一种急性髓性白血病诊断、预后分子标志物Lnc-HEATR1-4及其应用
阅读说明：本技术 一种急性髓性白血病诊断、预后分子标志物Lnc-HEATR1-4及其应用 (Molecular marker Lnc-HEATR1-4 for acute myelogenous leukemia diagnosis and prognosis and application thereof ) 是由 曾添晟 赖国锋 陆家雯 梁美 冯雪 于 2021-08-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种急性髓性白血病诊断、预后分子标志物Lnc-HEATR1-4及其应用,核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。Lnc-HEATR1-4的表达水平可作为预测急性髓系白血病预后效果的独立因子,并且其在急性髓系白血病中的预后意义对仅接受化疗的患者仍有效。而且还发现相对于正常人群,急性髓系白血病患者中Lnc-HEATR1-4的表达量显著升高,说明Lnc-HEATR1-4可用于急性髓系白血病的诊断或辅助诊断。本发明为急性髓系白血病的诊断和治疗提供了新的思路,本发明鉴定出的Lnc-HEATR1-4基因可作为未来用于预测急性髓系白血病病人诊断、预后效果的有效指标。(The invention discloses an acute myelogenous leukemia diagnosis and prognosis molecular marker Lnc-HEATR1-4 and application thereof, wherein the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO. 1. The expression level of Lnc-HEATR1-4 can be used as an independent factor for predicting the prognosis effect of acute myeloid leukemia, and the prognosis significance in acute myeloid leukemia is still effective for patients receiving chemotherapy alone. Moreover, the expression level of Lnc-HEATR1-4 in acute myeloid leukemia patients is remarkably increased compared with that of normal people, which indicates that Lnc-HEATR1-4 can be used for diagnosis or auxiliary diagnosis of acute myeloid leukemia. The Lnc-HEATR1-4 gene identified by the invention can be used as an effective index for predicting the diagnosis and prognosis effects of patients with acute myeloid leukemia in the future.)
技术领域
本发明属于生物医学领域，具体涉及一种急性髓性白血病诊断、预后分子标志物Lnc-HEATR1-4及其应用。
背景技术
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一种致死的血液系统恶性肿瘤，具有预后差和死亡率高的特点。目前治疗AML的方法主要是化疗和骨髓移植。随着靶向治疗的进展，AML中许多基因突变已被用作预测其预后的分子标志物。近年来，大量研究表明了长链非编码RNA不仅参与正常细胞的各种生物过程，而且在肿瘤细胞中也起到重要的作用。例如，lncRNA HOTTIP在AML中的异常激活会改变HOXA驱动的拓扑相关结构域和基因表达，进而对肿瘤的发生发展产生影响。除此之外，lncRNA KCNQ1OT1通过吸附AML中的microRNA miR-193a-3p，诱导Tspan3的表达，促进AML细胞增殖。然而在AML中，仍有大量的lncRNA的功能未被阐明。本发明通过对TCGA数据库的挖掘，鉴定出一种长链非编码RNALnc-HEATR1-4在AML中具有预后意义，并通过分析ceRNA网络探讨Lnc-HEATR1-4在AML中的临床意义并进一步揭示其潜在作用机制。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以有效预测急性髓系白血病诊断、预后的标志物。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供一种急性髓性白血病(AML)患者诊断、预后用的生物标志物，所述生物标志物为Lnc-HEATR1-4(别名ENSG00000273058)，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
