一种高哌嗪残留物中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法
阅读说明：本技术 一种高哌嗪残留物中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法 (Method for detecting methyl p-toluenesulfonate and ethyl p-toluenesulfonate in high piperazine residue ) 是由 刘蓓蓓 陈云建 陈斌 杨建玲 涂继辉 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种高哌嗪残留物中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法,包括以下步骤：(1)称量高哌嗪产品,加入溶剂溶解,定容,混匀,作为供试品溶液；(2)配置对照品溶液和灵敏度溶液；(3)采用液相色谱-质谱联用法进行测定：液相色谱测定条件为：流动相A为0.1％甲酸的纯水溶液,流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液,梯度洗脱,柱温为40℃,流速为每分钟0.6ml,进样温度为5℃,进样体积为5μl；质谱条件为：离子源API-ES,采用多反应监测的质谱扫描模式；入口电压为8V,出口电压为10V,气帘气压力为25Psi,碰撞气CAD为10Psi,喷雾电压为5500V,离子源温度为430℃；雾化气压力为55Psi,辅助气压力为55Psi。本发明的方法适用于对高哌嗪中这两种杂质的检测。(The invention discloses a method for detecting methyl p-toluenesulfonate and ethyl p-toluenesulfonate in high piperazine residues, which comprises the following steps of: (1) weighing a high piperazine product, adding a solvent for dissolving, fixing the volume, and uniformly mixing to obtain a test solution; (2) preparing a reference substance solution and a sensitivity solution; (3) the determination is carried out by adopting a liquid chromatography-mass spectrometry combined method: the liquid chromatography determination conditions were: gradient elution is carried out on a mobile phase A which is a pure water solution of 0.1% formic acid and a mobile phase B which is a methanol solution of 0.1% formic acid, the column temperature is 40 ℃, the flow rate is 0.6ml per minute, the sample injection temperature is 5 ℃, and the sample injection volume is 5 mu l; the mass spectrum conditions are as follows: an ion source API-ES adopts a mass spectrum scanning mode of multi-reaction monitoring; the inlet voltage is 8V, the outlet voltage is 10V, the air curtain pressure is 25Psi, the collision gas CAD is 10Psi, the spray voltage is 5500V, and the ion source temperature is 430 ℃; the atomization gas pressure was 55Psi and the assist gas pressure was 55 Psi. The method is suitable for detecting the two impurities in the homopiperazine.)
技术领域
本发明属于药品质量控制领域，具体地说，涉及一种高哌嗪中残留物的检测方法，更具体的，涉及高哌嗪中残留物对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法。
背景技术
高哌嗪是由乙二胺为起始原料，经磺酰化、环化、脱磺酰化三步反应合成而来，对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)及其它未知杂质可能残留，高哌嗪作为医药合成的起始物料，因此需要在质控中对对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)的残留进行检测控制。
