3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途
阅读说明：本技术 3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途 (Application of 3-epioleanolic acid in preparation of medicine for preventing and/or treating new coronavirus infection ) 是由 张晗 苗琳 张敏 王彧 陈璐 张俊华 王跃飞 李霖 闫慧敏 杨柳 于 2021-10-08 设计创作，主要内容包括：本申请提供了3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途。3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合,从而能够用于预防和/或治疗新冠病毒感染,进而用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。进一步地,包含3-表齐墩果酸的药物组合物,同样能够用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。(The application provides application of 3-epioleanolic acid in preparing a medicament for preventing and/or treating new coronavirus infection. The 3-epioleanolic acid can inhibit the combination of the S protein of the new coronavirus and ACE2, so that the 3-epioleanolic acid can be used for preventing and/or treating the infection of the new coronavirus, and further can be used for preparing a medicine for preventing and/or treating the infection of the new coronavirus. Further, the pharmaceutical composition comprising 3-epioleanolic acid can also be used for preparing a medicament for preventing and/or treating new coronavirus infection.)
技术领域
本申请涉及医药技术领域，特别是涉及3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途。
背景技术
新型冠状病毒(SARS-CoV-2，简称新冠病毒)具有强传染性和高致病性，对人类健康构成重大威胁。SARS-CoV-2是一种新型β属冠状病毒，其传播方式推测是由动物传人，再进行人际传播；呼吸道飞沫和密切接触传播是主要传播途径，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下中存在经气溶胶传播的可能。随着疫情的快速发展，研发抗新型冠状病毒的药物迫在眉睫。
SARS-CoV-2病毒可以通过刺突糖蛋白(spike，S蛋白)与呼吸系统血管紧张素转化酶(ACE2)结合感染细胞，新型冠状病毒表面的S蛋白是病毒识别靶细胞上相应受体的关键蛋白，其与人细胞表面的ACE2有效结合，导致新型冠状病毒肺炎(COVID-19，简称新冠肺炎)和急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，部分患者病情在短期内发生急剧变化，并出现多脏器衰竭甚至死亡。新冠病毒S蛋白分为S1和S2两个亚基，S1亚基包括N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)，其中CTD具有受体识别与结合的功能，也称为受体结合结构域(RBD)；ACE2是一种肽酶，属于Ⅰ型跨膜蛋白，在肺组织中主要分布于Ⅱ型肺泡细胞，少量分布于Ⅰ型肺泡细胞、气道上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞和巨噬细胞；S1亚基上的RBD结构域负责与宿主细胞上的ACE2结合，进一步与宿主的细胞膜融合从而感染人体。因此阻断S蛋白与ACE2的结合成为了治疗COVID-19的重点方向之一，通过阻断或竞争性抑制S蛋白和ACE2的结合从而达到阻止病毒感染人体的目的。