TGCATACCTCATGGCCAGGATATCTGCAATAGCTGCAAACCACTATGAGTTCTTTGGAAAGAGACACAAGAAGGTTCGAGGCCACACTAGGCCCAAAGCCAATGCTGACGGAGACAATGACAAGCACTCACTGCCTCTGAAGGAAACTCCACGTTAAGCCACGCCCCCACACCTGGGATTCCAGGGCCTGCTCTTCTCTGCTGGACTCCCAGACTGCAACCCAGACTGCACTGTTAGAAACCAGAGAACTGCATGATCATGAGGATGAGTGGGTGCCTGTGGGTCTTCAAGACATGGCATCCACCTGCCGTGGACCAGTCCAGTCTGCAGGCGTGGACTCTGACAGCTGGCTCCACCCAGTATTCAGGTCTCAACCTGCACCCTCACTGCCCAGAACCCAGCCCTTTTTTTCTGGGACCTGCCACACTGCCAGATCTTGTCATTCCCCTTCCCCAGAGATGACTACACTGTCTTCCCAGTCCACTGGCTGGGGACCTGTGCTATGTGGCTGCCTCTCCTGCATCACAACCATCTGCCTCCATCTAGAGCATCTGACCAGGATGTACAGCCCACACACCGTTAAGCCTCACACTAAGCTCACTCAAATTACGATGTGCATGGTAAAACCTACCCAAGGTACTTCTGATTGTCAAGAAATAAGAAATAAAATAAGACGGGCCACAGAAAAGTGGTTATAAATTGGTGGCTCCTAAACCGAAATCGCCTTGAGGCACAGCCTCCTCTGTGGAGCCTTCTTCAAGCTCCCTGGGCTGCTGAGTCAGCCCCTCTCAGAGGGTTCATGATAGCACTTTGGATTCTGTTTGTTTGCATGTAGCTTTG。
本发明的第二方面，提供Lnc-HEATR1-4在(I)～(III)中的任意一种中的应用：
(I)制备检测或辅助检测急性髓系白血病预后产品；
(II)制备预测或辅助预测急性髓系白血病患者接受治疗后的生存时间产品；
(III)制备检测或辅助检测急性髓系白血病产品。
本发明的第三方面，提供定量检测Lnc-HEATR1-4的物质在(I)～(III)中的任意一种中的应用：
(I)制备检测或辅助检测急性髓系白血病预后产品；
(II)制备预测或辅助预测急性髓系白血病患者接受治疗后的生存时间产品；
(III)制备检测或辅助检测急性髓系白血病产品。
在本发明的一些实施方式中，所述物质在基因水平上定量检测Lnc-HEATR1-4。
在本发明的一些实施方式中，所述物质为在基因水平上定量检测Lnc-HEATR1-4的试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测Lnc-HEATR1-4基因表达水平的物质包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术或免疫测定的方法检测标志物基因表达水平的试剂和/或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述定量检测Lnc-HEATR1-4基因表达水平的试剂包括引物、探针、基因芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述预后为接受化疗治疗的预后。
本发明的第四方面，提供一种产品，包含本发明第三方面所述定量检测Lnc-HEATR1-4的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒。
在本发明的一些实施方式中，所述物质在基因水平上定量检测Lnc-HEATR1-4。
在本发明的一些实施方式中，所述物质为在基因水平上定量检测Lnc-HEATR1-4的试剂和/或仪器。
本发明的第六方面，提供一种筛选治疗急性髓系白血病药物的方法，通过检测给药前后急性髓系白血病患者Lnc-HEATR1-4的表达量。
本发明的第七方面，提供抑制Lnc-HEATR1-4表达的物质在制备治疗或辅助治疗急性髓系白血病中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明鉴定出一种新的急性髓系白血病生物标志物Lnc-HEATR1-4，Lnc-HEATR1-4的表达水平可作为预测急性髓系白血病预后效果的独立因子，并且其在急性髓系白血病中的预后意义对仅接受化疗的患者仍有效。而且还发现相对于正常人群，急性髓系白血病患者中Lnc-HEATR1-4的表达量显著升高，说明Lnc-HEATR1-4可用于急性髓系白血病的诊断或辅助诊断。本发明为急性髓系白血病的诊断和治疗提供了新的思路，本发明鉴定出的Lnc-HEATR1-4基因可作为未来用于预测急性髓系白血病病人诊断、预后效果的有效指标。
