食蟹猴血浆中covid-19潜在治疗药物的检测方法
阅读说明：本技术 食蟹猴血浆中covid-19潜在治疗药物的检测方法 (Method for detecting COVID-19 potential therapeutic drug in cynomolgus monkey plasma ) 是由 缪峰 刘洁 季金风 邢溪溪 陶庭磊 周叶兰 耿家豪 季中秋 郭文静 陈淑敏 谢一 于 2020-05-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种食蟹猴血浆中COVID-19潜在治疗药物的检测方法,包括下列步骤：采用液相色谱-质谱联用法,对经处理的食蟹猴血浆中的COVID-19潜在治疗药物进行分析检测；其中,所述的COVID-19潜在治疗药物为(S)-2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-2-乙基丁基酯。本发明能够快速、简便地测定食蟹猴血浆中的COVID-19潜在治疗药物。(The invention provides a method for detecting a COVID-19 potential therapeutic drug in cynomolgus monkey plasma, which comprises the following steps: analyzing and detecting the COVID-19 potential therapeutic drug in the treated cynomolgus monkey plasma by adopting a liquid chromatography-mass spectrometry combined method; wherein, the COVID-19 potential therapeutic drug is (S) -2- (((S) - ((((2R, 3S,4R,5R) -5- (4-aminopyrrolo [2,1-f ] [1,2,4] triazin-7-yl) -5-cyano-3, 4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl) methoxy) (phenoxy) phosphoryl) amino) propionic acid-2-ethylbutyl ester. The invention can quickly, simply and conveniently determine the COVID-19 potential therapeutic drug in the blood plasma of the cynomolgus monkey.)
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种食蟹猴血浆中COVID-19潜在治疗药物的检测方法。
背景技术
2019年末，由2019新型冠状病毒(2019-nCoV)感染导致的新型冠状病毒肺炎(Novel coronavirus pneumonia，COVID-19)疫情暴发。该病毒传播迅速，传染性强，人群普遍易感，疫情很快成为全球关注的焦点。然而在全球范围内，尚无批准的针对COVID-19的治疗方法，抗新冠病毒药物的研发迫在眉睫。
根据已上市药物以及相关的数据库进行了药物筛选，迅速发现了30种可能对COVID-19有治疗作用的药物，其中包括瑞德西韦(remdesivir)、沙奎那韦(Saquinavir)、洛匹那韦(Lopinavir)、卡非佐米(Carfilzomib)、利托那韦以及磷酸氯喹(ChloroquinePhosphate)等药物，此类药物大多可以阻止病毒RNA合成以抑制病毒复制，相关细胞水平的试验表明此类药物可以有效的在细胞水平上抑制COVID-19的感染，但其在人体上的作用还有待临床验证。根据国家食品药品监督管理总局规定，新药在临床验证前需相应的非临床试验数据支持。因此，有关针对COVID-19潜在治疗药物的非临床安全评价工作尤为重要，其在不同动物模型中药物代谢以及毒理的方法准确性是其在进入临床试验中的重要安全保障。
目前相关的针对新冠病毒的潜在治疗药物主要是小分子药物。小分子药物(分子量200～700)代谢常用色谱法进行测定，方法开发过程中主要对所使用的溶剂和试剂、基质以及配制和处理步骤进行筛选，从而形成精确测定的方法。因此，COVID-19潜在治疗药物的临床前安全评价方法的开发至关重要。
