用于检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能的方法
阅读说明：本技术 用于检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能的方法 (Method for detecting aerobic biodegradation performance of high polymer material in marine environment ) 是由 王格侠 季君晖 卢波 李飞 黄丹 甄志超 于 2020-05-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能的方法,其包括如下步骤：(i)提供待检测的高分子材料样品和海水样本；(ii)对所述海水样本中的微生物进行调控,将微生物数量调控为10～(3)-10～(7)CPU/mL；(iii)将待检测样品置于步骤(ii)调控后的海水样本中,在好氧环境下进行降解试验,持续预定时长；(iv)定期测定降解产生的CO-(2)累计释放量,根据CO-(2)气体释放量随降解时间的变化评价所述高分子材料的生物降解性能。本发明通过调控海水样本中的微生物,能够更好地模拟真实海水降解环境,缩短降解检测时间,推断出所检测的材料在真实海水中可能达到的最大降解速率,因而有利于实验室高效准确地评价高分子材料在真实海水环境中的降解性能。(The invention discloses a method for detecting the aerobic biodegradation performance of a high polymer material in a marine environment, which comprises the following steps: (i) providing a high polymer material sample to be detected and a seawater sample; (ii) regulating and controlling microorganisms in the seawater sample, wherein the quantity of the microorganisms is regulated and controlled to be 10 3 ‑10 7 CPU/mL; (iii) placing a sample to be detected in the seawater sample regulated and controlled in the step (ii), and performing a degradation test in an aerobic environment for a preset time; (iv) periodic determination of CO produced by degradation 2 Cumulative amount released according to CO 2 And evaluating the biodegradation performance of the high polymer material according to the change of the gas release amount with the degradation time. The invention can better simulate the real seawater degradation environment by regulating and controlling the microorganisms in the seawater sample, shorten the degradation detection time, and deduce the maximum degradation rate of the detected material in the real seawater, so the invention has the advantages ofThe method is beneficial to efficiently and accurately evaluating the degradation performance of the high polymer material in a real seawater environment in a laboratory.)
技术领域
本发明涉及对高分子材料的生物降解性能的评价，具体而言，本发明涉及检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能。
背景技术
微生物是影响聚酯等高分子材料在海洋环境中的生物降解速率的决定性因素。当海水中存在聚酯等高分子材料生物降解所需的特异性微生物时，高分子材料发生生物降解，降解速率随微生物数量增加而增大，当所需的特异微生物不存在时，聚酯等高分子材料只能在水中进行缓慢的非酶水解，不能完成最终的生物降解过程。