申请号为2015100770097的中国专利公开了一种高哌嗪的制备方法，是以乙二胺为原料，在正丁醇溶剂中与对甲苯磺酰氯酰化反应得到N,N’-二对甲苯磺酰基乙二胺，产物无需从反应液中分离，直接在氢氧化钠作用下，与溴氯丙烷环合反应得到N,N’-二对甲苯磺酰基高哌嗪，然后在氢溴酸和苯酚作用下脱磺酰基得到高哌嗪氢溴酸盐，最后经氢氧化钠游离、甲苯带水得到高纯度的高哌嗪。该技术方案中没有公开如何检测高哌嗪中残留物的方法。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种高哌嗪中残留物的检测方法，尤其是高哌嗪中残留物对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的目的是提供一种高哌嗪残留物中对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的检测方法，包括以下步骤：
(1)称量高哌嗪产品，加入溶剂溶解，定容，混匀，作为供试品溶液；
(2)分别称取对照品对甲苯磺酸甲酯、对甲苯磺酸乙酯，分别置于量瓶中，加入溶剂溶解，定容，混匀，稀释，作为对照品储备液；再将对照品储备液稀释至设定浓度，作为对照品溶液，对照品溶液稀释，作为灵敏度溶液；
(3)采用液相色谱-质谱联用法进行测定：
液相色谱测定条件为：流动相A为0.1％甲酸的纯水溶液，流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱，柱温为40℃，流速为每分钟0.6ml，进样温度为5℃，进样体积为5μl；
质谱条件为：离子源API-ES，采用多反应监测的质谱扫描模式；入口电压为8V，出口电压为10V，气帘气压力为25Psi，碰撞气CAD为10Psi，喷雾电压为5500V，离子源温度为430℃；雾化气压力为55Psi，辅助气压力为55Psi。
进一步的方案，步骤(1)和步骤(2)中，所述溶剂为体积百分含量为0.5％甲酸的乙腈和水的混合溶液。
进一步的方案，混合溶液中，0.5％甲酸的乙腈和0.5％甲酸的水的体积比为30-50:50-70。
进一步的方案，混合溶液中，0.5％甲酸的乙腈和0.5％甲酸的水的体积比为30:70。
进一步的方案，步骤(3)中，梯度洗脱的时间及流动相比例为：0.01-6.00min，流动相A的体积百分含量由60％降到5％，流动相B的体积百分含量由40％升到95％，6.00-6.10min，流动相A的体积百分含量由5％升到60％，流动相B的体积百分含量由95％降到40％，6.10-10.00min，流动相A的体积百分含量保持60％，流动相B的体积百分含量保持40％。
进一步的方案，步骤(3)的液相色谱测定条件中，采用的色谱柱为Agilent ZorbaxSB-C8柱。
进一步的方案，步骤(3)中，采用乙腈-纯水作为洗针液，其中，乙腈和纯水的体积比为30:70。
进一步的方案，步骤(3)中，液相色谱测定条件中，运行时间为10min。
进一步的方案，灵敏度溶液中，对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯的信噪比S/N不小于10。
进一步的方案，按外标法以峰面积计算，对甲苯磺酸甲酯和对甲苯磺酸乙酯均不超过8ppm。
对甲苯磺酸甲酯(MTS)和对甲苯磺酸乙酯(ETS)在高哌嗪产品中的限度要求均是不大于8ppm。对甲苯磺酸甲酯(MTS)的结构式如下式I所示，对甲苯磺酸乙酯(ETS)的结构式如下式II所示。
作为一种具体的实施方式，一种高哌嗪中残留物对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)的检测方法包括以下步骤：
(1)精密称取本品50mg，置10ml量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取MTS、ETS各约50mg，分别置50ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，各精密量取80μl，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度并摇匀，作为对照品储备溶液；另精密移取0.1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度并摇匀，作为对照品溶液。精密量取对照品溶液2.0ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度并摇匀，作为灵敏度溶液。
(2)照液相色谱-质谱联用(LC-MS)法测定，流动相A为0.1％甲酸的纯水溶液(v/v)，流动相B为0.1％甲酸的甲醇溶液(v/v)，梯度洗脱条件和质谱条件如表1所示。柱温为40℃，流速为每分钟0.6ml，进样温度为5℃，进样体积为5μl。灵敏度溶液中，MTS和ETS的信噪比(S/N)不小于10。按外标法以峰面积计算，MTS、ETS均不得过8ppm。
表1
步骤(1)中所述溶剂为0.5％甲酸的乙腈-水(30：70，v/v)。
步骤(2)中采用的色谱柱为Agilent Zorbax SB-C8柱(4.6×75mm，3.5μm)。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明的检测方法中，稀释剂采用0.5％甲酸的乙腈和0.5％甲酸的水(体积比为30-50:50-70)的混合液作为稀释剂，抑制对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)的水解，直接检测对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)，方法简单。