相对2003年SARS-CoV病毒疫情的高爆发，SARS-CoV-2引起的肺炎疫情受到了更好的控制，但缺乏特异性治疗药物仍是一大问题。虽然洛匹那韦与利托那韦已被用于临床新冠肺炎的治疗中，但由于其副作用大，寻找新的安全特异性药物迫在眉睫。以阻断S蛋白RBD或ACE2和/或抑制二者结合为靶点是筛选和鉴定抗SARS-COV-2的中药手段和方法。
目前，对于3-表齐墩果酸的研究报道并不多见，已有研究表明，3-表齐墩果酸可能是胰高血糖素样肽-1(CLP-1)的受体激动剂，有潜在的抑制肥胖作用；可以刺激豚鼠子宫肌条的收缩，具有良好的子宫收缩活性；还具有抗炎作用；但3-表齐墩果酸的其他药理作用尚不明确。
发明内容
本申请的发明人通过深入研究，发现3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，从而可以用来预防和/或治疗新冠病毒感染，并基于此完成了本申请。
本申请的第一方面提供3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途。
本申请的第二方面提供一种用于预防和/或治疗新冠病毒感染的药物组合物，其包含3-表齐墩果酸。
3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，从而能够用于预防和/或治疗新冠病毒感染，进而用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。进一步地，包含3-表齐墩果酸的药物组合物，同样能够用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
图1为3-表齐墩果酸对S蛋白与ACE2受体结合的抑制率结果，其中A图为以3-表齐墩果酸的浓度为横坐标的抑制率结果；B图为以lg(3-表齐墩果酸的浓度)为横坐标的抑制率结果。
图2为3-表齐墩果酸抑制假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞的结果，其中A图为3-表齐墩果酸抑制假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞的荧光素酶活性结果，B图为以lg(3-表齐墩果酸的浓度)为横坐标，3-表齐墩果酸抑制假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞的抑制率结果。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员基于本申请所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
本申请的第一方面提供3-表齐墩果酸在制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物中的用途。
发明人在研究中发现，本申请的3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，从而能够用于预防和/或治疗新冠病毒感染，进而用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。
本申请中，术语“治疗”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对已经罹患新冠病毒感染的哺乳动物个体(优选为人)采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生治疗、治愈、缓解、减轻等作用。类似地，如本文使用的，术语“预防”具有其一般含义，并且在本文特别地是指对可能罹患新冠病毒感染或者对新冠病毒感染具有罹患风险的哺乳动物个体采用本申请的药物进行处理，以期对所述疾病产生防止、预防、阻止、隔断等作用。
在本申请第一方面的一些实施方式中，所述新冠病毒感染包括由新冠病毒感染引起的肺炎和急性呼吸窘迫综合征中的至少一种。
在本申请第一方面的一些实施方式中，3-表齐墩果酸通过抑制新冠病毒S蛋白和宿主ACE2结合，从而预防和/或治疗新冠病毒感染。
本申请的第二方面提供一种用于预防和/或治疗新冠病毒感染的药物组合物，其包含3-表齐墩果酸。
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述3-表齐墩果酸是以单体的形式提供，或以包含其的植物提取物的形式提供。
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述植物提取物选自汉桃叶提取物、半枝莲提取物和马鞭草提取物中的至少一种。
本申请所述的汉桃叶提取物、半枝莲提取物、马鞭草提取物的提取方式现有技术中多有报道，本申请对各药物提取物的提取方式没有特别限制，本领域技术人员可以通过现有的任意方式获取包含3-表齐墩果酸的汉桃叶提取物、半枝莲提取物或马鞭草提取物。在一种实施方式中，示例性地，可以将马鞭草用70-80％乙醇溶液进行加热回流提取，得到包含3-表齐墩果酸的马鞭草提取物。
在本申请第二方面的一些实施方式中，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体或赋形剂。