真实海水环境中微生物种类和数量分布随海区、深度均有变化，除了近海区特别是内湾和河口区微生物密度略大，每毫升一般可分离到102～103个细菌菌落，有时超过106个以外，在深海海水中，微生物种类和数量都很少，每毫升深海海水有时很可能分离不出一个细菌菌落。
鉴于微生物数量、种类以及环境温度诸多因素的影响，同一材料在不同区域自然海水中实际降解性能降解率都会有差异，即使在同一区域，不同季节，不同时间段，同一材料在自然海水中实际降解性能降解率都会存在巨大差异。
在现有的针对塑料降解性能的检测标准(例如ASTM标准及国标)中，所采用的水体来自天然海水，或者在实验室配置的盐水中加入特定种类的微生物，未对水体中的微生物数量和种类进行调控，由于未能考虑降解环境中存在的诸多变量，同一材料在自然海水中检测到的降解性能和降解率会存在巨大差异，因此，无法真实反映海水环境下的降解性能。
发明内容
鉴于现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能的改进方法，该方法通过调控海水样本中的微生物种类和数量，在模拟真实的海洋环境的同时使高分子材料的提高降解速率、缩短降解时间。
本发明的检测高分子材料在海洋环境中的好氧生物降解性能的方法包括如下步骤：
(i)提供待检测的高分子材料样品和海水样本，其中，所述海水样本含有微生物以及无机养分；
(ii)将所述海水样本中的微生物数量调控为103-107CPU/mL；
(iii)将待检测样品置于步骤(ii)调控得到的海水样本中，在好氧环境下进行降解试验，持续预定时长；
(iv)定期测定降解产生的二氧化碳累计释放量，根据二氧化碳气体释放量随降解时间的变化评价所述高分子材料的生物降解性能。
在本发明的一些实施方式中，步骤(ii)通过富集、培养或者稀释来调控所述海水样本中的微生物数量，将其调控为103-107CPU/mL。
在本发明的一些实施方式中，步骤(ii)调控得到的海水样本中含有特异性降解待检测高分子材料的微生物。所述特异性降解待检测高分子材料的微生物包括下列微生物种属中的至少一种：芽孢杆菌属(Bacillus sp)，肠杆菌属(Enterobacter sp.)，红球菌属(Rhodococcus sp)，格拉氏杆菌属(Gracilibacillus sp)，α-变形杆菌(Alpha-proteobacteria)，β-变形杆菌(Beta-proteobacteria)，γ-变形杆菌(Gamma-proteobacteria)，鞘氨醇杆菌(Sphingobacteria)，黄杆菌(Flavobacteria)在本发明的一些实施方式中，本发明的检测方法还包括如下步骤：
吸收降解产生的二氧化碳气体，使其反应生成碳酸根离子；
定期取样测定碳酸根离子含量，基于碳酸根离子含量推算降解产生的二氧化碳气体释放量，根据二氧化碳气体释放量随降解时间的变化评价所述高分子材料的生物降解性能。
在本发明的一些实施方式中，可采用至少一个碱溶液吸收肼吸收二氧化碳气体并生成碳酸根离子。当碱溶液吸收肼的数量为至少两个时，各吸收肼之间相互串联，进而提高二氧化碳的吸收效率。
在本发明的一些实施方式中，采用阴离子色谱仪检测碳酸根离子含量，由于离子色谱仪的低检测限，即使在降解初期二氧化碳释放量很少的情况下，也能准确灵敏地检测到吸收肼中的碳酸根离子的含量。
在本发明的一些实施方式中，二氧化碳吸收肼中的碱溶液能够与二氧化碳生成水溶性碳酸根离子，优选为容易与二氧化碳快速反应生成水溶性碳酸根离子的碱溶液，例如NaOH溶液或者KOH溶液等强碱溶液。
在本发明的一些实施方式中，还可以根据二氧化碳气体释放量换算所述高分子材料的矿化率，并且，基于矿化率评价生物降解性能，矿化率换算公式如下：
其中，(CO2)T为待检测样品在检测过程中累计产生的CO2的量；(CO2)B为空白对照产生的CO2的量；ThCO2为样品理论上产生的CO2的量。
在本发明的一些实施方式中，所述海水样本中所包含的微生物的含量为104-107CPU/mL，无机养分包括NH4Cl和KH2(PO4)。
在本发明的一些实施方式中，对于检测海洋环境中高分子材料的降解性能而言，降解持续的预定时长为3至6个月，该时长还可根据待测高分子材料本身的性质以及检测条件进行适当调整。
在本发明的一些实施方式中，对二氧化碳吸收肼中的吸收液定期取样测定碳酸根离子含量的频度为每5天至20天测量一次，也可以根据待测样品的具体情况进行适当调整。
本发明相比于现有的高分子材料在海洋环境中的降解性能检测方法，本发明考虑了高分子材料在海水降解中存在的诸多影响因素，通过对海水样本中的微生物的调控，一方面能够更好地模拟真实海水降解环境，另一方面，通过调控微生物数量提高降解速率，缩短降解时间，进而推断出检测材料在真实海水中可能达到的最大降解速率，因而，有利于实验室高效准确地评价高分子材料在真实海水环境中的降解性能。
