素为0.3～0.6重量份。
在另一优选例中，所述千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为1.9～3.2重量份。
在另一优选例中，所述丹酚酸B为9.7～14.0重量份。
在另一优选例中，所述丹参酮ⅡA为0.3-0.5重量份。
在另一优选例中，所述苦参碱为1.7～2.4重量份。
在另一优选例中，所述三叶豆紫檀苷为1.2～1.9重量份。
在另一优选例中，所述苦参酮为0.4～0.9重量份。
在另一优选例中，所述木犀草素为0.1～0.3重量份。
在另一优选例中，所述迷迭香酸为0.4～0.6重量份。
在另一优选例中，所述丹酚酸A为0.1～0.4重量份。
在另一优选例中，所述隐丹参酮为0.2～0.4重量份。
在另一优选例中，所述氧化苦参碱为0.6～0.9重量份。
在另一优选例中，所述槐果碱为0.6～0.8重量份。
在另一优选例中，所述氧化槐定碱为0.4～0.7重量份。
在另一优选例中，所述组合包括：
本发明第五方面，提供了一种药物组合物，所述组合物包括治疗有效量的如本发明第四方面所述的活性成分的组合；以及药学可接受的载体。
在另一优选例中，所述组合物包括下述A种：
在另一优选例中，所述组合物还包括下B组中的一种或多种：
在另一优选例中，所述组合物还包括下C组中的一种或多种：
在另一优选例中，(A1)-(A4)四种成分含量之和为26-36wt％。
在另一优选例中，所述黄芩苷为15.5～19.5wt％。
在另一优选例中，所述汉黄芩苷为3.3～4.0wt％。
在另一优选例中，所述千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷为1.9～3.2wt％。在另一优选例中，所述丹酚酸B为9.7～14.0wt％。
在另一优选例中，所述丹参酮ⅡA为0.3-0.5wt％。
在另一优选例中，所述苦参碱为1.7～2.4wt％。
在另一优选例中，所述黄芩素为0.6～1.3wt％。
在另一优选例中，所述汉黄芩素为0.3～0.6wt％。
在另一优选例中，所述三叶豆紫檀苷为1.2～1.9wt％。
在另一优选例中，所述苦参酮为0.4～0.9wt％。
在另一优选例中，所述木犀草素为0.1～0.3wt％。
在另一优选例中，所述迷迭香酸为0.4～0.6wt％。
在另一优选例中，所述丹酚酸A为0.1～0.4wt％。
在另一优选例中，所述隐丹参酮为0.2～0.4wt％。
在另一优选例中，所述氧化苦参碱为0.6～0.9wt％。
在另一优选例中，所述槐果碱为0.6～0.8wt％。
在另一优选例中，所述氧化槐定碱为0.4～0.7wt％。
在另一优选例中，所述组合物包括：
其中，所述百分比以组合物总重量计。
在另一优选例中，所述药物组合物中，各活性成分为化学合成的。
在另一优选例中，各活性成分来自黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参的提取物，且所述活性成分之和占所述提取物的80wt％以上，较佳地，90wt％以上，更佳地，95wt％以上。
在另一优选例中，所述制剂选自下组：液体制剂(悬液、溶液)、固体制剂，或其组合。
在另一优选例中，所述液体制剂选自下组：口服液、注射液、酊剂，或其组合。
在另一优选例中，所述固体制剂选自下组：片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂，或其组合。
本发明第六方面，提供了如本发明第四方面所述的活性成分的组合或如本发明第五方面所述的药物组合物的用途，用于制备一药物，所述药物用于：(a)治疗或预防感冒后咳嗽；和/或(b)抗菌和/或治疗细菌感染；(c)预防和/或治疗支气管炎；(d)解热；(e)抗炎；(f)抑制毛细管通透性；(g)镇痛；(h)镇咳；和/或(i)祛痰。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1为9批芩苏胶囊HPLC样品指纹图谱及对照指纹图谱(R)；其中：10：迷迭香酸，11：黄芩苷，13：三叶豆紫檀苷，16：千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷，17：丹酚酸B，18：汉黄芩苷，19：丹酚酸A，20：木犀草素，21：黄芩素，23：汉黄芩素，25：苦参酮，28：隐丹参酮，33：丹参酮ⅡA。
图2为9批芩苏胶囊HPLC指纹图谱相似度计算结果。
图3为9批芩苏胶囊生物碱类成分HPLC样品生物碱指纹图谱及对照生物碱指纹图谱(R)；其中1：槐果碱，2：苦参碱，3：氧化槐定碱，4：氧化苦参碱。
图4为9批芩苏胶囊生物碱类成分HPLC指纹图谱相似度计算结果。
图5A为流动相为乙腈-0.2％甲酸水时的液相色谱图；图5B为流动相为乙腈-0.05％磷酸水时的液相色谱图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了由黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参共五味中药组成的提取物及其所制成的制剂的质量控制方法，所述方法的质量控制指标准确、全面，能够合理科学的对芩苏散及其制剂进行质量控制。本发明还提供了芩苏散指纹图谱构建方法和基于其的质量控制方法，所得指纹图谱能够标定30个以上的共有峰，可准确、全面的控制产品质量。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25±5℃。