附图说明
图1为Lnc-HEATR1-4在不同组织类型，不同ELN分型和不同细胞遗传学分型中的表达。其中图1A为Lnc-HEATR1-4在AML队列中显著高表达；图1B为使用ELN分层系统将AML患者分为三组，方差分析显示三组之间的Lnc-HEATR1-4表达水平不存在显著差异；图1C为使用细胞遗传学方法对AML患者进行分组，方差分析显示伴有RUNX1-RUNX1T1突变的AML患者和伴有CBFB-MYH11突变的AML患者具有显著降低的Lnc-HEATR1-4表达。
图2为Lnc-HEATR1-4的表达对AML患者生存期的影响。图2A为Lnc-HEATR1-4的低表达与AML患者的较长的总生存期相关；图2B为Lnc-HEATR1-4表达水平的高低对AML患者的无事件生存期无显著影响；图2C为在小儿白血病数据集中，Lnc-HEATR1-4表达水平较低的患者具有较长的总生存期；图2D为在小儿白血病数据集中，AML患者的无事件生存期在高低表达组中无显著差异。
图3为Lnc-HEATR1-4表达水平对接受治疗后的AML患者的预后影响。图3A为在化疗组中，Lnc-HEATR1-4低表达的患者具有更长的总生存期；图3B为在化疗组中，Lnc-HEATR1-4低表达的患者具有更长的无事件生存期；图3C为在移植组中，Lnc-HEATR1-4的表达水平高低无法影响患者的总生存期；图3D为在移植组中，Lnc-HEATR1-4的表达水平高低无法影响患者的无事件生存期。
图4为Lnc-HEATR1-4在AML中的作用机制探讨。图4A为差异基因火山图；图4B为差异基因个数统计柱状图；图4C为差异基因功能富集图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
AML：Acute myeloid leukemia急性髓系白血病。
LncRNA：long non-coding RNA长链非编码RNA。
TCGA：The Cancer Genome Atlas癌症基因组图谱。
GTEx：Genotype-Tissue Expression Project基因型组织表达项目。
OS：overall survival总生存期。
EFS：event-free survival无事件生存期。
WBC：white blood cell白细胞。
PB：Peripheral blood外周血。
BM：Bone Marrow骨髓。
ELN:European LeukemiaNet欧洲白血病网。
DEGs:Differential expressed genes差异表达基因。
FDR：false discovery rate错误发现率。
FC：fold change差异倍数。
Endocytosis：内吞作用。
lymphocyte activation：淋巴细胞激活。
regulation of small GTPase mediated signal transduction：调节小GTPase介导的信号转导。
实施例1 Lnc-HEATR1-4的鉴定手段和数据分析方法
研究队列：
发明人从TCGA(https://www.cancer.gov/)数据库下载了151个AML患者的转录组测序数据集和相应临床信息，正常对照人群的表达谱从GTEx数据库下载。剔除了M3型患者15例，剩下共136名具有完整Lnc-HEATR1-4表达谱的AML患者纳入后续分析，其中Lnc-HEATR1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
TGCATACCTCATGGCCAGGATATCTGCAATAGCTGCAAACCACTATGAGTTCTTTGG AAAGAGACACAAGAAGGTTCGAGGCCACACTAGGCCCAAAGCCAATGCTGACGGAGACAATGACAAGCACTCACTGCCTCTGAAGGAAACTCCACGTTAAGCCACGCCCCCACACCTGGGATTCCAGGGCCTGCTCTTCTCTGCTGGACTCCCAGACTGCAACCCAGACTGCACTGTTAGAAACCAGAGAACTGCATGATCATGAGGATGAGTGGGTGCCTGTGGGTCTTCAAGACATGGCATCCACCTGCCGTGGACCAGTCCAGTCTGCAGGCGTGGACTCTGACAGCTGGCTCCACCCAGTATTCAGGTCTCAACCTGCACCCTCACTGCCCAGAACCCAGCCCTTTTTTTCTGGGACCTGCCACACTGCCAGATCTTGTCATTCCCCTTCCCCAGAGATGACTACACTGTCTTCCCAGTCCACTGGCTGGGGACCTGTGCTATGTGGCTGCCTCTCCTGCATCACAACCATCTGCCTCCATCTAGAGCATCTGACCAGGATGTACAGCCCACACACCGTTAAGCCTCACACTAAGCTCACTCAAATTACGATGTGCATGGTAAAACCTACCCAAGGTACTTCTGATTGTCAAGAAATAAGAAATAAAATAAGACGGGCCACAGAAAAGTGGTTATAAATTGGTGGCTCCTAAACCGAAATCGCCTTGAGGCACAGCCTCCTCTGTGGAGCCTTCTTCAAGCTCCCTGGGCTGCTGAGTCAGCCCCTCTCAGAGGGTTCATGATAGCACTTTGGATTCTGTTTGTTTGCATGTAGCTTTG。
