具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1

实验材料：MEM基础培养基，胎牛血清(FBS)，HaCaT细胞，胰蛋白酶，NaCl；主要设备：酶标仪；移液枪；十万分之一天平；多孔细胞培养板；超净工作台；NaCl溶液的制备：精密称取5.0000gNaCl粉末，溶于50mL MEM基础培养基中，混匀，过0.22μm滤膜备用。透明质酸钠溶液配制：精密称取0.1000g透明质酸钠粉末，溶于50mL PBS中，混匀，过0.22μm滤膜备用。

化妆品保湿功效的测定方法包括以下步骤：

(1)HaCaT细胞：在超净工作台中，取F13代以前的HaCaT细胞复苏，在细胞培养皿中达到80％以上融合时进行消化、然后混匀计数之后，以5.0×10³个/孔种96孔板，共处理3*3个孔，分为3组并标记为A组、B组和C组，三组均以每孔100μL的10％FBS的MEM培养液，37℃，5％CO₂培养至细胞70％左右贴壁，A组为HaCaT细胞组；

失水损伤细胞：取B组在超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出上一步培养基，换成10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，其中每孔100μl培养液，NaCl体系浓度控制在3％，37℃，5％CO₂培养0.5h，得到失水损伤细胞。

修复细胞：使用透明质酸钠作为待测化妆品，对HaCaT细胞进行防护；取C组在超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出HaCaT细胞铺板中的培养基，换成90μl的MEM培养液+10μl的透明质酸钠的培养基，37℃，5％CO₂培养16h，后真空泵或移液枪吸出培养基，加入10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，其中培养液每孔100μl，NaCl体系浓度控制在3％，37℃，5％CO₂培养0.5h，得到修复细胞。

(2)通过MTT方法并使用酶联免疫检测仪，在波长570nm下，分别测试HaCaT细胞、失水损伤细胞和修复细胞的吸光度(OD)值，分别得到a、b、c，通过保湿功效计算公式：

即，

其中失水损伤细胞的细胞活力值计算公式为：

失水损伤细胞活力(％)＝失水损伤细胞组OD₅₇₀值/HaCaT细胞组OD₅₇₀值×100％，即

修复细胞的细胞活力值计算公式为：

修复细胞活力(％)＝修复细胞组OD₅₇₀值/HaCaT细胞组OD₅₇₀值×100％，，即

保湿功效计算公式：修复细胞活力(％)-失水损伤细胞活力(％)。

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表1和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，**表示p＜0.01，即存在的差异性显著。从中可以看出，B组的细胞活力均值在61.15％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在82.41％，与B组的差异性显著；待测化妆品透明质酸钠的保湿功效为21.26％，待测化妆品透明质酸钠的保湿效果较好。

表1各组OD₅₇₀与细胞活力值

如图3所示，通过倒置生物显微镜进行拍照观察各组细胞的形态差异，A组为正常情况下的细胞形态，与A组相比，B组细胞发生失水损伤，细胞形态皱缩，膜结构受损；与A组相比，C组细胞部分形态皱缩，但和B组相比，细胞形态较好，损伤程度减轻。以上结果印证了待测化妆品透明质酸钠的保湿效果。

实施例2

如图1所示的化妆品保湿功效的测定装置示意图，包括细胞采集模块、细胞失水处理模块、待测化妆品测试模块和保湿功效评价模块；细胞失水处理模块和待测化妆品处理模块与细胞采集模块相连，保湿功效评价模块与细胞采集模块、细胞失水处理模块、待测化妆品测试模块和保湿功效评价模块相连，细胞采集模块、细胞失水处理模块、待测化妆品测试模块内均设有细胞培养腔，细胞培养腔内设有温度调节装置和时间提醒装置，细胞培养腔为n个。

细胞采集模块采集HaCaT细胞并分成三组，每组细胞分别自动加入到细胞培养腔内，细胞培养腔内含有细胞培养液；细胞采集模块留下一组进行培养，剩余两组分别通过传输带输送给细胞失水处理模块和待测化妆品处理模块；细胞培养腔内设有温度调节装置和时间提醒装置来控制细胞培养环境和时间，其中细胞采集模块的温度为37℃，CO₂浓度为5％。

细胞失水处理模块接收细胞培养腔，并通过细胞失水处理模块内置的真空泵将细胞培养腔内细胞培养液吸出，并加入失水处理液，失水处理液为NaCl和MEM培养液混合溶液；细胞培养腔内设有温度调节装置和时间提醒装置来控制细胞培养环境和时间，其中细胞失水处理模块的温度为37℃，CO₂浓度为5％。