2、本发明提供的高哌嗪中残留物对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)的检测方法，通过对方法的专属性、系统适用性、线性范围、定量限/检测限、回收率、准确度，精密度、溶液稳定性及方法耐用性的方法学研究，表明方法可用于高哌嗪中残留物对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)的检测方法，分离检测效果好，能够为高哌嗪的质量控制提供保障。
下面结合附图对本发明的
具体实施方式
作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是实施例1中采用流动相1检测获得的色谱图；A为采用流动相1检测获得的样品的色谱图；B为阳性对照的色谱图、C为阴性对照的色谱图；
图2是实施例1中采用流动相2检测获得的色谱图；A为采用流动相2检测获得的样品的色谱图；B为阳性对照的色谱图、C为阴性对照的色谱图；
图3是实施例1中采用流动相3检测获得的色谱图；A为采用流动相3检测获得的样品的色谱图；B为阳性对照的色谱图、C为阴性对照的色谱图；
图4是实施例2中采用稀释剂1(50％H2O-50％ACN)检测1000ng/mL MTS(A)和ETS(B)对照溶液的色谱图；
图5是实施例2中采用稀释剂1(50％H2O-50％ACN)检测加标1000ng/mL MTS和ETS的供试溶液的色谱图；其中，MTS未测出(A)，ETS测出(B)；
图6是实施例2中采用稀释剂2(50％H2O-50％ACN-0.1％FA)检测1000ng/mL MTS和ETS对照溶液的色谱图；其中，MTS未测出(A)，ETS测出(B)；
图7是实施例2中采用稀释剂2(50％H2O-50％ACN-0.1％FA)检测加标1000ng/mLMTS和ETS的供试溶液的色谱图；其中，MTS未测出(A)，ETS测出(B)；
图8是实施例2中采用稀释剂3(50％H2O-50％ACN-0.5％FA)检测1000ng/mL MTS和ETS对照溶液的色谱图；其中，A为MTS对照液色谱图，B为ETS对照液色谱图；
图9是实施例2中采用稀释剂3(50％H2O-50％ACN-0.5％FA)检测加标1000ng/mLMTS和ETS的供试溶液的色谱图；其中，MTS(A)和ETS(B)测出；
图10是实施例3中的检测得到的对照品色谱图；其中，STD 40ng/mL；
图11是实施例3中检测得到的加标样品的色谱图；其中，100％Spiked 5mg/mL；
图12是试验例2中专属性测试中空白、对照品溶液和加标样品溶液色谱图；
图13是试验例5中对甲苯磺酸甲酯线性(20％～200％)图；
图14是试验例5中对甲苯磺酸乙酯线性(20％～200％)图。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
本实施例中，将对甲苯磺酸甲酯(MTS)、对甲苯磺酸乙酯(ETS)在碱性条件下水解成对甲苯磺酸，通过检测对甲苯磺酸来间接定量MTS和ETS。
精密称取本品50mg，置10ml量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取MTS、ETS各约50mg，分别置50ml量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，各精密量取80μl，置20ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度并摇匀，作为对照品储备溶液；另精密移取0.1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度并摇匀，作为对照品溶液。
本实施例中尝试了几种碱性流动相，具体采用下述表2中的液相条件来进行检测。
表2
结果：
采用流动相1检测获得的样品的色谱图、阳性对照(MS positives scan)、阴性对照(MS negatives scan)色谱图如图1中A、B、C所示，采用流动相2检测获得的色谱图、阳性对照和阴性对照色谱图如图2中A、B、C所示，流动相3检测获得的色谱图、阳性对照和阴性对照色谱图如图3中A、B、C所示。
结论：在上述三种流动相体系中，在对照品的测试时，发现MTS和ETS并不容易水解，无法通过测定对甲苯磺酸的方式来检测MTS和ETS。
表3
实施例2
在样品浓度为10mg/mL的加标溶液中MTS发生水解，ETS则没有水解。尝试在稀释剂中加入一定量的甲酸来调节样品溶液pH，使MTS和ETS能保持原型，抑制其水解，直接对其进行检测。分别尝试了3种不同的稀释剂(即配置样品的溶剂)，分别为：稀释剂1：50％H2O-50％ACN，稀释剂2：50％H2O-50％ACN-0.1％FA，稀释剂3：50％H2O-50％ACN-0.5％FA，并分别均采用如下表4中的检测条件进行检测。
表4
结果：
采用稀释剂1检测获得的色谱图如图4-5所示，加标样品中MTS没有检测到，ETS可以检测到；采用稀释剂2检测获得的色谱图如图6-7所示，加标样品中MTS峰值非常小，ETS可以检测到；采用稀释剂3检测获得的色谱图如图8-9所示，加标样品中MTS和ETS均可以检测到。
表5
稀释剂(溶剂)