如本文所用，术语“C1-C6低级醇”、“C1-C4低级醇”或“C1-C3低级醇”是指具有1-6、1-4或1-3个碳原子的醇，例如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、或正丁醇等。
中药原料药材
本发明提供一种中药原料药材，所述的中药原料药材包括(但不限于)选自下组的一种或多种药材：紫苏子、紫苏梗、苦参、黄芩和丹参。
在另一优选例中，所述中药包括以下组分：
紫苏子为400-600重量份；
紫苏梗为400-600重量份；
苦参为600-800重量份；
黄芩为600-800重量份；和
丹参为1000-1400重量份。
在本发明中，主要的原料药材的性能以及主要功效如下：
紫苏子是唇形科植物紫苏的干燥成熟果实，紫苏子益五脏，下气，止霍乱、呕吐、反胃，补虚劳等功效。
紫苏梗的英文名为CAULIS PERILLAE，为唇形科植物紫苏Perillafrutescens(L.)Britt.的干燥茎，紫苏梗具有理气，治疗胃脘疼痛，嗳气呕吐的功效。
苦参的英文名为RADIX SOPHORAE FLAVESCENTIS，为豆科植物苦参Sophoraflavescens Ait.的干燥根，苦参具有清热燥湿，杀虫，利尿。
丹参的英文名为RADIX SALVIAE MILTIORRHIZAE为唇形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根和根茎，丹参具有祛瘀，活血通等功效，用于月经不调，经闭痛经等。
黄芩的英文名为RADIX SCUTELLARIAE为唇形科植物黄芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根，黄芩具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎。
中药有效部位
在本发明中，所述中药有效部位包括所述中药材的提取物(又称芩苏散)以及所述提取物的制剂形式。
所述的中药原料药材可在混合后，利用适当的方法提取有效成分，得到提取物；此外，各个原料药材也可分别提取(如分别采用相同或不同的提取或加工方法)有效成分(即药材的提取物)，合并后得到提取物。应当理解的是，提取得到有效成分可以以多种形式存在，例如原料药材经提取纯化得到单一或混合纯有效成分粉末，或原料药材经溶剂提取浓缩后得到浸膏(有效成分存在浸膏中)，或其它形式存在。
所述中药有效部位也可以以制剂形式存在。如将上述提取物与药学上可接受的载体制备成任何合适的制剂。常用的制剂包括但并不限于：液体制剂，如悬浮液、溶液；更具体地，口服液、注射液、气雾剂等；固体制剂，例如，片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂等。
本发明中，当所述中药有效部位以制剂形式存在时，所述中药有效部位中，活性成分的含量以加入所述制剂中的提取物干重计(即，载体不计入总重量)。
本发明中，对所述中药有效部位的提取方法没有特别限制，可采用本领域常用的中药提取方法。优选地，所述提取物满足本发明的质量控制要求。
优选地，所述中药提取物为所述中药材通过水和有机溶剂的混合溶剂提取获得。例如，所述混合溶剂为醇水混合液或乙腈与水的混合溶剂，优选地，乙醇-水。
优选地，所述黄芩的提取方法包括步骤：取黄芩药材，加6-10倍量的65-75％乙醇水加热回流提取2-4次，每次1-4小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥，得干浸膏A。
优选地，所述苦参的提取方法包括步骤：取苦参药材，加8-12倍量45-55％乙醇水，加热回流提取2-4次，每次1-4小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.02～1.12(50～60℃)的浓缩液；将浓缩液加纯化水稀释成分散液(含生药量0.05kg/L)，取分散液过中性氧化铝柱，以6-10倍量90-95％乙醇水洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥，得干浸膏B。
优选地，所述丹参的提取方法包括步骤：取丹参药材，加8-12倍量85-90％乙醇水加热回流提取2-4次，每次1-4小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.15(50～60℃)的浓缩液，将浓缩液加纯化水稀释成分散液(含生药量0.05kg/L)，取分散液过弱极性或非极性大孔树脂柱，以6-10倍量90-95％乙醇水洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥，得干浸膏C。