发明内容
本发明提供一种食蟹猴血浆中COVID-19潜在治疗药物的检测方法，其能够快速、简便地测定食蟹猴血浆中的COVID-19潜在治疗药物。
本发明提供了一种食蟹猴血浆中COVID-19潜在治疗药物的检测方法，包括下列步骤：
采用液相色谱-质谱联用法，对经处理的食蟹猴血浆中的COVID-19潜在治疗药物进行分析检测；其中，所述的COVID-19潜在治疗药物为(S)-2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-2-乙基丁基酯；
所述的经处理的食蟹猴血浆为经蛋白沉淀法处理的食蟹猴血浆；
所述的液相色谱-质谱联用法中采用梯度洗脱，所述的梯度洗脱中流动相A为体积浓度为0.01％～0.5％的甲酸水溶液，流动相B为甲醇。
优选地，所述的梯度洗脱的程序为：初始状态时，流动相A的体积百分比为90％-99％，流动相B的体积百分比为1％-10％；从初始状态到1.50±0.50min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐降到1％-10％，流动相B的体积百分比逐渐升高到90％-99％，在1.50±0.50min到2.50±0.50min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在1％-10％，流动相B的体积百分比维持在90％-99％；在2.50±0.50min到2.51±0.50min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐升高到90％-99％，流动相B的体积百分比逐渐降低到1％-10％；在2.51±0.50min到3.00±0.50min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在90％-99％，流动相B的体积百分比维持在1％-10％。(上述流动相A和B的体积百分比以流动相A和B的总体积为基准)
在一个具体的实例中，所述的梯度洗脱的程序为：初始状态时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％；从初始状态到1.50min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐降到5％，流动相B的体积百分比逐渐升高到95％，在1.50min到2.50min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在5％，流动相B的体积百分比维持在95％；在2.50min到2.51min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐升高到95％，流动相B的体积百分比逐渐降低到5％；在2.51min到3.00min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在95％，流动相B的体积百分比维持在5％。(上述流动相A和B的体积百分比以流动相A和B的总体积为基准)
本发明中，所述食蟹猴血浆是指未经处理的食蟹猴血浆；经过处理的食蟹猴血浆成为经处理的食蟹猴血浆。
较佳地，所述的蛋白沉淀法中的沉淀剂为乙腈。
较佳地，所述的食蟹猴血浆是食蟹猴EDTA-K2血浆。
较佳地，所述的液相色谱-质谱联用法为LC-MS/MS方法。
较佳地，所述的液相色谱-质谱联用法中的进样量为1～10μL，优选2μL。
较佳地，所述的液相色谱-质谱联用法中柱温为20℃～30℃，优选25℃。
较佳地，所述的流动相A和流动相B的总流速为0.5mL/min。
在一个具体的实例中，流动相A为体积浓度为0.1％的甲酸水溶液。
较佳地，所述的液相色谱-质谱联用法中，分别对经处理的标准曲线样品、经处理的质控样品和经处理的食蟹猴血浆样品进行检测；其中，所述的所述的经处理的标准曲线样品为经蛋白沉淀法处理的标准曲线样品；所述的经处理的质控样品为经蛋白沉淀法处理的质控样品；所述的标准曲线样品、质控样品和食蟹猴血浆样品中均加入内标工作液。
本发明中，所述标准曲线样品是指未经处理的标准曲线样品；经过处理的标准曲线样品成为经处理的标准曲线样品。所述质控样品是指未经处理的质控样品；经过处理的质控样品成为经处理的质控样品。
更佳地，所述的蛋白沉淀法中的蛋白沉淀剂为乙腈。
更佳地，所述的蛋白沉淀法包括将标准曲线样品、质控样品或食蟹猴血浆样品与蛋白沉淀剂混合，离心，取上清液。
