漆黄素在抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤增殖中的应用
阅读说明：本技术 漆黄素在抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤增殖中的应用 (Application of fisetin in inhibition of pancreatic cancer cell and mouse pancreatic cancer tumor proliferation ) 是由 曹利平 贾盛楠 赵冰冰 徐晓冬 丁国平 于 2021-09-26 设计创作，主要内容包括：本发明首先提供了漆黄素的一种新的用途,即在制备用于抑制胰腺癌细胞或小鼠胰腺癌肿瘤增殖的制品中的应用。本发明再一个方面还提供一种用于抑制胰腺癌细胞或小鼠胰腺癌肿瘤增殖的制品,所述的制品中包含有药理有效浓度的漆黄素。本发明发现漆黄素能抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤的增殖,可将漆黄素用于抗胰腺癌治疗新药物的制备。(The invention firstly provides a new application of fisetin, namely an application in preparing a product for inhibiting pancreatic cancer cells or mouse pancreatic cancer tumor proliferation. In still another aspect, the present invention provides a preparation for inhibiting pancreatic cancer cell or mouse pancreatic cancer tumor proliferation, wherein the preparation comprises fisetin in a pharmacologically effective concentration. The invention discovers that fisetin can inhibit proliferation of pancreatic cancer cells and mouse pancreatic cancer tumors, and fisetin can be used for preparing a new medicine for treating pancreatic cancer.)
技术领域
本发明属于胰腺癌治疗药品制备技术领域，具体涉及一种中药小分子化合物漆黄素(Fisetin)在抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤增殖中的应用。
背景技术
胰腺癌(PDAC)是一种临床常见的消化系统恶性肿瘤，是最具侵袭性的肿瘤之一，由于其特殊的解剖位置和肿瘤生物学行为，导致其预后极差，五年生存率在所有肿瘤中持续位列倒数第一，远低于其它肿瘤。现今，辅助化疗、放疗、免疫治疗及靶向治疗等手段在胰腺癌患者中的应用也日益普遍，虽然在一定程度上延长了患者的总生存期，但是治疗效果十分有限。因此，迫切需要新的治疗方法。
近年来，随着中医药治疗在肿瘤领域研究的不断深入，现代中药新制剂在对肿瘤患者实施临床治疗过程中取得了较好的进展。传统中医药物改进为中成药能很好的避免在以往治疗过程中出现的治疗应用复杂等情况。因此筛选有效抑制胰腺癌增殖的中药小分子化合物，深入研究其作用的分子机制，对胰腺癌临床治疗及新化疗方案的研发具有重要意义，也具有极好的临床转化和应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供漆黄素在抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤增殖中的应用，即利用漆黄素来抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤增殖，从而弥补现有胰腺癌治疗方法的不足。
本发明首先提供了漆黄素的一种新的用途，即在制备用于抑制胰腺癌细胞或小鼠胰腺癌肿瘤增殖的制品中的应用。
本发明再一个方面还提供一种用于抑制胰腺癌细胞或小鼠胰腺癌肿瘤增殖的制品，所述的制品中包含有药理有效浓度的漆黄素；
所述的药理有效浓度不低于50μM；
更进一步的，所述的药理有效浓度为80-400μM；
所述的制品，为液体制品；
作为一种具体的液体制品，是将漆黄素添加到用于培养胰腺癌细胞的培养基中；
其中在培养基中的漆黄素的添加浓度为80-400μM；
另一种制品，为添加有漆黄素的DMSO溶液，其中漆黄素的添加浓度为0.559-1.048mmol/kg。
本发明发现漆黄素能抑制胰腺癌细胞和小鼠胰腺癌肿瘤的增殖，可将漆黄素用于抗胰腺癌治疗新药物的制备。
附图说明
图1：漆黄素对胰腺癌细胞(PANC-1)增殖的影响图，其中图A为通过CCK-8测定测量PANC-1细胞的细胞活力。细胞分别用漆黄素(0、25、50、100、200和400μM)处理24和48小时。在450nm处测量吸光度。数据表示为平均值±SD；*P≤0.05，#P≤0.05，图B为胰腺癌PANC-1细胞的实时细胞分析(RTCA)。使用xCELLigence RTCA DP仪器检测漆黄素(0-400μM)处理细胞72小时的细胞增长情况。每15分钟记录一次，每个点代表来自具有SD的三个重复的平均值。
图2：漆黄素对小鼠胰腺癌肿瘤增殖的影响图。
图3：漆黄素对小鼠胰腺癌肿瘤组织的增殖相关蛋白的影响图。