优选地，所述紫苏子和/或紫苏梗的提取方法各自独立地包括步骤：取紫苏子和/或紫苏梗药材，加8-12倍量75-85％乙醇水加热回流提取2-4次，每次1-4小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥，得干浸膏D。
优选地，所述中药有效部位为所述干浸膏A、B、C和D按混合得到，较佳地，按出膏量完全混合。
另一优选例中，所述中药有效部位为所述药材混合物后再提取获得地，具体地，所述提取方法可以包括步骤：
(1)将中药原料药材混合，用醇水溶液提取，得到提取液；
(2)所述的提取液经大孔吸附树脂柱纯化后，得到提取物。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述的醇水溶液中醇含量为10-90％(v/v)，较佳地20-80％(v/v)，更佳地30-70％(v/v)，最佳地40-60％(v/v)。
在另一优选例中，所述步骤(1)中，所述的醇为C1-C6低级醇、较佳地C1-C4低级醇，更佳地C1-C3低级醇。典型地，所述的醇为乙醇。
在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述的大孔树脂为弱极性或非极性大孔吸附树脂。典型地，所述步骤(2)中，所述的大孔树脂为苯乙烯型弱极性大孔吸附树脂。
指纹图谱的构建方法
中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标识该中药特性的共有峰的图谱。中药指纹图谱具有整体性的基本特点。整体性强调多个成分(共有峰)的相对稳定的比例、排列顺序及相互牵制，反映的信息是综合的。通过指纹图谱的特征性，能有效鉴别中药的真伪。通过指纹图谱主要特征峰的面积和比例的制定，能有效控制中药质量，保证中药质量的相对稳定。
因此，中药半成品(如提取物)及其制剂的指纹图谱能够鉴别品质的真伪、证明产品批间质量的一致和稳定性。
本发明的提供了上述中药有效部位的指纹图谱构建方法，其中，所述方法包括黄酮类成分、多酚类成分及二萜醌类成分的指纹图谱构建方法和生物碱类成分的构建方法。
优选地，所述黄酮类成分、多酚类成分及二萜醌类成分的指纹图谱构建方法包括步骤：
(I)供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，溶剂稀释并定容，微孔滤膜过滤，得供试样品溶液；
(II)将所述对照品溶液和供试样品溶液上样至高效液相色谱并分离，
其中，所述高效液相色谱的分离条件具有以下特征：
(i)色谱柱为十八烷基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈(A)0.04-0.06wt％磷酸水溶液(B)；
(iii)梯度洗脱；
(iv)紫外检测波长为250-300nm；和
(III)将步骤(II)得到的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的HPLC的样品指纹图谱和对照指纹图谱。
本发明中，所述“十八烷基键合硅胶柱”也称C18柱，是指以十八烷基键合硅胶为填料的反相色谱柱。优选地，所述色谱柱以黄芩苷计算理论塔板数不低于1500，较佳地，不低于2000、不低于2500或不低于3000。
更优选地，当分离黄酮类成分、多酚类成分及二萜醌类成分时，所述流动相为乙腈(A)和0.05wt％磷酸水溶液(B)。
更优选地，所述梯度洗脱包括如下连续的过程，其中％为相对于总流量的体积百分比：
通常，当通过高效液相色谱法获得色谱峰后，图谱的分析比较和数据处理方法对于本领域技术人员而言是已知的，例如，可以按照《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)进行数据处理。
在另一优选例中，步骤(III)中，使用多点校正法生成共有特征峰，用平均值法生成对照指纹图谱。
优选地，所述生物碱指纹图谱的构建包括以下子步骤：
(E1)生物碱供试样品溶液的制备：精密称定所述中药有效部位，使用浓氨水和氯甲烷稀释，定容，得稀释液；精密量取所述稀释液，蒸干，得残渣，溶剂溶解残渣并定容，微孔滤膜过滤，得生物碱供试样品溶液；
(E2)将所述生物碱对照品溶液和生物碱供试样品溶液上样至高效液相色谱并分离，
其中，所述高效液相色谱的分离条件具有以下特征：
(i)色谱柱为氨基键合硅胶柱；
(ii)流动相为乙腈-无水乙醇-2.5-3.5wt％磷酸水溶液；
(iii)洗脱程序为等度洗脱：
(iv)紫外检测波长为200-230nm；和
(E4)将步骤(E3)得到的色谱图进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的HPLC的样品生物碱指纹图谱和对照生物碱指纹图谱。
本发明中，所述“氨基键合硅胶柱”是指以氨基键合硅胶为填料的色谱柱。本发明的方法可使用本领域常用的各种氨基键合硅胶柱，例如3-氨基丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane)、-Si-(CH2)3NH2等键合在硅胶颗粒获得的键合相。优选地，所述色谱柱以苦参碱计算理论塔板数不低于1500，较佳地，不低于2000、不低于2500或不低于3000。