更佳地，所述的标准曲线样品的配制方法，包括下列步骤：
步骤1：将COVID-19潜在治疗药物标准品与稀释液混合，得到标准品储备液；
步骤2：将标准品储备液与稀释液混合，得到具有浓度梯度的多个标准品工作液；
步骤3：将标准品工作液与空白血浆混合，得到标准曲线样品；
和/或，所述的质控样品的配制方法，包括下列步骤：
步骤a：将COVID-19潜在治疗药物标准品与稀释液混合，得到质控储备液；
步骤b：将质控储备液与稀释液混合，得到具有浓度梯度的多个质控工作液；
步骤c：将质控工作液与空白血浆混合，得到质控样品；
和/或，所述的内标工作液的配制方法，包括下列步骤：
步骤I：将甲苯磺丁脲标准品与稀释液混合，得到内标储备液；
步骤II：将内标储备液与稀释液混合，得到内标工作液。
更佳地，所述的步骤1、a和I中的稀释液为DMSO，步骤2、b和II中的稀释液为体积浓度为30％～70％的甲醇水溶液。进一步地，所述的步骤2、b和II中的稀释液最佳为体积浓度为50％的甲醇水溶液。
更佳地，所述标准品工作液的浓度梯度依次为80ng/mL,200ng/mL,1000ng/mL,2000ng/mL,5000ng/mL,10000ng/mL,20000ng/mL,80000ng/mL。
更佳地，所述质控工作液的浓度梯度依次为240ng/mL,3000ng/mL和60000ng/mL。
更佳地，所述的内标工作液的浓度为1000ng/mL。
更佳地，所述的标准曲线样品的浓度为4ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL和4000ng/mL。
更佳地，所述的质控样品的浓度为12ng/mL、150ng/mL和3000ng/mL。
本发明中，空白血浆是指不含COVID-19潜在治疗药物和内标工作液的血浆。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明开发了COVID-19潜在治疗药物在食蟹猴血浆样品中的检测方法，该方法能够快速、简便地测定食蟹猴血浆中的COVID-19潜在治疗药物的浓度，从而可以用于分析COVID-19潜在治疗药物在食蟹猴体中的药代/毒代动力学。
2、本发明所采取前处理方法为蛋白沉淀法，该方法较常用的萃取的方法流程更为简单、用时短且易操作；本发明采用了液相色谱串联质谱法，利用合适的流动相以及梯度洗脱程序，在运行时间的中间部分提高了甲醇的比例，使得峰型良好，使标准曲线线性精准，保证了检测的准确性和可靠性，同时，本发明所需的样本进样量小，所需的分析时间较短；因此本发明能够保证在较短的分析时间里获得更准确、高精密度、高灵敏度的检测数据，为非临床试验生物样品的分析奠定了夯实的基础。
附图说明
图1为标准曲线定量下限(4ng/mL)图谱(COVID-19潜在治疗药物保留时间1.86min)；
图2为标准曲线定量下限图谱(甲苯磺丁脲保留时间1.77min)；
图3为标准曲线定量上限(4000ng/mL)图谱(COVID-19潜在治疗药物保留时间1.86min)；
图4为标准曲线定量上限图谱(甲苯磺丁脲保留时间1.77min)；
图5为COVID-19潜在治疗药物标准曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中所述的COVID-19潜在治疗药物为(S)-2-(((S)-(((2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-7-基)-5-氰基-3,4-二羟基四氢呋喃-2-基)甲氧基)(苯氧基)磷酰基)氨基)丙酸-2-乙基丁基酯。
实施例1：
一种食蟹猴血浆中COVID-19潜在治疗药物的检测方法，包括：
1、试剂的配制
1.1流动相A(MPA)：体积浓度为0.1％的甲酸(FA)水溶液。
取1000mL H2O中加入1mL FA于溶剂瓶中，混匀。室温保存，有效期1个月。
1.2流动相B(MPB)：MeOH(甲醇)
取1000mL MeOH于溶剂瓶中。室温保存，有效期3个月。
1.3强洗溶液(SNW)：MeOH:ACN:IPA:DMSO＝1:1:1:1，v/v/v/v。
取500mL MeOH，500mL ACN(乙腈)，500mL IPA(异丙醇)，500mL DMSO(二甲基亚砜)，混匀。室温保存，有效期3个月。
1.4弱洗溶液(WNW)：MeOH:H2O＝1:1，v/v。
取1000mLMeOH，1000mL H2O，混匀。室温保存，有效期3个月。