加标溶液中MTS是否水解
标溶液中ETS是否水解
50％H<sub>2</sub>O-50％ACN
是
否
50％H<sub>2</sub>O-50％ACN-0.1％FA
是
否
50％H<sub>2</sub>O-50％ACN-0.5％FA
否
否
三种不同稀释剂中的结果表明，在50％H2O-50％ACN-0.5％FA中，MTS和ETS均能在加标样品中检测到。因此选择这个溶剂进行后续的方法研究。
研究发现加标溶液中的MTS在稀释剂水相比例高时更稳定，使用0.5％FA in H2O：0.5％FA in ACN＝7:3作为溶剂，同时对样品盘控温5℃，该条件下加标溶液中的MTS和ETS至少稳定12h。
实施例3
高哌嗪中MTS和ETS的残留检测方法预验证，检测条件和结果如表6所示。
表6
检测得到的色谱图如图10(STD 40ng/mL)和图11(100％Spiked 5mg/mL)所示。
方法表征结果：
1、特异性：在MTS，ETS的保留时间内未观察到干扰。
2、灵敏度溶液：MTS:8ng/mL(1.6ppm),信噪比S/N＝54；ETS:8ng/mL(1.6ppm),信噪比S/N＝20。
3、线性：MTS:8ng/mL to 80ng/mL(1.6to 16ppm,r＝0.9989)
ETS:8ng/mL to 80ng/mL(1.6to 16ppm,r＝0.9983)
4、精密度：
MTS:
6次重复进样的RSD％RT为0.1％(n＝6)；
6次重复进样的RSD％Area为5.6％(n＝6)
ETS:
6次重复进样的RSD％RT为0.2％(n＝6)；
6次重复进样的RSD％Area为4.3％(n＝6)
5、重现性
MTS:加标4ppm：回收率＝111％，(n＝2)
加标8ppm：回收率＝95％，(n＝2)
加标12ppm：回收率＝102％，(n＝2)
ETS:加标4ppm：回收率＝87％，(n＝2)
加标8ppm：回收率＝86％，(n＝2)
加标12ppm：回收率＝89％，(n＝2)
6、稳定性
MTS在稀释剂中稳定至少12小时，(初始含量/12h含量)％＝110.8％
MTS在加标溶液中稳定至少12小时，(初始含量/12h含量)％＝108.0％
ETS在稀释剂中稳定至少12小时，(初始含量/12h含量)％＝91.1％
ETS在加标溶液中稳定至少12小时，(初始含量/12h含量)％＝103.4％
结论：方法预验证结果表明，结果符合接受标准，可以进行方法验证。
试验例1系统适应性/方法参数
(1)实验方法
使用满足方法中系统适应性要求的色谱系统进行验证研究
(2)接受标准
系统干净稳定，在主峰的出峰位置没有干扰。如果有干扰的话，干扰峰的峰面积不大于灵敏度溶液中主峰峰面积的30％。
灵敏度溶液中，MTS和ETS的信噪比(S/N)不小于10
初始6针对照品溶液中的峰面积RSD％不大于15.0％
初始6针对照品溶液中的保留时间RSD％不大于1.0％
插入对照品溶液的回收率在70.0-130.0％之间。
公式中：H代表峰顶到基线的峰高；h代表色谱图中的背景噪音
结果：本发明方法的系统适应性测试结果中所有验证参数都符合接受标准，详细数据如表7和表8。
表7系统适应性测试结果
备注：ND＝未检出
表8系统适应性测试结果
试验例2专属性
(1)实验方法
配制下列代表性样品：空白(溶剂),每个待测物的100％限度的对照品溶液，100％限度的对照品溶液，
100％限度的加标样品溶液；
进样分析上述专属性检测溶液。
(2)接受标准
在空白色谱图中，在目标峰处无明显干扰。如果有干扰的话，干扰峰的峰面积不得大于LOQ的主峰平均积分面积的30％。
100％限度的单个待测物对照品溶液显示目标峰。
100％限度的对照品溶液显示目标峰。
100％限度的加标样品色谱图中目标峰附近无干扰。
(3)结果
在空白色谱图中，在目标峰的保留时间上没有干扰峰，专属性测试样品色谱图见图12。
各目标峰被很好的定位，保留时间(RT)见表9。
100％限度的加标样品色谱图中目标峰附近无干扰。
表9保留时间与分离度
试验例3检测限(LOD)
(1)实验方法
配制10％限度的对照品溶液作为LOD溶液
LOD溶液进样分析3次
计算LOD的信噪比
(2)接受标准
每针LOD溶液的信噪比(S/N)≥3
(3)结果信噪比(S/N)计算结果见表10。
表10检测限(LOD)
试验例4定量限(LOQ)
(1)实验方法
配制20％限度的对照品溶液作为LOQ溶液，
LOQ溶液进样分析6次，
计算LOQ的信噪比，
计算六针LOQ中目标峰峰面积的％RSD。
(2)接受标准
每针LOQ溶液的信噪比(S/N)≥10；
连续6针LOQ中目标峰峰面积的％RSD≤30％
(3)结果
信噪比(S/N)计算结果见表11(对甲苯磺酸甲酯定量限)和12(对甲苯磺酸乙酯定量限)。
表11定量限(对甲苯磺酸甲酯)
表12定量限(对甲苯磺酸乙酯)
试验例5线性
(1)实验方法
配制从LOQ到200％浓度的一系列线性测试溶液(20％，50％，100％，150％，200％)，每份溶液进样分析一次，
计算方程和回归系数(r)
(2)接受标准
回归系数(r)≥0.990，
报告回归系数，斜率，y轴截距和残差平方和
(3)结果
线性测试结果符合接受标准，见表13以及图13和图14。
表13线性测试结果
试验例6准确度
(1)实验方法
用50％，100％和150％三个限度水平的标准溶液各配制三份加标样品溶液
按照方法配制三份样品溶液
每份溶液进样分析一次
计算每份溶液的回收率及每个浓度水平的平均回收率
(2)接受标准
单个加标溶液的回收率在75-120％之间.