优选地，当分离生物碱类成分时，所述流动相为乙腈-无水乙醇-2.8-3.2wt％磷酸水溶液，较佳地，乙腈-无水乙醇-3wt％磷酸水溶液。
优选地，所述流动相的体积比为乙腈：无水乙醇：磷酸水溶液75-85:8-15:6-12；较佳地，75-85:8-12:6-10。
质量控制方法
本发明还提供了上述中药有效部位的质量控制方法，其中所述方法包括分析所述指纹图谱所得的相似性质量控制方法和/或活性成分含量质量控制方法。
具体地，所述活性成分含量质量控制方法包括步骤：
(a)测定所述中药有效部位中活性成分的重量百分含量，以所述中药有效部位的干重计，其中，所述活性成分包括下述A组：黄芩苷、丹酚酸B、迷迭香酸和苦参碱；
(b)根据步骤(a)中的测定结果，判定所述活性成分含量是否符合下述标准含量范围：
当各活性成分含量都符合相应的标准含量范围时为合格，否则为不合格。
一般地，所述活性成分的含量可以通过本领域任何合适的定量检测方法获得，例如，可使用的定量检测方法包括但并不限于：高效液相色谱法、质谱法、液质联用法等。
优选地，所述活性成分含量为通过高效液相色谱仪与二极管阵列检测器检测获得的，例如，使用上述指纹图谱构建方法色谱条件获得。当对某一活性成分进行定量时，优选使用其最大紫外吸收处(λmax±5nm)的吸收峰作为定量基础。
通常，上述检测方法的定量方法和数据分析方法对本领域技术人员而言是已知的。通常，可以通过对照品来确定峰的归属和活性成分的含量。例如，常用的定量方法包括但并不限于：标准曲线法(外标法、内标法)、外标一点法，或其组合。
上述质量控制方法还包括步骤：(c)当步骤(b)中判定结果为不合格，且当中药有效部位中超出所述标准含量范围的相应活性成分的含量C1与相应的标准含量范围的最接近的端值C0符合|C1-C0|/C0≤10％时，调整所述中药有效部位的组成，使之合格。
具体地，基于相似性的质量控制方法包括步骤：
所述方法包括步骤：
(Z1)使用上述方法构建所述中药有效部位的指纹图谱；
(Z2)使用相似度软件对所述指纹图谱进行相似度评价，样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度不得低于0.95。
优选地，所述指纹图谱包括所述黄酮类成分、多酚类成分及二萜醌类的指纹图谱和/或生物碱类指纹图谱。
实验证明，本发明的方法具有很好的重现性和稳定性，样品相似度结果可≥0.99，在应用过程中，相似度≥0.95可满足质量控制需求。
更优选地，所述相似度上述两种质量控制方法可结合使用，已达到全面、准确的质量控制。
活性成分的组合、药物组合物及其用途
本发明还提供了一种活性成分的组合：所述组合包括下述A组的活性成分：(A1)黄芩苷14.5-20.5重量份；(A2)丹酚酸B 9-15重量份；(A3)迷迭香酸0.3-0.7重量份；和(A4)苦参碱1.5-2.8重量份。
另一优选例中，所述活性成分的组合中，来自黄芩、紫苏子、紫苏梗、苦参和丹参其他物质含量低于20wt％，低于10％或5％。
本发明还提供了一种药物组合物，所述组合物包括治疗有效量的如上所述的活性成分的组合；以及药学可接受的载体。
本发明的活性成分的组合和药物组合物可用于：(a)治疗或预防感冒后咳嗽；和/或(b)抗菌和/或治疗细菌感染；(c)预防和/或治疗支气管炎；(d)解热；(e)抗炎；(f)抑制毛细管通透性；(g)镇痛；(h)镇咳；和/或(i)祛痰。可参见中国申请201911033104.1、201410229647.1，其所有内容通过引用并入本文。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指药物的任何如下所述的量，当单独使用或与另一种治疗剂组合使用该量的药物时，可促进疾病消退，疾病消退表现为疾病症状的严重度降低、无疾病症状期的频率和持续时间增加、或者防止由患病导致的障碍或失能。本发明药物的“治疗有效剂量”也包括“预防有效剂量”，“预防有效剂量”是药物的任何如下所述的量，当将该量的药物单独施用或者与另一种治疗剂组合施用于具有发生疾病的风险或者遭受疾病复发的受试者时，可抑制疾病的发生或复发。通常，药物组合物含有1-2000mg本发明活性成分组合/剂，更佳地，含有10-500mg本发明活性成分组合/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个胶囊或药片。
对于本发明所述的药物组合物的剂型并没有特别的限制，可以是任何适用于哺乳动物的剂型。优选地，所述的剂型可包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、口服液、口含片、或气雾剂。从易于制备，给药或服用的立场上看，优选的组合物是固态组合物。口服给药是优选的。