待测化妆品处理模块接收细胞培养腔，并通过待测化妆品处理模块内置的真空泵将细胞培养腔内细胞培养液吸出，并加入待测化妆品和MEM培养液混合溶液，培养一段时间后，真空泵将细胞培养腔内混合溶液吸出，加入失水处理液，失水处理液为NaCl和MEM培养液混合溶液；细胞培养腔内设有温度调节装置和时间提醒装置来控制细胞培养环境和时间，其中待测化妆品处理模块的温度为37℃，CO₂浓度为5％。

细胞采集模块、细胞失水处理模块和待测化妆品处理模块在培养细胞结束后，分别将细胞培养腔输送给保湿功效评价模块；保湿功效评价模块内置有酶联免疫检测仪和数据处理模块，酶联免疫检测仪分别测定各组细胞培养腔在波长570nm下的吸光度值，得到HaCaT细胞、失水损伤细胞和修复细胞的吸光度值，并将数值发送至数据处理模块，数据处理模块对各组吸光度值进行处理，得到待测化妆品保湿功效，并输出测定结果。

数据处理模块的保湿功效计算公式：

实施例3：细胞失水模型的不同造模时间的对比

实验材料：MEM基础培养基，胎牛血清(FBS)，HaCaT细胞，胰蛋白酶，NaCl；主要设备：酶标仪；移液枪；十万分之一天平；多孔细胞培养板；超净工作台；细胞培养皿；NaCl溶液的制备：精密称取5.0000gNaCl粉末，溶于50mL MEM基础培养基中，混匀，过0.22μm滤膜备用。

HaCaT细胞：在超净工作台中，取F13代以前的HaCaT细胞复苏，在细胞培养皿中达到80％以上融合时进行消化、然后混匀计数之后，以5.0×10³个/孔种96孔板，以每孔100μL的10％FBS的MEM培养液，37℃，5％CO₂培养至细胞70％左右贴壁。

失水损伤细胞：将上述培养的HaCaT细胞分为10组，每组3×3个复孔，10组分别用不同浓度的无菌NaCl溶液处理；超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出10组中的培养基溶液，换成每孔100μl的10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，NaCl体系浓度分别控制在0.00％、1.00％、1.50％、1.80％、1.90％、2.00％、2.10％、2.20％、2.50％、3.00％。每组3×3个复孔根据NaCl溶液处理的时间不同，又分为3组，37℃，5％CO2条件下培养分别为培养0.5h、1h和2h。

细胞活力测定：细胞活力测定的方法与实施例1相同，具体结果见表2。

表2不同NaCl浓度和处理时间的细胞活力值

失水损伤细胞的细胞活力值通常控制在40-65％，细胞活力值过低或过高都会影响对比效果，由表2可知，处理时间在0.5h时，NaCl浓度在1.80-2.50％，可以达到40-65％的细胞活力值；处理时间在1h-2h时，NaCl浓度在1.50-1.80％，可以达到40-65％的细胞活力值；因此处理时间在0.5-1h,NaCl浓度1.50-2.50％都可以达到细胞活力值的要求。此外，处理时间在0.5h时，NaCl浓度的选择范围最大，因此作为最优选择。

实施例4：细胞失水模型的不同造模浓度对比

实验材料：MEM基础培养基，胎牛血清(FBS)，HaCaT细胞，胰蛋白酶，NaCl；主要设备：酶标仪；移液枪；十万分之一天平；多孔细胞培养板；超净工作台；细胞培养皿；NaCl溶液的制备：精密称取5.0000gNaCl粉末，溶于50mL MEM基础培养基中，混匀，过0.22μm滤膜备用。

HaCaT细胞：在超净工作台中，取F13代以前的HaCaT细胞复苏，在细胞培养皿中达到80％以上融合时进行消化、然后混匀计数之后，以5.0×103个/孔种96孔板，以每孔100μL的10％FBS的MEM培养液，37℃，5％CO2培养至细胞70％左右贴壁。

失水损伤细胞：将上述培养的HaCaT细胞分为10组，每组4个复孔，10组分别用不同浓度的无菌NaCl溶液处理；超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出10组中的培养基溶液，换成每孔100μl的10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，NaCl体系浓度分别控制在0.00％、1.00％、1.50％、1.80％、2.00％、2.30％、2.50％、3.00％、3.50％、4.00％。37℃，5％CO₂条件下培养0.5小时。

细胞活力测定：细胞活力测定的方法与实施例1相同，具体结果见表3。

表3不同NaCl浓度的吸光度值和细胞活力对比

失水损伤细胞的细胞活力值控制在40-65％，由表3可知，处理时间为0.5小时，NaCl浓度在2.30-3.00％时，可以满足细胞活力值的要求。因为细胞实验的重现性较差，综合实施例3和实施例4结果，确定了最优的NaCl浓度为3.00％，最优的处理时间为0.5小时，可极大的减少细胞实验重现性差带来的误差。