本文中，“药学上可接受的”表示当以通常用药剂量使用时没有实质的毒性作用，从而可被政府或与其相当的国际组织批准或者已被批准用于动物，更特别地用于人，或者被登录在药典上。
本申请药物组合物中可用的“药学上可接受的载体或赋形剂”可以是药物制剂领域中任何常规的载体，特定载体的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态。用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学上可接受的载体或赋形剂包括药学领域常规的溶剂、稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、助悬剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂、水合剂、乳化加速剂、缓冲剂、吸收剂、着色剂、离子交换剂、脱模剂、涂布剂、矫味剂和抗氧化剂等。必要时，还可以在药物组合物中加入香味剂、防腐剂和甜味剂等。
如本文使用的，术语“药物组合物”具有其一般含义。此外，本申请的“药物组合物”还可以以保健品、功能性食品、食品、食品添加剂等形式存在或提供。可采用制药领域特别是制剂领域中的常规技术，通过药品生产中常用的提取分离纯化手段得到本申请的药物组合物的原料的有效成分，任选地与一种或更多种药学可接受的载体或赋形剂混合，然后形成所需的剂型，来制备本申请的药物组合物。根据本申请的药物组合物，其为可以适用于口服给药的药物制剂、适用于胃肠外注射(例如静脉注射、皮下注射)的药物制剂(例如溶液剂)、适用于表面给药的药物制剂(例如软膏剂、贴剂或乳膏剂)、或适用于直肠给药的药物制剂(例如栓剂)等。用于口服施用的剂型可包括例如片剂、丸剂、滴丸剂、硬或软胶囊剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、酊剂、糖浆剂、散剂、粉剂、细粒剂、颗粒剂、小丸剂、酏剂等，并不限于此。除了活性成分外，这些制剂还可包含稀释剂(例如乳糖、右旋糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和甘氨酸)、润滑剂(例如二氧化硅、滑石、硬脂酸或其镁盐、钙盐和聚乙二醇)。片剂还可包含粘合剂，例如硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷。必要时，其还可包含药用添加剂，例如崩解剂(如淀粉、琼脂、海藻酸或其钠盐)、吸收剂、着色剂、香味剂、甜味剂等。片剂可根据常用的混合、造粒或包衣的方法制备。
本申请药物组合物以3-表齐墩果酸计的药学可接受的剂量，即施用剂量，可以根据待治疗对象的年龄、性别和体重、待治疗的具体疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、施用途径和诊断者的判断而改变。考虑这些因素确定施用剂量在本领域技术人员的水平范围内。一般的剂量可以是0.01-1000mg/kg/日，具体地1-100mg/kg/日。然而，本公开的范围不以任何方式受限于所述施用剂量。
以下结合具体实施例对本申请进行详细说明。
3-表齐墩果酸(3-Epioleanolic acid，CAS号：25499-90-5)，购自上海源叶生物科技有限公司，结构式如下所示：
下述实施例中所用实验材料和方法，如无特别说明，均为常规材料和方法。
实施例1分子对接法预测3-表齐墩果酸与S蛋白、ACE2受体的相互作用
小分子配体3-表齐墩果酸的准备：从http://www.chemspider.com/中下载3-表齐墩果酸的3D结构；补全结构：采用Discovery Studio 2020软件，展开工具栏中SmallMolecules/Prepare or Filter Ligands，点击Prepare Ligands，通过此操作产生三维结构，加氢，产生异构体等；优化结构：展开工具栏中Small Molecules/Minimize Ligands，点击Full Minimization(参数一般使用默认)；将上述优化后的小分子结构保存。
大分子受体准备：从蛋白质数据库中(http://www.rcsb.org/)下载S蛋白-ACE2受体复合物的3D结构，PDB编号为：6LZG(分辨率:2.50A°)；大分子的优化处理：打开DiscoveryStudio2020软件，展开工具栏中Macromolecules/Prepare Protein/Manual Preparation，点击clean protein，展开工具栏中Macromolecules/Prepare Protein/AutomaticPreparation，点击prepare protein，删除水分子，杂原子，加氢，去水，补全结构，质子化状态设定等；将优化后的受体结构另存为“6LZG+prep”文件。
