具体实施方式

本部分第一方面对发明中一些用途进行说明：

菊粉的新用途，其中，所述新用途至少为下述之一

(i)菊粉在制备细胞表达分泌MMP2和/或MMP9抑制剂中的应用，优选的所述细胞为T细胞或巨噬细胞，

(ii)菊粉在制备动脉瘤CD3+T细胞浸润和/或CD68+巨噬细胞浸润抑制剂中的应用，

(iii)菊粉在制备动脉瘤巨噬细胞向M1促炎表型极化抑制剂和/或巨噬细胞向M2抑炎表型极化促进剂中的应用，优选的巨噬细胞为动脉瘤局部巨噬细胞，

(iv)菊粉在制备肠道屏障相关蛋白基因表达促进剂中的应用，所述肠道屏障相关蛋白至少包括紧密连接蛋白、闭合蛋白、粘蛋白、钙粘蛋白中之一，

(v)菊粉在制备小肠杯状细胞增殖促进剂中的应用，

(vi)菊粉在制备肠道抗菌复合物表达促进剂中的应用，所述肠道抗菌复合物至少包括抗菌肽、磷脂酶A2、防御素、溶菌酶C中之一，

(vii)菊粉在制备肠道菌群LPS易位抑制剂中的应用，

(viii)菊粉在制备抑制外周血和/或动脉瘤局部细菌载量制剂中的应用，

(ix)菊粉在制备细胞CCR2表达抑制剂中的应用，所述细胞至少为Ly6Chi单核细胞，

(x)菊粉在制备外周血Ly6Chi单核细胞迁移能力抑制剂中的应用，

(xi)菊粉在制备降低外周血LPS和/或IL-1β水平制剂中的应用。

上述公开了菊粉在致病机理(基础病症)调节中的应用，凡是由上述机理引起的或相关的疾病、或指标异常治疗时，可相应采用菊粉进行治疗，无论作为主要成本还是辅料均应在本发明范围内。

菊粉在制备制剂中新用途，其中，所述在制备制剂中的新用途至少为下述之一

(i)菊粉在制备抗腹主动脉瘤瘤体扩张制剂中的应用，

(ii)菊粉在制备抑制腹主动脉瘤血管壁外膜弹力纤维降解制剂中的应用，

(iii)菊粉在制备抗腹主动脉瘤瘤体局部炎症制剂中的应用，

(iv)菊粉在制备防治小肠疾病制剂中的应用，

(v)菊粉在制备降低小肠肠道通透性制剂和/或抑制小肠肠道通透性增强制剂中的应用，

(vi)菊粉在制备防治小肠肠道屏障障碍制剂中的应用，

(vii)菊粉在制备防治血管慢性炎症疾病制剂中的应用，优选的，所述疾病为腹主动脉瘤，

(viii)菊粉在制备抑制促炎型单核细胞向动脉瘤浸润制剂中的应用。

上述公开了菊粉在一些疾病中的应用，疾病治疗时，可相应采用菊粉进行治疗，无论是主要成本还是辅料均应在本发明范围内。

本部分第二方面对发明中一些制剂或产品进行说明：

制剂，含有菊粉；其中，所述制剂至少为下述之一

(a)细胞表达分泌MMP2和/或MMP9抑制剂，优选的所述细胞为T细胞或巨噬细胞，

(b)腹主动脉瘤CD3+T细胞浸润和/或CD68+巨噬细胞浸润抑制剂，

(c)腹主动脉瘤巨噬细胞向M1促炎表型极化抑制剂和/或巨噬细胞向M2抑炎表型极化促进剂，优选的巨噬细胞为动脉瘤局部巨噬细胞，

(d)肠道屏障相关蛋白基因表达促进剂，所述肠道屏障相关蛋白至少包括紧密连接蛋白、闭合蛋白、粘蛋白、钙粘蛋白中之一，

(e)小肠杯状细胞增殖促进剂，

(f)肠道抗菌复合物表达促进剂，所述肠道抗菌复合物至少包括抗菌肽、磷脂酶A2、防御素、溶菌酶C中之一，

(g)肠道菌群LPS易位抑制剂，

(h)抑制外周血和/或动脉瘤局部细菌载量制剂，

(i)细胞CCR2表达抑制剂，所述细胞至少包括Ly6Chi单核细胞，

(j)外周血Ly6Chi单核细胞迁移能力抑制剂，

(k)降低小肠外周血LPS和/或IL-1β水平的制剂。

上述中，至少为表示其可以为其中一种或多种，只要不相互矛盾均可并存。上述中，制剂在具体的疾病治疗中应用不做限定，只要制剂与上述作用机理一致或等同，均应在本发明范围内。