此外，也从TCGA数据库下载了这136例患者的microRNA测序数据用于后续分析。该队列的临床特征资料包括治疗手段、年龄、性别、白细胞(WBC)、外周血母细胞(PB blast)、骨髓母细胞(BM blast)、FAB分型等特征(如表1所示)。作为验证，在TCGA数据库中下载了190例儿童白血病患者的完整生存数据。
统计分析：
根据Lnc-HEATR1-4的表达中位数，将136例AML患者分为两组。使用Wilcoxon-Mann-Whitney检验对数值型变量进行分析，使用卡方检验对分类型变量进行分析。采用Kaplan-Meier和log-rank test进行总生存期(OS)和无事件生存期(EFS)的分析。所有的统计分析都在R语言(version 4.0)上进行。
差异基因和功能分析：
采用DEGseq2对差异基因进行分析，差异基因分析阈值为FDR<0.05和|logFC|>1.5。差异基因功能富集分析采用Metascape(http://metascape.org/)进行分析及注释。
实施例2 Lnc-HEATR1-4高表达组和Lnc-HEATR1-4低表达组临床特征和分子特征的差异比较
根据AML患者的Lnc-HEATR1-4表达中位数，将136名患者分为Lnc-HEATR1-4高表达组和Lnc-HEATR1-4低表达组，每组包含68名患者，其临床特征和分子特征如表1所示。如表1可知，比较两组患者的临床特征和分子特征显示，在年龄特征上，在<60岁的患者组中，Lnc-HEATR1-4以高表达为主；而在>60岁的患者组中，Lnc-HEATR1-4以低表达为主(p＝0.039)。但在具有复杂细胞遗传学特征的人群中，Lnc-HEATR1-4以高表达为主(p＝0.023)。此外，RUNX1-RUNX1T1基因融合现象更倾向于发生在Lnc-HEATR1-4低表达组(p＝0.02)。KRAS基因也是在Lnc-HEATR1-4低表达组的突变频率与在Lnc-HEATR1-4高表达组的突变频率相比显著提高(p＝0.038)。而TP53基因突变则是在Lnc-HEATR1-4高表达组中出现的频率更高(p＝0.012)。其他临床特征例如治疗方式、性别、白细胞计数(white blood cell,WBC)、外周血原始细胞计数(peripheral blood blasts,PB_blasts)、骨髓原始细胞计数(Bone Marrowblasts,BM_blasts)以及其他突变特征例如FLT3-ITD、IDH1/2等在Lnc-HEATR1-4高表达组和AC107398.2低表达组的分布没有显著性差异。
表1 136例AML患者的临床特征和分子特征
注：标*表示p值具有显著意义(一般p<0.05，结果具有显著意义，p值越小，结果越显著)。
实施例3 Lnc-HEATR1-4在AML中显著高表达
为了分析Lnc-HEATR1-4在AML中的表达情况，本实施例对151例AML患者和70例正常人群中的Lnc-HEATR1-4表达水平进行分析，结果显示Lnc-HEATR1-4在AML中的表达显著高于正常人群(图1A，p<2.22e-16)，说明Lnc-HEATR1-4可用于急性髓系白血病的诊断或辅助诊断。
进一步将AML患者根据ELN分型系统进行分类，共分为三组，分别为预后良好组，预后中等组和预后不良组。再分别对三组的Lnc-HEATR1-4表达水平进行分析，结果显示三组之间的Lnc-HEATR1-4表达水平不存在显著差异(图1B，p＝0.068)。
还根据不同的细胞遗传学分类将AML患者分为八组，并对八组的Lnc-HEATR1-4表达水平进行分析，方差分析结果显示Lnc-HEATR1-4的表达在伴有RUNX1-RUNX1T1突变的AML患者和伴有CBFB-MYH11突变的AML患者中显著降低(图1C，p＝0.00044)。
实施例4 Lnc-HEATR1-4的表达可有效预测AML患者的总生存期
为了探讨Lnc-HEATR1-4的表达在AML中的预后价值，本实施例将136名AML患者根据Lnc-HEATR1-4表达的高低分为两组，并分别对两组患者的总生存期和无事件生存期进行生存曲线分析，结果表明，与Lnc-HEATR1-4高表达组相比，Lnc-HEATR1-4低表达组的患者具有更长的总生存期(图2A，p＝0.0324)，而无事件生存期无显著差异(图2B，p＝0.859)。作为验证，对另一个包含了190名儿童白血病患者的队列进行上述分析，结果显示Lnc-HEATR1-4低表达的AML患者具有更高的总生存期(图2C，p＝0.0293)，但无事件生存期与Lnc-HEATR1-4的高低表达无关(图2D，p＝0.21)，这结果与在TCGA-AML队列中的结果一致。
