电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法
阅读说明：本技术 电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法 (Synthetic phase chromatographic analysis method of tocopherol acetate in electronic cigarette oil ) 是由 袁涛 蔡佳桐 徐潇 李剑政 于 2020-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明所提出的电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法,用于测定电子烟油中的生育酚乙酸酯；因为电子烟油中存在生育酚乙酸酯可能会对人体健康造成损害,所以在电子烟油生产和检验环节都需要快速的检测出其中是否有生育酚乙酸酯的存在以实现对电子烟油的质量控制；与已报道的气相色谱和液相色谱方法相比,采用合相色谱分析,时间更短；优化的色谱条件为HSS C18 SB色谱柱,3％甲醇97％CO-(2)作为洗脱溶剂,0.8mL/min的流速,2000psi背压；实验选用光电二极管阵列(PDA)检测器,在220nm波长下分析时检出时间为2分钟内,且流动相97％为CO-(2),对环境安全无污染,本方法快速灵敏,为电子烟的安全性检测提供了方法依据。(The synthetic phase chromatographic analysis method of the tocopherol acetate in the electronic cigarette oil is used for measuring the tocopherol acetate in the electronic cigarette oil; since the tocopherol acetate in the electronic cigarette oil may cause damage to human health, whether the tocopherol acetate exists in the electronic cigarette oil needs to be rapidly detected in the production and inspection links of the electronic cigarette oil so as to realize the quality control of the electronic cigarette oil; compared with the reported gas chromatography and liquid chromatography methods, the method adopts the combined phase chromatography analysis, and has shorter time; the optimized chromatographic conditions are HSS C18SB chromatographic column, 3% methanol and 97% CO 2 As an elution solvent, flow rate of 0.8mL/min, 2000psi back pressure; the test adopts a photodiode array (PDA) detector, the detection time is within 2 minutes when the test is analyzed at the wavelength of 220nm, and the mobile phase is 97 percent of CO 2 The method is safe and pollution-free to the environment, is quick and sensitive, and provides a method basis for the safety detection of the electronic cigarette.)
技术领域
本发明涉及电子烟油化学分析技术领域，尤其涉及一种电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法。
背景技术
近来，美国因吸食电子烟导致严重肺炎致死的病例逐渐增多，引发了人们对电子烟安全性的普遍担忧。美国疾病控制中心(CDC)的调查显示，在多个病人吸食的电子烟油中检测出生育酚乙酸酯；因此，电子烟油中的生育酚乙酸酯的快速灵敏分析对电子烟油的质量控制至关重要。常规的生育酚乙酸酯的分析方法包含气相色谱、气相色谱-质谱联用技术、正相液相色谱等。
气相色谱分析方法往往分析时间比较长，分析时间大于30min，正相液相色谱分析时间也至少需要10min，而且正相液相色谱分析需要消耗大量的有机溶剂。因此，迫切需要开发一种能够快速灵敏地分析生育酚乙酸酯的分析方法，以实现对电子烟油中生育酚乙酸酯的高通量、快速灵敏分析。
发明内容
针对上述技术中存在的如:还未有一种高效、快速测定电子烟油中生育酚乙酸酯的分析方法。