实施例5：细胞失水模型的验证

实验材料：MEM基础培养基，胎牛血清(FBS)，HaCaT细胞，胰蛋白酶，NaCl；主要设备：酶标仪；移液枪；十万分之一天平；多孔细胞培养板；超净工作台；细胞培养皿；NaCl溶液的制备：精密称取5.0000gNaCl粉末，溶于50mL MEM基础培养基中，混匀，过0.22μm滤膜备用。

HaCaT细胞：在超净工作台中，取F13代以前的HaCaT细胞复苏，在细胞培养皿中达到80％以上融合时进行消化、然后混匀计数之后，以5.0×103个/孔种96孔板，以每孔100μL的10％FBS的MEM培养液，37℃，5％CO2培养至细胞70％左右贴壁。

失水损伤细胞：将上述培养的HaCaT细胞分为2组，空白组和失水组，每组3个复孔，超净工作台中，使用真空泵或移液枪吸出2组中的培养基溶液，换成每孔100μl的10％无菌NaCl配制的新鲜MEM培养液，NaCl体系浓度控制在3.00％，37℃，5％CO₂培养0.5h。

细胞活力和AQP3基因的表达测定：细胞活力测定的方法与实施例1相同，使用Real-Time qPCR检测细胞的AQP3基因的表达。AQP3为水通道蛋白3，检测AQP3基因的表达用来验证失水损伤细胞的失水情况。

表4空白组和失水损伤细胞的OD₅₇₀、细胞活力和AQP3表达量

由上表可知，NaCl浓度为3.00％，培养时间为0.5h，各平行组活力值均在50％左右，符合40-65％的要求，与空白组相比，失水组的细胞活力下降48.93％，AQP3表达量下降21.76％，证明细胞失水模型中细胞确有失水损伤，同时验证了细胞活力值与细胞失水损伤的正相关，即本发明建立的细胞失水模型是成立的。

实施例6

与实施例1的测定步骤基本相同，不同之处在于修复细胞处理中，采用黄芩提取物1代替透明质酸钠溶液配制培养液，其中黄芩提取物1在培养液中的浓度为200μg/mL。

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表5和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，从中可以看出，B组的细胞活力均值在51.55％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在73.82％；待测化妆品黄芩提取物1的保湿功效为22.27％，保湿效果尚可。

表5各组OD570与细胞活力值

实施例7

与实施例1的测定步骤基本相同，不同之处在于修复细胞处理中，采用黄芩提取物2代替透明质酸钠溶液配制培养液，其中黄芩提取物2在培养液中的浓度为200μg/mL。

表6各组OD₅₇₀与细胞活力值

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表6和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，**表示p＜0.01，即存在的差异性显著。从中可以看出，B组的细胞活力均值在65.74％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在90.96％，与B组的差异性显著；待测化妆品透明质酸钠的保湿功效为25.22％，，保湿效果较好。

实施例8

与实施例1的测定步骤基本相同，不同之处在于修复细胞处理中，采用甘草提取物代替透明质酸钠溶液配制培养液，其中甘草提取物在培养液中的浓度为200μg/mL。

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表7和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，从中可以看出，B组的细胞活力均值在65.74％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在72.94％；待测化妆品甘草提取物的保湿功效为7.20％，保湿效果较差。

表7各组OD570与细胞活力值

实施例9

与实施例1的测定步骤基本相同，不同之处在于修复细胞处理中，采用灵芝提取物代替透明质酸钠溶液配制培养液，其中灵芝提取物在培养液中的浓度为200μg/mL。

表8各组OD570与细胞活力值

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表8和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，**表示p＜0.01，即存在的差异性显著。从中可以看出，B组的细胞活力均值在51.55％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在74.34％，与B组的差异性显著；待测化妆品透明质酸钠的保湿功效为22.79％，保湿效果较好。

实施例10

与实施例1的测定步骤基本相同，不同之处在于修复细胞处理中，采用四君子汤提取物代替透明质酸钠溶液配制培养液，其中四君子汤提取物在培养液中的浓度为200μg/mL。

结果分析：对A组、B组和C组的OD₅₇₀与细胞活力进行对比分析。如表9和图1所示，GraphPad_Prism t-test进行统计学分析，#表示p＜0.001，即存在的差异性极显著，**表示p＜0.01，即存在的差异性显著。从中可以看出，B组的细胞活力均值在51.55％，与A组的差异性极显著，C组的细胞活力均值在82.90％，与B组的差异性显著；待测化妆品透明质酸钠的保湿功效为31.35％，保湿效果较好。

表9各组OD₅₇₀与细胞活力值

本发明采用HaCaT细胞模拟生物皮肤，进行化妆品保湿功效测定，还原了生物皮肤载体，同时简化了人体试验的程序，测量的结果更加接近真实的结果，提高了测量结果的准确度。通过对多种化妆品及原料的测试，发现测试结果与文献报道的效果相同。