阅读说明：本技术 一种曲伏前列素有关物质的检测方法 (Detection method of travoprost related substances ) 是由 陈立营 张成飞 方路平 王淑丽 王大庆 于 2021-01-15 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种曲伏前列素有关物质的检测方法,采用高效液相色谱法,色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱,紫外检测器检测,流动相由流动相A和流动相B组成,所述流动相A为磷酸水溶液,流动相B为乙腈-甲醇,梯度洗脱。本发明通过对流动相、洗脱梯度、流速及柱温的优化设计,使曲伏前列素、15-epi非对映异构体、5,6反式异构体达到基线分离,可有效测定15-epi非对映异构体、5,6反式异构体及其他有关物质含量,确保曲伏前列素及其制剂的质量可控。另外,此方法中所用流速相对较小且流动相不含缓冲盐,不易堵塞色谱柱,可提高色谱柱使用寿命和仪器耐用性。(The invention provides a method for detecting travoprost related substances, which adopts high performance liquid chromatography, and the chromatographic conditions comprise: detecting by using a chromatographic column of octadecylsilane bonded silica gel filler and an ultraviolet detector, wherein a mobile phase consists of a mobile phase A and a mobile phase B, the mobile phase A is a phosphoric acid aqueous solution, the mobile phase B is acetonitrile-methanol, and gradient elution is carried out. By optimally designing a mobile phase, an elution gradient, a flow rate and a column temperature, the invention enables the travoprost, the 15-epi diastereoisomer and the 5,6 trans isomer to achieve baseline separation, can effectively measure the contents of the 15-epi diastereoisomer, the 5,6 trans isomer and other related substances, and ensures the controllable quality of the travoprost and the preparation thereof. In addition, the flow rate used in the method is relatively small, and the mobile phase does not contain buffer salt, so that the chromatographic column is not easy to block, and the service life of the chromatographic column and the durability of the instrument can be improved.)

一种曲伏前列素有关物质的检测方法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其是涉及曲伏前列素有关物质的检测方法。

背景技术

曲伏前列素为异丙基酯前体药物，经眼部给药后被角膜水解酶水解成活性的游离酸，分布于眼组织中，结合后激活位于睫状肌和小梁细胞中的PG-FP受体。这种活化作用可激发细胞内信号传导的级联反应，导致肌醇三磷酸和甘油二酯的生成，并动员细胞内的钙离子，继而增加细胞中基质金属蛋白酶(MMP)前体的释放。MMP可降解葡萄膜巩膜房水流出途径中的细胞外基质，降低流出阻力，促进房水经葡萄膜巩膜通路流出，降低眼压，制剂为曲伏前列素滴眼液。

曲伏前列素有关物质较多，主要包含曲伏前列素相关化合物A、环氧化衍生物、15-epi非对映异构体、5,6-反式异构体和15-酮衍生物。其中，15-epi非对映异构体、5,6反式异构体为曲伏前列素的异构体，三者极性相近，不易分离，这对曲伏前列素的质量控制增加了难题。

曲伏前列素USP42药典收载的有关物质检测方法，存在诸多问题，例如采用美国药典方法，15-epi非对映异构体与曲伏前列素色谱峰间的分离度小于1.5，不同批次色谱柱保留时间有差异；采用缓冲盐流动相及高流速，易损耗色谱柱，降低柱效。

曲伏前列素滴眼液USP42药典收载的有关物质检测方法中，不同杂质采用不同流动相进行检测，至少需要检测两次，方法繁琐。

曲伏前列素滴眼液进口注册标准(JX20170195)收载的有关物质分析方法采用超高效，供试品浓度不宜过大，浓度稍高，出现过载现象，导致主峰与相邻杂质峰之间分离度不符合规定，不能准确有效的控制其质量。

此外，有文献报道曲伏前列素分析方法，但并未表明曲伏前列素相邻杂质的研究情况，且研究体系如波长，流动相与药典体系相差较大。

因此，我们需要建立一种新的分析方法，不仅可以缩短运行时间，提高色谱柱使用寿命；还可以同时分离检测多种有关物质，尤其是15-epi非对映异构体、曲伏前列素、5,6反式异构体三者之间的有效分离，这对曲伏前列素原料及其制剂质量控制有着重要意义。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种曲伏前列素有关物质的检测方法，以期至少部分地解决上述技术问题中的至少之一。

本发明涉及的有关物质包括曲伏前列素相关化合物A、环氧化衍生物、15-epi非对映异构体、5,6-反式异构体和15-酮衍生物，具体结构式如下：

本发明提供了一种曲伏前列素有关物质的检测方法，采用高效液相色谱法，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为磷酸水溶液，流动相B为乙腈-甲醇，梯度洗脱。

所述梯度设置如下：

进一步的，色谱条件包括：采用十八烷基硅烷键合硅胶填充剂的色谱柱，紫外检测器检测，流动相由流动相A和流动相B组成，所述流动相A为磷酸水溶液，流动相B为乙腈-甲醇，梯度洗脱，所述梯度设置如下：