具体为一种电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法，用于测定电子烟油中的生育酚乙酸酯，其特征在于，包括以下步骤:
(1)电子烟油样品制备
称取电子烟油，用正庚烷与异丙醇的混合溶液作为溶剂A溶解定容，正庚烷与异丙醇加入的体积之比在8:2-0:10范围；也可以用正己烷与异丙醇的混合溶液作为溶剂A溶解定容，正己烷与异丙醇加入的体积之比在8:2-0:10范围；且电子烟油与溶剂A的体积比为1:10-1000；然后利用滤膜对溶解后的溶液进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取生育酚乙酸酯标准品，并采用所溶剂A稀释得到标准系列浓度为1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL的梯度标准工作液；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用检测器进行检测；
色谱条件：采用ACQUITY UPCC BEH(3.0mm×100mm，1.7μm)，ACQUITY UPCC BEH 2-Ethlpyridine(2.1mm×150mm，1.7μm)，Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)中的任意一种色谱柱；色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压1800-3000psi；流动相为助溶剂与超临界CO2按照一定比例等度洗脱，流速范围为0.5-1mL/min。
作为优选，在步骤(1)中，采用0.22μm尼龙滤膜过滤。
作为优选，在步骤(1)和步骤(2)中，异丙醇，正庚烷，正己烷均采用HPLC纯度。
作为优选，在步骤(3)中，所述助溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈中的一种，且其纯度为HPLC纯度。
作为优选，在步骤(3)中，采用二极管阵列检测器进行检测，外标法色谱峰面积定量。
作为优选，所述检测波长为220nm。
作为优选，在步骤(3)中，流动相为甲醇与超临界CO2按照质量比为2％:98％-7％:93％等度洗脱。
作为优选，在步骤(2)中，标准工作液的配制方法为:称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品加入50mL容量瓶中，用所述溶剂A定容至50mL得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液加入到10mL容量瓶中，再用所述溶剂A定容至10mL，得到标准系列浓度分别为1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL。
本发明的有益效果是:本发明所提出的电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法。因为电子烟油中存在生育酚乙酸酯可能会对人体健康造成损害，所以在电子烟油生产和检验环节都需要快速的检测出其中是否有生育酚乙酸酯的存在；故而本发明首次建立了测定电子烟油中的生育酚乙酸酯的合相色谱分析方法；采用合相色谱分析，分析时间较气相和液相都短；并且在色谱条件为HSS C18 SB色谱柱，3％甲醇97％CO2作为洗脱溶剂，0.8mL/min的流速，2000psi背压。实验选用PDA检测器，在220nm波长下分析时，保留时间1.65分钟，检出时间为2分钟内，可以实现批量样品的快速测定，且流动相97％为CO2，对环境安全无污染，为电子烟的安全性检测提供方法依据；也对药学和吸烟与健康方面的研究提供技术支持。
附图说明
图1为本发明实施例1的生育酚乙酸酯在三种不同的合相色谱柱的色谱图；
图2为本发明实施例2的生育酚乙酸酯在四种不同的洗脱溶剂下的色谱图；
图3为本发明实施例3的生育酚乙酸酯在不同流速下的合相色谱图；
图4为本发明实施例4的生育酚乙酸酯在不同背压下的合相色谱图；
图5为本发明实施例5的生育酚乙酸酯在不同比例洗脱溶剂下的合相色谱图。
具体实施方式
为了更清楚地表述本发明，下面结合实施例对本发明作进一步地描述。
首先，对于本发明的发明初衷和思路，正是近年来美国发生多起不明电子肺炎，美国疾病控制中心(CDC)的调查显示，在多个病人吸食的电子烟油中检测出生育酚乙酸酯；因此，电子烟油中生育酚乙酸脂的快速灵敏分析对电子烟油的安全性至关重要。那么，作为首次利用合相色谱分析方法建立了测定电子烟油中的生育酚乙酸酯的分析；应该广泛推广用于电子烟油质量检测。
在以下实施例中，所用仪器为Waters ACQULITY超高效合相色谱仪，配ACQULITYUPCC二极管阵列检测器(PDA)；生育酚乙酸酯标准样品购于Sigma-Aldrich，HPLC纯度。甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈均购于Merck，HPLC纯度；
实施例1
(1)电子烟油样品制备