此外，当本发明基于碳酸根离子含量来推算二氧化碳累计释放量时，由于碳酸根离子含量采用离子色谱仪测定，使本发明的检测方法还具有高灵敏度和高检测限，并且，便于实现检测自动化。
附图说明
图1A显示了根据本发明的实施例1至6的检测样品在90天的降解时间段内的二氧化碳累计释放量随时间的变化曲线。
图1B显示了相应于图1A所示的实施例1至6的检测样品在90天的降解时间段内的二氧化碳累计释放量计算得到的矿化率随时间的变化曲线。
具体实施方式
以下将结合具体实施例对本发明进行详细说明，这些具体实施例仅用于举例说明本发明，对本发明的保护范围不构成任何限定。
在本发明的示例性实施方式中，选择薄膜形式的样品，以薄层色谱级(TLC)纤维素用作参比对照，以仅含有海水样本的反应器用作空白对照。
在本发明的示例性实施方式中，海水样本可以从自然海水中提取，随后通过富集、培养或者稀释来调控所提取的海水样本中的微生物数量，将其调整为103-107CPU/mL。海水样本中的微生物及其所需的无机养分，其组分和含量可以参照现有标准(例如ASTM D6691-2009)，也可以根据微生物数量对无机养分进行相应调整。微生物计数可采用本领域已知的常规方法，例如平板计数法。
在本发明的示例性实施方式中，降解试验温度选为30℃，也可在适当范围内浮动，该降解温度一方面可以模拟海水环境，另一方面可以将降解检测时长控制在合理范围内，例如将检测时长控制在6个月之内。此外，还可以设定加速降解试验的温度条件，以提高检测效率。
在本发明的示例性实施方式中，为了使降解试验在好氧环境中进行，可以直接向降解容器中通入氧气，也可以通入除去CO2气体的空气，例如，可以使用空气压缩机将空气鼓入CO2吸收肼除去CO2气体，除去CO2气体的空气缓慢引入降解容器，为了适当控制气体流量，可根据需要在气体流路中设置气体缓冲罐和空气流量计。此外，CO2吸收肼的数量可以根据需要进行设置，可以是单个CO2吸收肼，也可以是多个CO2吸收肼串联使用。
在本发明的示例性实施方式中，高分子材料降解产生的CO2气体可以采用至少一个具有一定浓度的碱溶液吸收肼进行收集，为了提高吸收效率，必要时，可通过增加CO2气体与吸收溶液的接触面积，或者使用多个吸收肼串联。吸收肼中的碱溶液用于吸收CO2气体生成碳酸根离子，碱溶液优选为与二氧化碳容易快速生成水溶性碳酸根离子，例如，选用适当浓度的NaOH溶液或者KOH溶液。
采用阴离子色谱仪定期测定吸收肼内溶液中碳酸根离子含量，推算降解产生的CO2，当采用多个吸收肼串联时，应计算各吸收肼在同一降解时段的吸收量之和。根据降解累计产生的CO2气体量占海水降解塑料理论二氧化碳产生量的的百分比为即为降解率或矿化率。
在本发明的示例性实施方式中，碳酸根离子的浓度采用阴离子色谱仪进行测定，为了分析降解性能随时间的变化关系，本发明在降解过程中对累计生成的碳酸根离子含量进行定期测定，进而推算相应的二氧化碳累计释放量，最终计算所检测的高分子材料的矿化率(即降解率)，以评价生物降解程度。
样品的生物降解程度可以根据计算矿化率(见公式1)来评估：
其中，(CO2)T为样品累计产生CO2的含量(mg)，(CO2)B为空白组累计产生CO2的含量(mg)和ThCO2为样品理论产生CO2的总含量(mg)(见公式2)。
其中，MTOT为测试材料的总干固重(mg)，CTOT为测试材料的总有机碳含量(％)。
在本发明的检测方法中，高分子材料降解产生的二氧化碳还可以采用本领域已知的其他检测手段进行检测，例如采用呼吸仪、红外光谱仪、气相色谱仪、酸碱滴定仪等。
实施例1
从中国天津港附近采集天然海水，通过平板计数显示其中的微生物含量为945CPU/mL，取3L该天然海水样本放入5L降解反应罐中，并向其中加入微生物所需的无机养分：浓度为0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4)，随后向该天然海水中放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的吸收肼中生成碳酸根离子。降解试验持续三个月，每隔15天从吸收肼溶液中取样，采用IC940型离子色谱仪测定所抽取的吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSepOrganic Acids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
实施例2
从中国天津港附近采集天然海水，通过平板计数显示其中的微生物含量为945CPU/mL，通过过滤法富集微生物，使微生物浓度提高到6.34x104CPU/mL，取3L该天然海水样本放入5L降解反应罐中，并向其中加入微生物所需的无机养分：浓度为0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4)，随后向该天然海水样本中放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的二氧化碳吸收肼中，降解试验持续三个月，每隔15天从吸收肼溶液中取样，采用IC940型离子色谱仪测定所抽取的吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSep Organic Acids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