进一步的，所述流动相B中乙腈-甲醇的体积比为(95-98)：(2-5)。

进一步的，所述流动相B中乙腈-甲醇的体积比为98：2。

进一步的，所述流动相A中磷酸的浓度为0.04％～0.06％。

进一步的，所述流动相A中磷酸的的浓度为0.05％。

进一步的，所用检测波长为218-222nm。

进一步的，所用检测波长为220nm。

进一步的，所用柱温设置为28℃～32℃。

进一步的，所用柱温设置为30℃。

进一步的，所用流速设置为2.0mL/min～3.0mL/min。

进一步的，所用流速设置为2.0mL/min～2.5mL/min。进一步的，所述磷酸为色谱级磷酸。

不同级别的磷酸，其色谱图基线噪音不同。磷酸选用不当，造成色谱图的基线噪音较大，基线不平，对杂质检测存在干扰，为避免上述情况，本发明的方法采用色谱级磷酸。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的曲伏前列素有关物质的检测方法，通过对流动相、洗脱梯度、流速及柱温的优化设计，使曲伏前列素、15-epi非对映异构体、5,6反式异构体达到基线分离，可有效测定15-epi非对映异构体、5,6反式异构体及其他有关物质含量，确保曲伏前列素及其制剂的质量可控。另外，本发明中流速相对较小且流动相不含缓冲盐，不易堵塞色谱柱，可提高色谱柱使用寿命和仪器耐用性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中混合对照溶液HPLC谱图；

图2为实施例1中曲伏前列素相关化合物A定位溶液的HPLC谱图；

图3为实施例1中环氧化衍生物定位溶液的HPLC谱图；

图4为实施例1中15-epi非对映异构体定位溶液的HPLC谱图；

图5为实施例1中5,6-反式异构体定位溶液的HPLC谱图；

图6为实施例1中15-酮衍生物定位溶液的HPLC谱图；

图7为实施例1中曲伏前列素定位溶液的HPLC谱图；

图8为实施例2中耐用性HPLC谱图-柱温30℃；

图9为实施例2中耐用性HPLC谱图-柱温28℃；

图10为实施例2中耐用性HPLC谱图-柱温32℃；

图11为实施例2中耐用性HPLC谱图-波长218nm；

图12为实施例2中耐用性HPLC谱图-波长222nm；

图13为实施例3中5,6-反式异构体检测限的HPLC谱图；

图14为实施例3中曲伏前列素检测限的HPLC谱图；

图15为实施例3中曲伏前列素相关化合物A检测限的HPLC谱图；

图16为实施例3中环氧化衍生物检测限的HPLC谱图；

图17为实施例3中15-epi非对映异构体检测限的HPLC谱图；

图18为实施例3中15-酮衍生物检测限的HPLC谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

曲伏前列素相关化合物A、环氧化衍生物、15-epi非对映异构体、5,6-反式异构体和15-酮衍生物对照品，外购。

实施例1专属性试验

溶液的配制详见表1。

表1溶液的配制

色谱条件：

色谱柱：ODS HYPERSIL(4.6mm×50mm,3μm)；

流动相A：0.05％磷酸水溶液；

流动相B：乙腈-甲醇(98:2)；

检测波长：220nm；

流速：2.5mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

按照下表进行梯度洗脱：

检测数据见表2，图谱见图1～7。

表2混合对照溶液及定位溶液结果

由表2可知，各已知杂质与相邻杂质间分离度均大于1.5，符合要求。

实施例2耐用性性试验

溶液的配制详见表3。

表3溶液的配制

色谱条件：

色谱柱：ODS HYPERSIL(4.6mm×50mm,3μm)；

流动相A：0.05％磷酸水溶液；

流动相B：乙腈-甲醇(98:2)；

流速：2.0mL/min；

进样量：5μL；

按照下表进行梯度洗脱：

检测数据见表4，图谱见图8～12。

表4耐用性结果

由表4可知，改变柱温及波长后，各杂质之间及杂质与主峰之间分离度均大于1.5，说明本品有关物质检测方法耐用性良好。

实施例3灵敏度试验

溶液的配制详见表5。

表5检测限溶液配制

色谱条件：

色谱柱：ODS HYPERSIL(4.6mm×50mm,3μm)；

流动相A：0.05％磷酸水溶液；

流动相B：乙腈-甲醇(98:2)；

检测波长：220nm；

流速：2.5mL/min；

柱温：30℃；

进样量：5μL；

按照下表进行梯度洗脱：

检测数据见表6，图谱见表图13～18。

表6灵敏度试验结果

由表6可知，曲伏前列素、曲伏前列素相关化合物A、环氧化衍生物、15-epi非对映异构体、5,6-反式异构体、15-酮衍生物检测限浓度分别为供试品浓度的0.019％、0.012％、0.0088％、0.023％、0.023％、0.015％，信噪比均大于3，检测灵敏度高，符合验证要求。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。