称取0.1g电子烟油，用异丙醇溶剂定容至10mL容量瓶中，然后利用0.22μm滤膜进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品，用异丙醇溶剂定容至50mL容量瓶中得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液，再用异丙醇定容至10mL容量瓶中；得到标准系列溶液浓度为1-500μg/mL的标准工作液；比如浓度为1.0μg/mL、10.0μg/mL、20.0μg/mL、100.0μg/mL、500.0μg/mL的标准工作溶液；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用二极管阵列检测器(PDA)进行检测；
对于色谱柱的选择，设置有三个对照组，分别采用ACQUITY UPCC BEH(3.0mm×100mm，1.7μm)，ACQUITY UPCC BEH 2-Ethlpyridine(2.1mm×150mm，1.7μm)，Viridis HSSC18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；其余色谱条件相同，为：色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；流动相为甲醇与超临界CO2按照3％:97％等度洗脱，流速为0.8mL/min；其色谱图对照如图1所示；在合相色谱分析中，色谱柱对较短分析时间内分辨率和峰形影响较大；那么从图1可以看出，采用HSS C18 SB色谱柱其出峰时间短，分离效果好；
实施例2
(1)电子烟油样品制备
称取0.2g电子烟油，用正庚烷:异丙醇(8:2，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中，然后利用0.22μm尼龙滤膜进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品，用正庚烷:异丙醇(8:2，V/V)溶剂定容至50mL容量瓶中得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液，再用正庚烷:异丙醇(8:2，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用二极管阵列检测器(PDA)进行检测；
采用Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；在流动相的助溶剂选择中，设置有四个对照组进行实验，分别是甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇；其四种助溶剂与主体流动相(超临界流体CO2)按照3％:97％等度洗脱，流速为0.8mL/min；其色谱图如图2所示；UPCC的流动相主要是以CO2为主体的超临界流体，为了调整流动相的极性以及对目标物的溶解性，以适应对不同目标化合物的不同溶解性，有效改变目标化合物的峰型及保留时间，而甲醇、乙腈、乙醇、异丙醇作为极性不同的助溶剂，对相同浓度的样品溶液进行分离优化选择。从图2所示可见，看到用乙腈作为洗脱溶剂时，色谱出峰时间最慢，而且峰宽较大，不利于快速准确定量分析。利用乙醇和异丙醇作为洗脱溶剂，得到的色谱峰峰宽小，但相比于甲醇，保留时间更长。这是由于在合相色谱中，甲醇是洗脱能力最强的有机溶剂。因此甲醇作为助溶剂为最优选择。
实施例3
(1)电子烟油样品制备
称取0.5g电子烟油，用正己烷:异丙醇(8:2，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中，然后利用0.22μm滤膜进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品，用正己烷:异丙醇(8:2，V/V)溶剂定容至50mL容量瓶中得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液，再用正己烷:异丙醇(8:2，V/V)定容至10mL容量瓶中；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用二极管阵列检测器(PDA)进行检测；
采用Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；选用甲醇与超临界流体CO2按照3％:97％等度洗脱，在流速选择上设置有四组对照组；分别为0.5mL/min，0.6mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min；色谱图如图3所示；当超临界CO2作为流动相时，由于具有的低粘度和高的扩散系数，使它在分离过程具有较高的线速度，分析速度比传统高效液相色谱快3-10倍，分析时间短，而为了保证较好的灵敏度、合适的色谱柱压力；选用合适的流速尤为重要，从图3中可以看出，随着流速提高，分析时间逐渐缩短，但是柱压也会相应提高，故选用0.8mL/min的流速最优。
实施例4
(1)电子烟油样品制备
称取0.2g电子烟油，用正庚烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中，然后利用0.22μm滤膜进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品，用正庚烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至50mL容量瓶中得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液，再用正庚烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用二极管阵列检测器(PDA)进行检测；