本发明的组合物中可以加入制备不同剂型时所需要的各种常规载体和或辅料，如填充剂(如淀粉、纤维素、糊精)、崩解剂(羧甲基淀粉钠)、润滑剂(硬脂酸镁)、溶剂(纯化水)、助溶剂(乙醇)、包衣材料。可采用常规的中药制剂的方法制备成任何一种常用的剂型，如片剂、胶囊剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、散剂。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”的成分是指适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。药学可接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙甲基纤维素、羧甲基纤维素钠等)、明胶、滑石粉、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油、等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如吐温)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、缓冲剂、螯合剂、增稠剂、pH调节剂、透皮促进剂、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、抑菌剂、无热原水等。
本发明的主要优点包括：
1.本发明的提供了一种对芩苏散及其制剂的活性成分进行准确、全面质量控制的质量控制方法。
2.本发明还提供了一种芩苏散及其制剂的液相指纹图谱构建方法，其中液相分离方法分离效果好、出峰数目多，可将芩苏散各成分高效分离，可得到更准确、全面的结果。
3.本发明的液相指纹图谱重现性好、稳定性高，可用于全面的分析、鉴别芩苏散及其制剂。
4.基于所述液相指纹图谱的芩苏散及其制剂质量控制方法可从整体上控制产品质量。
5.本发明还提供了一种活性成分组合和药物组合物，所述药物组合物可以代替中药提取物治疗疾病，而减少提取物中杂质带来的副作用。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
仪器
高效液相色谱仪：安捷伦Agilent 1260，(配有四元泵、自动进样器、柱温箱、二级管阵列检测器)，Agilent ChemStation。
试剂
实施例1
1.1、处方
1.2、药物制备与制剂方法
取黄芩药材，加8倍量(重量比)70％乙醇水加热回流提取2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥(-0.07～-0.1MPa，≤60℃)，得干浸膏A。
取苦参药材，加10倍量50％乙醇水，加热回流提取2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.02～1.12(50～60℃)的浓缩液。将浓缩液加纯化水稀释成分散液(含生药量0.05kg/L)，取分散液过中性氧化铝柱，以8倍量95％乙醇洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥(-0.07～-0.1MPa，≤60℃)，得干浸膏B。
取丹参药材，加10倍量90％乙醇水加热回流提取2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.15(50～60℃)的浓缩液，将浓缩液加纯化水稀释成分散液(含生药量0.05kg/L)，取分散液过AB-8树脂柱，以8倍量95％乙醇水洗脱，收集洗脱液，洗脱液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥(-0.07～-0.1MPa，≤60℃)，得干浸膏C。
取紫苏子和紫苏梗药材，加10倍量80％乙醇水加热回流提取2次，每次2小时，滤过，滤液减压回收乙醇合并浓缩至相对密度为1.05～1.20(50～60℃)的浸膏，减压干燥(-0.07～-0.1MPa，≤60℃)，得干浸膏D。
取干浸膏A、B、C、D粉碎，过60目筛，混合均匀，得芩苏散。
胶囊剂制备：取干浸膏粉和适量淀粉，混匀，以95％乙醇为粘合剂，湿法制粒，干燥，加微粉硅胶适量，整粒，混匀，填充，制得1000粒。
实施例2
HPLC指纹图谱及相似度分析
2.1芩苏胶囊HPLC指纹图谱构建方法
2.1.1供试品溶液的制备
取芩苏胶囊内容物，研细，取约50mg，精密称定，置25ml棕色量瓶中，加75％甲醇20ml，超声处理10分钟(功率250kw，频率50KHz)，冷却至室温，加75％甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
2.1.2色谱条件
以十八烷基键合硅胶为填充剂Waters Xbridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(A)-0.05％磷酸水(B)梯度洗脱，梯度条件见表1；检测波长：270nm；流速：0.8ml/分钟；柱温：30℃；运行时间：105分钟(单次运行结束后以起始浓度运行10分钟以平衡色谱柱)；进样量：10μL。
表1 HPLC梯度洗脱条件
2.2指纹图谱及相似度分析
对9批芩苏胶囊测定结果进行评价《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012年版)，采用多点校正法生成芩苏散指纹图谱共有模式，用平均值计算法生成芩苏散对照指纹图谱(R)。