实施例5 Lnc-HEATR1-4的预后意义在接受化疗的AML患者中更为显著
由于目前临床上针对AML的治疗手段主要是化疗和骨髓移植，并且进行骨髓移植的患者通常具有较低的复发率，因此本实施例进一步将136名AML患者根据他们接受治疗的方式不同分为化疗组和移植组。结果显示，在化疗组中，Lnc-HEATR1-4的低表达与更长的总生存期显著相关(图3A，p＝0.000614)，同样的，Lnc-HEATR1-4低表达的患者也预示着具有更长的无事件生存期(图3B，p＝0.0313)。但在移植组中，对于Lnc-HEATR1-4的表达与总生存期和无事件生存期之间均无显著差异(图3C，p＝0.778；图3D，p＝0.252)。这说明Lnc-HEATR1-4作为AML的预后标志物在仅接受化疗的患者中具有更高的敏感性，其预后意义也更显著。
实施例6 Lnc-HEATR1-4在AML中的潜在作用机制
为了进一步探索Lnc-HEATR1-4在AML中的作用机制，本实施例使用DEGseq2分别对Lnc-HEATR1-4高低表达组进行差异基因分析，阈值为FDR<0.05和|logFC|>1.5。结果显示1364个上调基因和687个下调基因被鉴定为差异基因(图4A)。对这些差异基因进行汇总后，发现差异基因主要是编码蛋白基因(图4B)。使用metascape(http://metascape.org/)对这些差异基因进行功能富集，发现这些基因富集在“endocytosis”，“lymphocyteactivation”和“regulation of small GTPase mediated signal transduction”信号通路(图4C)，而这些通路都已经证明对癌症的发生发展有重要作用，说明Lnc-HEATR1-4可能通过参与这些信号通路对AML进行调控。
综上所述，Lnc-HEATR1-4是一个可信的AML预后生物标志物，AML患者具有较低水平的Lnc-HEATR1-4表达预示着其具有更长的生存期。Lnc-HEATR1-4在AML中的预后意义在仅接受化疗的AML患者中尤为突出，但其预后效能可能会在患者接受骨髓移植后被削弱。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州齐凯生物科技有限公司
<120> 一种急性髓性白血病诊断、预后分子标志物Lnc-HEATR1-4及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> Lnc-HEATR1-4
<400> 1
tgcatacctc atggccagga tatctgcaat agctgcaaac cactatgagt tctttggaaa 60
gagacacaag aaggttcgag gccacactag gcccaaagcc aatgctgacg gagacaatga 120
caagcactca ctgcctctga aggaaactcc acgttaagcc acgcccccac acctgggatt 180
ccagggcctg ctcttctctg ctggactccc agactgcaac ccagactgca ctgttagaaa 240
ccagagaact gcatgatcat gaggatgagt gggtgcctgt gggtcttcaa gacatggcat 300
ccacctgccg tggaccagtc cagtctgcag gcgtggactc tgacagctgg ctccacccag 360
tattcaggtc tcaacctgca ccctcactgc ccagaaccca gccctttttt tctgggacct 420
gccacactgc cagatcttgt cattcccctt ccccagagat gactacactg tcttcccagt 480
ccactggctg gggacctgtg ctatgtggct gcctctcctg catcacaacc atctgcctcc 540
atctagagca tctgaccagg atgtacagcc cacacaccgt taagcctcac actaagctca 600
ctcaaattac gatgtgcatg gtaaaaccta cccaaggtac ttctgattgt caagaaataa 660
gaaataaaat aagacgggcc acagaaaagt ggttataaat tggtggctcc taaaccgaaa 720
tcgccttgag gcacagcctc ctctgtggag ccttcttcaa gctccctggg ctgctgagtc 780
agcccctctc agagggttca tgatagcact ttggattctg tttgtttgca tgtagctttg 840