采用Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；色谱柱温度为40℃，进样量1μL；选用甲醇与超临界流体CO2按照3％:97％等度洗脱，流速选择0.8mL/min；在背压的选择上，设置有5个对照组，其背压分别为1800psi，2000psi，2400psi，2800psi，3000psi，其色谱图如图4所示；超高效合相色谱中，动态背压(ABPR)是影响分离过程的重要因素之一，它主要作用是控制CO2在整个操作过程中维持超临界状态，因为在不同背压条件下，对样品的溶解能力不一样，当背压升高时，超临界流体密度增大，溶剂化能力增强，柱压升高。从图4中可以看出，随着背压升高，保留时间逐渐缩短，但是随着背压升高，CO2的消耗速度大大提高，需要考虑到CO2的消耗成本，所以2000psi的背压最为合适。
实施例5
(1)电子烟油样品制备
称取0.25g电子烟油，用正己烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中，然后利用0.22μm滤膜进行过滤，得电子烟油样品；
(2)标准工作溶液配制
称取52.0mg生育酚乙酸酯标准品，用正己烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至50mL容量瓶中得到母液；分别取10、100、200、1000、5000μL母液，再用正己烷:异丙醇(5:5，V/V)溶剂定容至10mL容量瓶中；
(3)合相色谱分析
采用超高效合相色谱仪对步骤(2)得到的标准工作溶液和步骤(1)得到的电子烟油样品进行浓度分析，利用二极管阵列检测器(PDA)进行检测；
采用Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；色谱柱温度为40℃，进样量1μL；系统背压2000psi；选用甲醇与超临界流体CO2按照3％:97％等度洗脱，流速选择0.8mL/min；在洗脱溶剂(甲醇与超临界流体CO2)的比例选择上设置有6个对照组；分别为2％:98％；3％:97％；4％:96％；5％:95％；6％:94％；7％:93％；其色谱图如图5所示；从图中可以看到，随着甲醇比例从2％提高到7％，生育酚乙酸酯的分析速度逐渐缩短，保留时间从2.1分钟缩短到1.2分钟。实验中，综合考虑溶剂消耗及实验时间，选取3％的甲醇，97％的CO2作为等度洗脱条件，保留时间在1.65分钟，能够实现在2分钟内，对生育酚乙酸酯的快速分析。
综上:当合相色谱分析选用为：色谱柱Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm)；色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；流动相为甲醇与超临界CO2按照3％:97％等度洗脱，流速为8mL/min时，其检出效果最好。与已有的液相色谱及气相色谱分析方法相比，该方法分析速度大大提升，有机溶剂消耗大幅减少。由于流动相中97％的成分是CO2，对环境安全无污染。该方法能够实现对电子烟中生育酚乙酸酯的快速灵敏分析，为电子烟的安全性检测提供方法依据。
方法学考察
选取上述六个梯度的标准工作溶液，按照最优色谱条件——色谱柱为ViridisHSS C18SB(2.1mm×150mm，1.8μm):色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；流动相为甲醇与超临界CO2按照3％:97％等度洗脱，流速为0.8mL/min进行测定，以生育酚乙酸酯的峰面积定量，生育酚乙酸酯的浓度与其峰面积在0-500.0μg/mL范围内呈线性关系，当信噪比为S/N＝3时，线性回归方程为y＝1351.0x-934.2，R2＝0.9999；检出限为0.2μg/mL。
并且在色谱分析条件为:色谱柱为Viridis HSS C18 SB(2.1mm×150mm，1.8μm):色谱柱温度为40℃，进样量1μL，系统背压2000psi；流动相为甲醇与超临界CO2按照3％:97％等度洗脱，流速为0.8mL/min时，随机在市场上购得6批次不同品牌的电子烟油，按照上述方法对每个样品平行测定3次，均未检出生育酚乙酸酯成分，加入标准溶液后，测得加标回收率在96.3-102.2％。
本发明的优势在于:
1)本发明建立了一种利用超高效合相色谱串接二极管阵列检测器同时快速检测电子烟油中生育酚乙酸酯的方法，能够准确地对电子烟油中的生育酚乙酸酯进行定性、定量，为电子烟油中生育酚乙酸酯的准确判定、快速检测提供科学依据；
2)本发明HSS C18 SB色谱柱(2.1mm×150mm，1.8μm)与CO2和甲醇按3％:97％为流动相的选择对电子烟油中生育酚乙酸酯达到了优异的分离效果；
3)实现在2分钟内，对样品的快速灵敏分析，方法检出限达0.2μg/mL；由于流动相中97％的成分是CO2，对环境安全无污染。
以上公开的仅为本发明的几个具体实施例，但是本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。
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