所得指纹图谱如图1，可以看出，所述芩苏胶囊HPLC指纹图谱共标定33个共有峰，且各峰之间的分辨率很高，这暗示根据本发明方法所得的色谱图进行数据分析时，可以获得更准确、全面的结果。
其中，代表性的峰表如表2所示：
表2芩苏胶囊(批号：200101)共有峰信息表
表2中，通过对照品对照，指认了芩苏胶囊HPLC指纹图谱中13个成分，分别为：黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、千层纸素A-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、三叶豆紫檀苷、苦参酮、木犀草素、丹酚酸B、迷迭香酸、丹酚酸A、丹参酮ⅡA、隐丹参酮。
以上述共有模式为标准，对9批样品进行整体相似度评价，计算结果见图2，结果显示，S1～S9样品与对照指纹图谱(R)的相似度分别为0.999、0.999、0.999、0.997、0.998、0.999、0.999、0.999、0.999，均>>0.990(与对照指纹图谱相比，相似度>0.95可满足质量控制要求)，这说明本发明建立的指纹图谱方法应用于芩苏胶囊质量控制灵敏度高、重复性好、结果可靠，所检测的芩苏胶囊质量稳定。
实施例3
定量分析
3.1方法学验证
3.1.1色谱条件
Waters Xbridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈(B)-0.05％磷酸水(C)梯度洗脱，梯度条件见表1；检测波长：270nm(黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、隐丹参酮、丹参酮IIA)，310nm(丹酚酸B)，330nm(迷迭香酸)；流速：0.8mL/分钟；柱温：30℃；运行时间：105分钟(单次运行结束后以起始浓度运行10分钟以平衡色谱柱)。
3.1.2溶液制备
对照品溶液的制备：取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，用甲醇分别制成每1mL分别含0.75mg、0.16mg、0.04mg、0.02mg、0.32mg、0.03mg、0.01和0.01mg的标准品母液。
供试品溶液的制备：取装量差异项下的本品，研细，取约50mg，精密称定，置25mL棕色量瓶中，加75％甲醇20mL，超声处理10分钟(功率250kw，频率50KHz)，冷却至室温，加75％甲醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
3.1.3线性关系考察
精密吸取对照品母液适量，依次用甲醇稀释成混合对照品溶液1-5(如表3)，HPLC分别进行测定，进样20μL，各指标成分的标准曲线数据见表3。
以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归得标准曲线方程，分别为：黄芩苷：y＝81.404x+96.908(r＝1)，汉黄芩苷：y＝96.778x+61.506(r＝1)，黄芩素：y＝128.14x-32.67(r＝1)，汉黄芩素：y＝153.54x+10.49(r＝1)，丹酚酸B：y＝31.158x-4.2264(r＝0.9999)，迷迭香酸：y＝74.693x+3.3339(r＝1)，隐丹参酮：y＝121.75x+6.5767(r＝1)，丹参酮ⅡA：y＝140.9x+6.6845(r＝0.9999)。结果表明黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA分别在测试范围内呈良好线性关系。
表3各指标成分标准曲线数据
3.1.4精密度试验
日内精密度：取高、中、低三种浓度的黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA混合对照品溶液(如表4)，重复进样6次，每次进样20μL，计算峰面积RSD。计算得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA RSD均小于3％，表明其日内精密度良好。
日间精密度：上述对照品溶液，每天进样1次，每次进样20μL，连续三天测定，计算峰面积RSD。结果如表5所示，计算得各对照品RSD小于3％，表明样品日间精密度良好。
表4日内精密度测定结果(n＝6)
表5日间精密度测定结果(n＝3)
3.1.5稳定性试验
取芩苏胶囊(批号：190601)供试品溶液，分别在0、2、4、8、16、24和48h各进样10μL进行测定。结果见表6，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA峰面积的RSD分别为0.13％、2.43％、1.33％、0.12％、0.71％、1.14％、0.49％和0.63％，表明供试品溶液在48小时内处于稳定的状态。
表6各指标成分稳定性测定结果(峰面积)
3.1.6重复性试验