1.5沉淀剂&内标稀释液：MeOH。
取1000mLMeOH。室温保存，有效期1个月。
1.6第二稀释液：MeOH:H2O＝1:1，v/v。
取500mLMeOH，500mL H2O，混匀。室温保存，有效期3个月。
1.7第一稀释液：DMSO。
取50mL DMSO。室温保存，有效期3个月。
2、标准曲线&SST样品、质控样品以及内标工作液的配制：
下述各储备液和工作液均储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
2.1标准品储备液的配制
精密称取适量COVID-19潜在治疗药物标准品于透明样品瓶中，加入适量DMSO溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/mL的标准品储备液。(所述DMSO的体积通过标准品储备液的浓度以及经折算的COVID-19潜在治疗药物代谢物质量计算得到，其中，所述的经折算的COVID-19潜在治疗药物代谢物的质量通过所称取的COVID-19潜在治疗药物代谢物质量乘以其对应的质量折算因子0.992得到)。
2.2标曲&系统适应性样品工作液(标曲&SST工作液)的配制(稀释液：MeOH:H2O＝1:1，v/v)
使用标准品储备液，依照下表1，使用第二稀释液稀释成具有浓度梯度的多个标准品工作液(标曲&SST工作液)；
表1：COVID-19潜在治疗药物标准品标曲&SST工作液配制
2.3标准曲线&SST样品的配制
使用标曲&SST工作液，依照下表2与空白血浆混合，得到标准曲线&SST样品(即标准曲线样品)：
表2：COVID-19潜在治疗药物标准品标准曲线&SST样品的配制
标准曲线&SST样品储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
2.4质控储备液的配制
精密称取适量COVID-19潜在治疗药物标准品于透明样品瓶中，加入适量DMSO溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/mL的质控储备液。(所述DMSO的体积通过质控储备液的浓度以及经折算的COVID-19潜在治疗药物代谢物质量计算得到，其中，所述的经折算的COVID-19潜在治疗药物代谢物的质量通过所称取的COVID-19潜在治疗药物代谢物质量乘以其对应的质量折算因子0.992得到)。
2.5质控工作液的配制(稀释液：MeOH:H2O＝1:1，v/v)
使用质控储备液，依照下表3配制，用第二稀释液稀释成具有浓度梯度的多个质控工作液：
表3：COVID-19潜在治疗药物标准品质控工作液配制
2.6质控样品的配制
使用质控工作液，依照下表4与空白血浆混合，得到质控样品：
表4：COVID-19潜在治疗药物标准品质控样品的配制
质控样品储存于超低温冰箱(-70～-90℃)中。
2.7内标储备液的配制
精密称取适量甲苯磺丁脲于透明样品瓶中，加入适量DMSO溶解、摇匀，配制成浓度为1.000mg/mL的内标储备液。(所述DMSO的体积通过内标储备液的浓度以及经折算的甲苯磺丁脲的质量计算得到，其中，所述的经折算的甲苯磺丁脲的质量通过所称取的甲苯磺丁脲的质量乘以其对应的质量折算因子0.999得到)。
2.8内标工作液的配制(稀释液：MeOH：H2O＝1：1)
使用内标储备液，依照下表5配制，用第二稀释液稀释得到内标工作液；
表5：甲苯磺丁脲内标工作液配制
3、样品处理步骤
3.1样品涡旋(如果样品需要融化，在室温融化后再涡旋)。
3.2分别吸取20μL STD、QC、DB、Carryover、Blank以及待测食蟹猴EDTA-K2血浆样品转移至96孔板或聚丙烯离心管中；其中，STD为标准曲线&SST样品，QC为质控样品，DB、Carryover和Blank为空白对照；
3.3向STD、QC、Blank以及待测食蟹猴血浆样品中加入20μL内标工作液(ISWS1)；
3.4采用蛋白沉淀法进行处理：涡旋混匀后，向所有样品中加入160μL蛋白沉淀剂ACN；
3.5涡旋混匀。在4℃，4000rpm条件下离心10min。
3.6取离心后的上清液100μL至96孔板或聚丙烯离心管中，封膜，1000rpm下涡旋混匀10min，得到经处理的STD、QC、DB、Carryover、Blank以及待测食蟹猴EDTA-K2血浆样品，进样分析。
4、采用液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)对经处理的STD、QC、DB、Carryover、Blank以及待测食蟹猴EDTA-K2血浆样品中的COVID-19潜在治疗药物进行分析检测：