实施例3
从中国天津港附近采集天然海水，运送至实验室后，通过平板计数显示其中的微生物含量为945CPU/mL，通过离心法富集微生物，使微生物浓度提高到8.14x106CPU/mL，取3L该天然海水样本放入5L降解反应罐，并向其中加入微生物所需的无机养分：浓度为0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4))，随后向该天然海水中放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的吸收肼中，降解持续三个月，每隔15天从该吸收肼溶液中取样，采用IC940型离子色谱仪测定所抽取的吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSep Organic Acids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
实施例4
在中国天津港附近使用微生物原位富集装置富集海水中的微生物，得到微生物含量为7.12x106CPU/mL的水体，从该水体中取3L放入5L降解反应罐中，并向其中加入微生物所需的无机养分：浓度为0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4)，随后放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的二氧化碳吸收肼中，降解持续三个月，每隔15天从该吸收肼溶液中取样，通过IC940型离子色谱仪测定所抽取的吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSep OrganicAcids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
实施例5
从中国天津港附近采集天然海水，通过平板计数显示其中的微生物含量为945CPU/mL，对微生物进行富集培养，随后分离微生物后加入置于5L降解反应罐中的3L天然海水中，随后放入，使海水中的微生物含量提高至8.51x106CPU/mL，并向该海水中加入微生物所需的无机养分：度为0.5g/L的0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4)，随后向该天然海水中放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的二氧化碳吸收肼中，降解持续三个月，每隔15天从吸收肼溶液中取样，通过IC940型离子色谱仪测定所抽取吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSep Organic Acids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
实施例6
从中国天津港附近采集天然海水，通过平板计数显示其中的微生物含量为945CPU/mL，对微生物进行富集培养，随后分离微生物后加入置于5L降解反应罐中的3L天然海水中，使海水中的微生物含量提高至3.56x109CPU/mL，并向该海水中加入无机养分：浓度为0.5g/L的NH4Cl和0.1g/L的KH2(PO4)，随后向该天然海水中放入1.5g薄膜状的待测样品PBSG50进行降解实验，将降解产生的二氧化碳引入盛有0.1mol/L的NaOH水溶液的二氧化碳吸收肼中，降解持续三个月，每隔15天从该吸收肼溶液中取样，通过IC940型离子色谱仪测定所抽取的吸收肼溶液中碳酸根离子的含量。该离子色谱仪使用MetroSep OrganicAcids-250/7.8色谱柱，淋洗液为0.5mM H2SO4，流速0.5mL/min，柱温30℃，定量环100μL，采用858自动进样器进样，通过电导检测器进行分析。每个样品三组平行取平均值。通过碳酸根离子浓度推算各个取样时刻的二氧化碳累计生成量以及矿化率(即降解率)。测定结果如下表1、图1A和图1B所示。
表1.实施例1至实施例6中基于碳酸根离子含量推算得到的降解三个月产生的二氧化碳累计释放量和相应的降解率
从上表1以及图1A和图1B所显示的测试结果可以看出，在上述实施例的检测方法中，由于对海水样本中的微生物数量进行了有效调控，在尽可能模拟真实海水降解环境的同时，使高分子材料的降解速率得到提高，缩短降解检测时间，有利于实验室高效准确地评价高分子材料在真实海水环境中的降解性能。
以上结合具体实施例对本发明进行了具体说明，这些具体实施例仅仅是示例性的，不能以此限定本发明的保护范围，本领域技术人员在不背离本发明的实质和范围的前提下可对本发明进行各种修改、变化或替换。因此，依照本发明所作的各种等同变化仍属于本发明所涵盖的范围。