分别精密称定芩苏胶囊(批号：190601)6份，各50mg，按供试品溶液制备方法制备，分别进行测定，进样10μL。结果见表7，测得黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA含量分别为185.03、35.97、9.83、4.14、96.81、6.87、3.09和4.28mg/g；RSD分别为0.43％、2.58％、0.27％、0.30％、1.25％、2.03％、0.26％和0.96％，说明方法重复性好。
表7各指标成分重复性试验结果(含量mg/g)
3.1.7加样回收率试验
取已准确进行含量测定的芩苏胶囊约25mg(批号：190601)，精密称定，再分别取黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，精密称定，加75％甲醇溶解，制成浓度分别为2.0369、0.4157、0.1603、0.0534、1.0024、0.1089、0.0379、0.0494mg/mL的混合对照品溶液。按50％、100％和150％分别加入不同体积的混合对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备，进样10μL，测定含量，计算加样回收率及平均加样回收率。结果见表8，芩苏胶囊中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的平均回收率分别为99.65％、99.71％、103.31％、99.65％、100.04％、99.60％、99.17％、101.45％，RSD分别为0.37％、1.20％、0.75％、1.41％、2.26％、0.98％、1.44％、2.26％，说明本发明回收率良好。
表8加样回收试验(n＝9)
定量检测结果总结在表16，其中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、丹酚酸B、迷迭香酸、隐丹参酮、丹参酮ⅡA通过外标标准曲线法算得，千层纸素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、三叶豆紫檀苷、苦参酮、木犀草素、丹酚酸A的含量通过外标一点法算得，其中，所述活性成分的百分含量按提取物(芩苏散)干重计。
综上可知，本发明建立的HPLC含量测定方法准确、重现性好、精密度高、专属性强，适用于芩苏散及其制剂中黄酮类成分、多酚类成分及二萜醌类成分的含量测定。
实施例4
生物碱类成分HPLC指纹图谱
4.1供试品溶液的制备
取芩苏胶囊内容物，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液(25-28wt％浓氨水)0.5ml，精密加入二氯甲烷25ml，摇匀，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)10分钟，放冷，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，滤液蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
4.2色谱条件
Agilent ZORBAX NH2(4.6mm×250mm，5μm，填充剂为氨基键合硅胶)；以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(81：11：8)为流动相；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：35min，进样量10μL。
4.3.指纹图谱及相似度分析
使用与实施例2相同的指纹图谱生成方法和相似度分析方法，结果如图3和4所示。
其中，代表性的峰表如表9所示：
表9芩苏胶囊共有峰峰表(批号：190601)
结果显示，S1～S9样品与对照品的相似度分别为0.997、0.991、0.995、1.000、0.997、0.992、0.998、0.998、0.998，均大于0.990；经对照品对照4个成分全部指认，分别为：苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐定碱。
实施例5
生物碱类成分定量分析
5.1方法学验证
5.1.1对照品溶液制备
取苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱对照品适量，精密称定，用乙腈-无水乙醇(80:20)混合溶液分别制成每1mL分别含1.2mg、1.3mg和1.1mg的标准品母液。
5.1.2供试品溶液的制备
取装量差异项下的本品，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加浓氨试液0.5ml，精密加入二氯甲烷25ml，摇匀，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率50kHz)10min，放冷，再称定重量，用二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10ml，滤液蒸干，残渣加无水乙醇适量使溶解，转移至10ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，过0.45μm微孔滤膜，即得。