其中，液相色谱-质谱联用条件为：
进样量：2μL；
色谱柱：Poroshell 120SB-C18,2.1×50mm,2.7μm，Agilent；
柱温：25℃；
采用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A和流动相B的总流速为0.5mL/min；
运行时间：3.0min；
采用梯度洗脱，洗脱梯度程序如表6：
表6：洗脱梯度程序
其中，所述的梯度洗脱程序为：初始状态时，流动相A的体积百分比为95％，流动相B的体积百分比为5％；从初始状态到1.50 min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐降到5％，流动相B的体积百分比逐渐升高到95％，在1.50 min到2.50 min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在5％，流动相B的体积百分比维持在95％；在2.50 min到2.51 min的时间段内，流动相A的体积百分比逐渐升高到95％，流动相B的体积百分比逐渐降低到5％；在2.51 min到3.00 min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在95％，流动相B的体积百分比维持在5％。(上述流动相A和B的体积百分比以流动相A和B的总体积为基准)
洗针溶剂：强洗(MeOH:ACN:IPA:DMSO＝1:1:1:1,v/v/v/v)
弱洗(MeOH:H2O＝1:1,v/v)
洗针程序：冲洗类型：仅外部；
冲洗模式:抽吸前后，浸入时间:2s；
冲洗泵方式:冲洗泵，然后停止，时间:2s；
冲洗设置:冲洗速度:35μL/s；
冲洗体积:1000μL；
测量管路吹扫量:100μL
质谱仪器型号：AB SCIEX TRIPLE QUADTM 4500；
离子源：ESI；
离子化模式：正离子；
MRM离子对如表7所示：
表7：MRM离子对
仪器参数如表8所示：
表8仪器参数：
5、分析批接收标准和标准曲线回归方法
5.1回归方法
提取MRM色谱图，拟合标准曲线，标准曲线以标准曲线&SST样品中COVID-19潜在治疗药物浓度为横坐标，以标准曲线&SST样品中COVID-19潜在治疗药物与内标峰面积比值为纵坐标，设置权重为1/x2，忽略原点，拟合线性标准曲线。STD1样品对应的图谱如图1和2所示；STD8样品对应的图谱如图3和4所示。
以待测食蟹猴EDTA-K2血浆样品中分析物(即COVID-19潜在治疗药物)峰面积与内标峰面积比对标准曲线中分析物的理论浓度进行线性最小二乘法回归计算，以所得回归方程计算样品中分析物的实测浓度。
样品中分析物的实测浓度由以下回归方程计算：
y＝ax+b
其中，y＝分析物与内标峰面积比
a＝标准曲线之斜率
x＝分析物浓度(单位ng/mL)
b＝标准曲线之截距(权重因子为1/x2)
5.2分析批接受标准
1.根据各经处理的标准曲线样品中分析物(即COVID-19潜在治疗药物)峰面积与内标峰面积比结合上述标准曲线，计算出各经处理的标准曲线样品浓度的回算值，各经处理的标准曲线样品浓度的回算值与标示值之间的偏差应在±15.0％范围内(定量下限处的偏差在±20.0％范围内)。
2.至少75％的经处理的标准曲线样品，且每个浓度点至少50％的样品应符合接受标准。
3.回归方程的相关系数(r2)必须大于等于0.98。
4.根据各经处理的质控样品中分析物(即COVID-19潜在治疗药物)峰面积与内标峰面积比结合上述标准曲线，计算出各经处理的质控样品浓度的回算值，当至少67％的经处理的质控样品的浓度回算值(每个浓度点至少50％的样品)与它们相应标示值的偏差在±15.0％之内时，该分析批认为可接受。
结果如图5所示，标准曲线回归方程为：y＝0.000718x+0.000224(r＝0.9969，r2＞0.98)，标曲与质控样品的标示值回算偏差结果如表9、表10所示，满足分析批接受标准。综上，本方法可以用于测定食蟹猴EDTA-K2血浆中COVID-19潜在治疗药物的浓度。
表9：质控样品与标示值回算偏差数据表
表10：标曲与标示值回算偏差数据表
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
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