定义受体的活性中心：已有研究报道，SARS-CoV-2病毒的S蛋白可与人类ACE2受体结合，从而使病毒入侵人体。本实施例中首先分析了S蛋白-ACE2受体复合物中S蛋白与ACE2之间的蛋白-蛋白相互作用(PPI)，确定了可能破坏S蛋白与ACE2的结合的位点(site)；如表1所示，二者结合界面上的作用位点可分为三个区域，三个区域包括六个结合位点，按照不同结合位点所在的氨基酸位置分别定义活性中心，即S-site1、S-site2、S-site3、ACE2-site1、ACE2-site2、ACE2-site3，将定义活性中心后的受体结构另存为“6LZG+prep+active”文件。
表1
根据表1确定S蛋白-ACE2受体复合物相互结合的活性位点：根据S蛋白-ACE2受体之间的相互作用，结合位点可分为三个区域，分别为Site1、Site2和Site3；Site1区域由S蛋白上的TYR449、GLY496、GLN498、THR500、ASN501、GLY502、TYR505残基与ACE2受体表面的GLN42、LYS353、GLY354、ASP355残基相互作用组成；Site2区域由S蛋白上的LYS417、GLN493、LEU455残基与ACE2受体表面的ASP30和HIS34残基相互作用组成；Site3区域由S蛋白上的GLU484、PHE486、ASN487、TYR489残基与ACE2受体表面上的GLN24、PHE28、LYS31、MET82、TYR83残基相互作用组成。
对3-表齐墩果酸已经优化的结构分别与S蛋白-ACE2复合物定义的活性中心执行CDOCKER分子对接；保存其对接结果的2D图并进行分析；以结合能(INTERACTION ENERGY)作为评分，通常，结合能的值越低，化合物与S蛋白-ACE2之间形成稳定复合物的结合亲和力越强，因此显示出很强的抑制S蛋白-ACE2的结合作用。3-表齐墩果酸与ACE2、S蛋白的结合能结果见表2，结果显示，3-表齐墩果酸可以分别与ACE2的三个位点结合，其中与site2位点结合较好，结合能的值为-29.0597kJ/mol；3-表齐墩果酸可以分别与S蛋白的两个位点结合，其中与site1位点结合较好，结合能的值为-26.4275kJ/mol。
表2
3-表齐墩果酸与SARS-CoV-2表面S蛋白、ACE2受体对接的氨基酸残基见表3；其中3-表齐墩果酸，在site1与ACE2蛋白残基LYS353形成氢键和电荷作用、与残基TYR41形成Alkyl及Pi-Alkyl疏水作用；与S蛋白残基ASN501、THR500分别形成氢键。在site2与ACE2蛋白残基LYS31形成氢键和电荷作用、与残基HIS34形成Pi-Alkyl疏水作用；与S蛋白残基ARG403形成Alkyl及Pi-Alkyl疏水作用、与残基LYS417、TYR453、LEU455分别形成电荷作用。在site3与ACE2蛋白残基MET82、TYR83、ILE21分别形成氢键及Pi-Alkyl疏水作用；与S蛋白不结合，无相互作用。结果表明，3-表齐墩果酸可以与S蛋白位点、ACE2受体位点结合。
表3
实施例2 3-表齐墩果酸对S蛋白与ACE2受体结合的影响
SARS-CoV-2中和性抗体检测试剂盒，其原理是：本试剂盒是一种中和抗体阻断ELISA(酶联免疫吸附)检测工具，包含两个关键成分：HRP(辣根过氧化物)标记的重组SARS-CoV-2RBD片段和人类ACE2受体蛋白(hACE2)；利用新冠病毒S蛋白结合结构域RBD抗原和受体蛋白ACE2抗原之间的结合，模拟病毒与宿主细胞的相互作用，通过显色反应判断病毒感染情况，但当中和抗体存在时，便会阻断S蛋白和ACE2受体的相互作用，显色反应减弱。
1)单体成分的溶解：用二甲基亚砜(DMSO，北京索莱宝科技有限公司)溶解3-表齐墩果酸并配成浓度分别为100mM(mmol/L)、80mM、60mM、50mM、30mM的单体溶液；2)采用SARS-CoV-2中和性抗体检测试剂盒(Cat.No.:L00847-A，南京金斯瑞生物科技有限公司)，使用前恢复至室温；3)用试剂盒内的样品稀释液按照1:9比例稀释3-表齐墩果酸的单体溶液、试剂盒内的阳性对照和阴性对照，稀释后的3-表齐墩果酸浓度分别为10mM、8mM、6mM、5mM、3mM；4)将稀释后的各单体溶液、阴性对照和阳性对照，分别与辣根过氧化物标记的重组SARS-CoV-2RBD片段(HRP-RBD)按照1:1体积混合，制备出100μL各复合物混合液，37℃孵育30分钟；5)在包被了ACE2的酶标板中分别加入100μL各复合物混合液，得到各单体给药组、阴性对照组和阳性对照组，用盖板膜盖板，然后在37℃孵育15分钟；其中，各单体给药组的3-表齐墩果酸的终浓度分别为5mM、4mM、3mM、2.5mM、1.5mM；6)取下盖板膜，并用260μL 1×洗液洗板4次；7)每孔中加入100μL TMB Solution,在20-25℃避光孵育15分钟；8)每孔中添加50μL终止液终止反应；9)终止后立即用酶标仪(帝肯(上海)贸易有限公司，型号：INFINITEF50)在450nm处测量吸光度值(OD)。