5.1.3色谱条件与系统适应性
以氨基键合硅胶为填充剂[Agilent ZORBAX NH2]；以乙腈-无水乙醇-3％磷酸溶液(81：11：8)为流动相；检测波长：210nm；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；运行时间：35min。
5.1.4线性关系考察
精密吸取对照品储备溶液适量，依次用乙腈-无水乙醇(80:20)混合溶液稀释成如表10的混合对照品溶液1-6，分别进行测定，进样10μL。
以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归得标准曲线方程，分别为：苦参碱：y＝14927x+26.36(r＝1)，槐定碱：y＝12293x+5.20(r＝0.9999)，氧化苦参碱：y＝15380x+10.40(r＝0.9998)。各指标成分的标准曲线数据见表10，结果表明苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱分别在所测范围内呈良好线性关系。
表10各指标成分标准曲线数据
5.1.5精密度试验
如表11，取高、中、低三种浓度的苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱混合对照品溶液，重复进样6次，每次进样10μL，计算峰面积RSD。
每天进样1次，每次进样10μL，连续三天测定，计算峰面积RSD。
表11日内精密度测定结果(n＝6)
表12日间精密度测定结果(n＝3)
从表11和表12可知，本发明生物碱测定方法的日内精密度和日间精密度良好。
5.1.6稳定性试验
取芩苏胶囊(批号：190601)供试品溶液，分别在0、4、8、16、24和48h各进样10μL。
结果如表13所示，测得苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱锋面积的RSD分别为1.0％、2.7％和2.6％，表明供试品溶液在48小时内处于较为稳定的状态，各指标成分含量变化不大。
表13稳定性测定结果(峰面积)
5.1.7重复性试验
分别精密称定芩苏胶囊(批号：0050101-190601)6份，各0.1g，按供试品溶液制备方法制备，分别进行测定，进样10μL。
结果如表14所示，测得苦参碱、槐定碱及氧化苦参碱含量分别为21.31、5.48和6.36mg/g；RSD分别为0.5％、2.2％和2.3％，说明方法重复性良好。
表14重复性试验结果(含量mg/g)
5.1.8加样回收率试验
取已准确进行含量测定的芩苏胶囊约0.05g(批号：0050101-190601，苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱含量分别为21.31、5.48、6.36mg/g)，精密称定，再分别取苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成浓度分别为0.5263、0.1339、0.1435mg/mL的混合对照品溶液。按50％、100％和150％分别加入不同浓度的混合对照品溶液，按供试品溶液制备方法制备，进样10μL，测定含量，计算加样回收率及平均加样回收率。
结果如表15所示，芩苏胶囊中总碱的平均回收率为96.34％，RSD为0.67％。
表15加样回收试验(n＝9)
定量检测结果总结在表16，其中，苦参碱、氧化苦参碱的含量通过外标曲线法算得；槐果碱、氧化槐定碱的含量通过外标一点法算得，其中，所述活性成分的百分含量按提取物(芩苏散)干重计。
综上可知，本发明建立的HPLC含量测定方法准确、重现性好、精密度高、专属性强，适用于芩苏散及其制剂中生物碱类成分的含量测定。
经证明，实施例中所测试的各批次芩苏胶囊在治疗或预防感冒后咳嗽、抗菌和/或治疗细菌感染、预防和/或治疗支气管炎、解热、抗炎、抑制毛细管通透性、镇痛、镇咳、祛痰方面药效良好，满足用药需求。
对比例1
基本与实施例2相同，不同之处在于，流动相为乙腈-0.2％甲酸水。
结果如图5所示，采用乙腈-0.2％甲酸水流动相体系对样品溶液进行梯度洗脱，酚酸类成分受该流动相体系影响较大，经常出现保留时间不稳定或分离度较差的现象(如图5A中的指标成分丹酚酸B分离度仅1.4，未达到基线分离，图5B为1.6＞1.5，达到基线分离)；而采用乙腈-磷酸水流动相体系后，指标成分获得了更好的分离度、峰形以及稳定的保留时间。
讨论
本发明结合HPLC-DAD含量分析及中药指纹图谱技术，成功建立了包含紫苏子、紫苏梗、苦参、黄芩和丹参的中药组方的提取物及其制剂的HPLC指纹图谱，可同时对药物中多种成分，如黄酮类、多酚类、二萜醌类成分、生物碱类进行综合评价，所述指纹图谱方法稳定性高，结果稳定、全面，同时可利用获得的液相图谱对主要活性成分进行定量分析，非常适合用于芩苏散及其制剂的整体质量控制。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。