图4：漆黄素对PANC-1细胞生长和增殖相关蛋白的影响图。
具体实施方式
漆黄素(Fisetin)是一种天然的类黄酮化合物，其来源广泛，价廉易得，具抗炎、抗氧化、抗凝血、抗血栓、治疗糖尿病肾损伤等广泛的药理活性。但申请人在研究中发现，使用漆黄素处理胰腺癌细胞系PANC-1后，PANC-1的增殖能力被显著抑制。使用漆黄素处理异种移植胰腺癌小鼠，胰腺癌肿瘤的增殖能力也被显著抑制，从而促成了本发明。
下面结合实施例对本发明进行详细的描述：
实施例1：漆黄素能抑制胰腺癌细胞(PANC-1)增殖
1、CCK8实验
将PANC-1细胞接种在96孔细胞培养板中，选择合适的铺板细胞数，每孔加入100μL细胞悬液，5个重复孔，37℃培养箱中培养，待细胞贴壁后，分别添加不同浓度的漆黄素(0、25、50、100、200和400μM)处理24和48小时，无血清培养基加入10％CCK8的培养基，以换液的形式加入，37℃培养箱中培养2h，在波长450nm处，检测吸光度。
结果如图1A所示，25μM和50μM浓度的漆黄素不能显著抑制PANC-1细胞的活力，但100μM、200μM和400μM水平的漆黄素能有效的抑制PANC-1细胞的增殖。
2、实时细胞分析(RTCA)
将PANC-1细胞接种在96孔细胞培养板中，然后用漆黄素(0-400μM)处理细胞72小时,使用xCELLigence RTCA DP仪器监测细胞生长，系统每15分钟记录一次阻抗，图像x轴表示治疗后的时间，y轴反映了与细胞数量的一致的对数关系，每个点代表来自具有SD的三个重复的平均值。
结果如图1所示，漆黄素以剂量和时间依赖性方式抑制PANC-1细胞的增殖。
实施例2：漆黄素能抑制小鼠胰腺癌肿瘤增殖
1、异种移植小鼠模型
动物实验按照实验动物护理和使用的机构指南进行。10只4周龄雌性BALB/c裸鼠获自中国科学院上海实验动物中心。通过在3％异氟醚麻醉下在小鼠腋下注射1×106荧光素酶标记的PANC-1细胞(Luc-PANC-1)构建皮下异种移植小鼠模型。将小鼠分成两组，每组五只小鼠。治疗组小鼠每隔一天用0.1mL Fisetin(1.048mmol/kg体重)腹膜内注射治疗。肿瘤体积的计算公式为0.52×长×宽2。对照组腹膜内注射0.1mL DMSO。
2、生物发光成像
使用3％异氟醚麻醉小鼠，然后给小鼠腹膜内注射200μL(15mg/mL)D-荧光素。15分钟后，使用IVIS Lumina Series III(Perkin Elmer，美国)对肿瘤进行成像。数据表示为平均辐射率(光子/秒/平方厘米/球面度)，这是光子发射的校准测量值。
结果如图2显示，结果表明漆黄素治疗的小鼠肿瘤大小显著减少。
实施例3：漆黄素能抑制小鼠胰腺癌组织的增殖相关蛋白
1、组织固定
4％多聚甲醛溶液固定组织，依次放入70％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇中各30min，二甲苯1h×2次脱水透明，浸泡于石蜡溶液中包埋，切片机切成4μm薄片，在水浴锅中放在载玻片上，60℃烘干。
2、HE染色
石蜡切片烘干过夜；二甲苯常规脱蜡2次，5min/次；无水乙醇洗脱二甲苯2次，10min/次；95％、90％、85％、80％、75％乙醇中脱蜡，5min/次。苏木素染色5min，流水冲洗2min，1％的盐酸酒精分化数秒，流水冲洗，稀氨水返蓝30s，流水冲洗1min，伊红溶液染色10min，流水冲洗30s。75％、80％、95％、95％、100％、100％酒精脱水，1min/次；二甲苯透明2次，2min/次；中性树脂封片，60℃烤箱中烤干。使用光学显微镜图像采集，观察细胞形态学变化。
3、免疫组化
100％、100％、95％、95％、90％、80％、70％乙醇中10min进行脱蜡；清水冲洗，3％H2O2浸泡10min进行水化，0.01M柠檬酸盐缓冲液，微波炉中火3min，冷却至室温，重复两次。水洗两次，PBS洗两次，擦干周围液体，加入10％血清37℃30min进行封闭。擦干周围血清，滴加PCNA一抗，4℃过夜，室温复温1h。PBS洗三次，擦干周围PBS，滴加二抗，37℃30min。PBS洗三次，擦干周围PBS,滴加1％SABC，37℃30min。PBS洗三次，擦干周围PBS，滴加显色剂。清水冲洗，浸泡于苏木精染色剂中染色。清水冲洗，依次放入70％、80％、90％、95％、95％、100％、100％乙醇和二甲苯中2min。擦干周围的二甲苯，滴加中性树脂，盖上盖玻片，通风柜中干燥。
实验结果如图3显示，漆黄素治疗组小鼠肿瘤内增殖相关蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)显著降低。
实施例4：漆黄素抑制PANC-1细胞生长和增殖相关蛋白
1、Western blot
使用漆黄素处理胰腺癌PANC-1细胞，对照组使用DMSO处理。刮刀收取细胞，6000rpm，离心3分钟，弃上清。加入裂解液，冰上裂解30min，4℃，12000rpm，离心20min，留上清，BCA试剂盒检测蛋白浓度后，调整浓度一致后，上清加入4×SDS-PAGE loading buffer混匀。
根据蛋白的分子大小，配置10％SDS-PAGE分离凝胶，去离子水压齐，配置5％浓缩胶，插入梳子，凝固后，上样，电泳(恒压：浓缩胶80V、分离胶120V)分离蛋白。湿转法(恒流：300mA)将蛋白转移到甲醇激活的PVDF膜上，5％脱脂牛奶溶液封闭1h。TBST洗膜3次，孵育一抗稀释液过夜4℃，吸出一抗，TBST洗膜3次，室温下孵育二抗稀释液1h，化学发光仪显色。
实验结果如图4显示，漆黄素处理降低了细胞生长和增殖相关蛋白PCNA、Ki67和磷酸化组蛋白H3(p-H3)的表达。