(3)结果
准确度实验结果见表14(对甲苯磺酸甲酯)和15(对甲苯磺酸乙酯)。
表14准确度(对甲苯磺酸甲酯)
表15准确度(对甲苯磺酸乙酯)
试验例7重复性
(1)实验方法
配制6份100％限度水平的加标样品溶液。在准确度测试中配制的三份溶液也可用于重复性计算每份溶液进样分析一次
计算6份加标溶液回收率的％RSD
(2)接受标准
6份100％加标溶液回收率的％RSD≤20％
(3)结果
重复性结果见表16(对甲苯磺酸甲酯)和17(对甲苯磺酸乙酯)。
表16重复性(对甲苯磺酸甲酯)
表17重复性(对甲苯磺酸乙酯)
试验例8中间精密度
(1)实验方法
由另外一名研究员在不同时间配制6份100％限度水平的加标样品溶液。
每份溶液进样分析一次
计算12份100％限度水平的加标样品溶液回收率的％RSD
(2)接受标准
份加标样品溶液回收率的％RSD≤20％
(3)结果
中间精密度结果见表18(对甲苯磺酸甲酯)和19(对甲苯磺酸乙酯)。
表18中间精密度(对甲苯磺酸甲酯)
表19中间精密度(对甲苯磺酸乙酯)
试验例9溶液稳定性
(1)实验方法
分别配制100％限度水平的对照品溶液和加标样品溶液各一份，在24小时或其他时间段分析这些溶液，并与新鲜配制的对照品溶液进行对比。如果没有稳定性问题的话，需要考察24小时。
稳定性时间段是接受标准得到满足的时间间隔。
(2)接受标准
稳定性溶液的含量在初始含量的70～130％之间。
(3)结果溶液稳定性结果见表20和21。
表20 100％对照品溶液的溶液稳定性
表21 100％水平加标样品溶液溶液稳定性
试验例10范围
(1)实验方法
根据方法线性和准确度的数据确定(50％-150％)
(2)接受标准
无
(3)结果
由方法线性和准确度验证结果表明方法范围为50％至150％。具体结果见表22.
表22方法检测范围
名称
范围
对甲苯磺酸甲酯
19.33ng/mL～57.98ng/mL
对甲苯磺酸乙酯
19.40ng/mL～58.19ng/mL
试验例11耐用性
(1)实验方法
按下表的色谱条件，考察分析方法小幅变动对系统的影响情况。
表23
测试时需考察变化后方法的系统适应性。
配制100％限度的加标样品溶液一份，每个条件进样一次。
计算耐用性条件下加标样品溶液的回收率。
(2)接受标准
耐用性条件下加标样品溶液回收率在75～120％之间如果有耐用性方法没有满足要求，可以做出说明。
(3)结果
系统适应性结果见表24-16，耐用性结果见表27。
表24系统适应性测试结果
表25系统适应性测试结果
表26系统适应性测试结果
表27耐用性测试结果
结论
所有验证参数均符合接受标准，因此该方法适用于高哌嗪残留物中对甲苯磺酸甲酯(MTS)和对甲苯磺酸乙酯(ETS)的残留测试。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。