根据吸光度值，通过公式：抑制率＝1-单体给药组的吸光度值/阴性对照组的吸光度值×100％，计算得到3-表齐墩果酸对S蛋白与ACE2受体结合的抑制率；其中，以3-表齐墩果酸的浓度(mM)为横坐标，抑制率结果如图1的A图所示；以lg(3-表齐墩果酸的浓度)为横坐标，抑制率结果如图1的B图所示；图1的A图和B图结果显示3-表齐墩果酸可以通过浓度依赖的方式抑制SARS-CoV-2的S蛋白与ACE2受体的结合作用，其中5mM时的抑制率为66.96％；进一步计算半抑制浓度(IC50)数值，结果显示3-表齐墩果酸的IC50值为3.633mM。结果表明，3-表齐墩果酸以浓度依赖的方式抑制S蛋白与ACE2受体的结合，3-表齐墩果酸抑制S蛋白与ACE2受体结合的IC50值为3.633mmol/L。
实施例3 3-表齐墩果酸对假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞的影响
假病毒中和抗体检测试剂盒，其原理是：将慢病毒载体中的包膜糖蛋白用新冠病毒S蛋白替代，可形成模拟新冠病毒感染的假病毒；假病毒通过表面S蛋白感染靶细胞并表达报告荧光素酶基因，通过检测报告基因荧光素酶的表达量，能推断出病毒被阻断的程度，从而进行中和剂的筛选或验证；中和剂(如抗体)可以阻断S蛋白和ACE2的结合，从而阻止假病毒对宿主细胞的感染。
采用SARS-CoV-2假病毒中和检测试剂盒(南京金斯瑞生物科技有限公司)：1)单体成分的配制：用DMSO溶解3-表齐墩果酸并用Opti-MEM培养基配成浓度为160μM、112μM、40μM、10μM、2.8μM的单体溶液；2)阳性抗体的配制：取5μL 1μg/μL的阳性抗体加入120μLOpti-MEM培养基配成40μg/mL的阳性抗体溶液；3)取假病毒(来源于本试剂盒)，置于37℃水浴快速复融，将病毒加到含有1500μL Opti-MEM培养基的15ml离心管中混匀，得到假病毒溶液；4)各单体给药组中，分别加入各浓度的单体溶液25μL/孔；阳性对照组中，加入阳性抗体溶液25μL/孔；阴性对照组、空白对照组分别加入25μL Opti-MEM培养基；单体给药组、阳性对照组、阴性对照组分别加入25μL/孔的假病毒溶液，空白对照组加入25μL/孔Opti-MEM培养基；其中，各单体给药组中3-表齐墩果酸的终浓度分别为80μM、56μM、20μM、5μM、1.4μM；5)分别与假病毒溶液混匀，室温孵育1h；6)取Opti-HEK293/ACE2细胞(来源于本试剂盒，即过表达ACE2的HEK293细胞)，置于37℃水浴中快速复融细胞；7)将细胞转移至15ml离心管，加入4ml预热的DMEM完全培养基后，100×g，5min离心，弃上清；8)用4ml预热的DMEM完全培养基重悬细胞，充分混匀后细胞计数并调整细胞悬液的密度到600000个细胞/ml；9)待步骤5)孵育结束，每孔加入50μl步骤8)的细胞悬液；96孔板边缘孔用PBS封闭后，将96孔板放入细胞培养箱中；10)24小时后每孔加入50μL预热的新鲜DMEM完全培养基，继续放入培养箱中培养24小时；11)用微孔板封底膜将白色壁、透明底的96孔细胞培养微孔板封底；小心吸弃96孔板的培养基，立即加入50μl新配的荧光素酶显色液，室温孵育3-5分钟；12)微孔板发光检测仪检测化学发光数值，读取信号值，即为荧光素酶活性结果。
运用软件GraphPad Prism 8.0.1和Excel对所得数据进行统计学分析，所有值均以均数±SD表示，统计学比较采用配对t检验，单因素方差分析(ANOVA)。P＜0.05为具有显著性。
统计各组荧光素酶活性，其结果如图2的A图所示，与阴性对照组相比，3-表齐墩果酸能够降低过表达ACE2后Opti-HEK293细胞的荧光素酶活性(终浓度分别为56μM、80μM)，说明3-表齐墩果酸可以有效阻止假病毒进入细胞(n＝3，***P﹤0.001，与阴性对照组相比)；根据读取的信号值，通过公式：抑制率＝1-(单体给药组信号值-空白对照组信号值)/(阴性对照组信号值-空白对照组信号值)×100％，计算得到3-表齐墩果酸对假病毒感染细胞的抑制率，以lg(3-表齐墩果酸的浓度)为横坐标，抑制率结果如图2的B图所示，进一步计算IC50数值，结果显示IC50值为45.71μM。结果表明，3-表齐墩果酸可以抑制含有新冠病毒S蛋白的假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞，3-表齐墩果酸抑制假病毒感染Opti-HEK293/ACE2细胞的IC50值为45.71μmol/L。
综上，3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白和ACE2结合，抑制含有新冠病毒S蛋白的假病毒感染细胞，由此说明本申请的3-表齐墩果酸能够抑制新冠病毒S蛋白与宿主ACE2结合，从而能够用于预防和/或治疗新冠病毒感染，进而用于制备预防和/或治疗新冠病毒感染的药物。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并非用于限定本申请的保护范围。凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本申请的保护范围内。