防治慢性炎症性血管疾病的制剂，含有菊粉。

防治腹主动脉瘤疾病的制剂，含有菊粉；其中，所述制剂至少为下述之一

(a)抗腹主动脉瘤瘤体扩张的制剂，

(b)抑制腹主动脉瘤血管壁外膜弹力纤维降解的制剂，

(c)抗腹主动脉瘤瘤体局部炎症的制剂，

(d)抑制促炎型单核细胞向动脉瘤浸润的制剂,优选的，所述促炎型单核细胞包括Ly6Chi单核细胞。

一些方式中，所述防治腹主动脉瘤疾病的制剂至少为药物、调理保健产品、功能食品中之一。

防治小肠相关疾病的制剂，含有菊粉；其中，所述制剂至少为下述之一

(a)降低小肠肠道通透性制剂和/或抑制小肠肠道通透性增高的制剂，

(b)防治小肠肠道屏障障碍的制剂。

一些方式中，所述防治小肠相关疾病的制剂至少为药物、调理保健产品、功能食品中之一。

防治小肠屏障障碍疾病和/或小肠屏障障碍诱发病症的制剂，含有菊粉，优选的所述小肠屏障障碍诱发病症至少包括脓毒血症、SIRS、MODS、缺血性肠病之一，小肠屏障障碍疾病包括急性心肌梗死、脑卒中。

一些方式中，前述制剂、药物、调理保健产品为口服型制剂。

本发明所述的制剂，不完全限定为需要通过国家药监局批准上市的制剂，另一些具有保健、调理的产品，只要其所针对的作用对象与本发明中相同(或等同)的，均应在本发明范围内。之一不限定只能为一种，其为至少一种。

现有的一些研究认为菊粉具有一定的致癌性，但是本研究发现其针对部分疾病具有较好的缓解治疗作用。

前述的抑制剂(促进剂)包括针对相应异变症状起到直接或间接作用的制剂或其他产品(比如调理用食物)，其以制剂或产品使用时所针对的问题、所达到效果为参考。

本部分第三方面对各研究项目做进一步说明：

(I)菊粉改善小鼠腹主动脉瘤

方法：添加可发酵的纤维“菊粉”或低度发酵纤维“纤维素”模拟普通饮食(5％纤维素)和两种高纤维饮食(分别富含15％菊粉、15％纤维素)。给予8-10周龄雄性C57BL/6小鼠普通饮食或高纤维饮食4周后，构建PPE诱导的AAA模型，继续喂养2周，评估小鼠AAA疾病进展情况。对小鼠进行安乐死后分离全主动脉，离体测量瘤体直径评价AAA瘤体扩张程度；动脉瘤组织固定、石蜡包埋、切片，弹力纤维染色(EVG)评估弹力纤维降解程度；免疫组织化学染色(IHC)评估基质金属蛋白酶(MMP)2和MMP9在瘤体中的表达；IHC评估CD3⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞在瘤体中的浸润；流式细胞术检测动脉瘤局部巨噬细胞M1、M2、M1/M2的比例。

结果：与普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食相比，富含菊粉的高纤维饮食能够减轻PPE-AAA小鼠的瘤体扩张，降低PPE-AAA小鼠瘤体组织基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达和弹力纤维的降解，减少PPE-AAA小鼠瘤体组织CD3⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞浸润，抑制瘤体局部巨噬细胞向M1型分化，促进其向M2型分化，从而降低M1/M2比例。与普通饮食相比，富含纤维素的高纤维饮食则不具有这些作用。

结论：与普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食相比，富含菊粉的高纤维饮食能够保护小鼠AAA，减轻小鼠AAA瘤体扩张以及弹力纤维降解，改善瘤体局部炎症，使瘤体局部微环境表现为抗炎修复的特点。而富含纤维素的高纤维饮食不具有这些AAA保护作用。

(II)菊粉改善肠道屏障功能并减少细菌易位及其引起的系统性炎症反应

方法：添加可发酵的纤维“菊粉”或低度发酵纤维“纤维素”模拟普通饮食(5％纤维素)和两种高纤维饮食(分别富含15％菊粉、15％纤维素)。给予8-10周龄雄性C57BL/6小鼠普通饮食或高纤维饮食4周后，构建PPE诱导的AAA模型，继续喂养2周，取外周血、动脉瘤和肠道组织。肠道组织固定包埋切片进行PAS-AB染色，观察小肠和结肠杯状细胞的数目和粘蛋白含量。实时PCR检测小肠和结肠组织中与屏障功能相关的ZO-1、Occludin、Muc2、CDH1和抗菌肽Reg3γⅢ、Pla2g2、α-defensins、lysozyme C的mRNA表达水平。此外，在处死小鼠前一天禁食过夜，4kDFITC-右旋糖酐灌胃，取外周血血浆检测FITC荧光强度用以指征肠道通透性。终点显色法检测血浆LPS；ELISA检测血浆系统性炎症指标IL-1β；细菌定量PCR检测外周血、动脉瘤易位细菌总量；流式细胞术检测外周血Ly6C^hi、Ly6C^low单核细胞，Ly6G⁺中性粒细胞的比例，单核细胞中趋化因子受体(C-C chemokine receptor,CCR)2的表达，以及动脉瘤局部Ly6C^hi单核细胞的比例。

结果：富含菊粉而非纤维素的高纤维饮食降低AAA小鼠的肠道通透性，增加小肠杯状细胞数目、肠道屏障功能相关蛋白和抗菌肽基因的表达，但对结肠无明显影响。富含菊粉而非纤维素的高纤维饮食降低AAA小鼠外周血LPS及系统性炎症指标IL-1β水平。AAA小鼠肠道通透性FITC与LPS、动脉瘤直径均呈正相关，且LPS与动脉瘤直径也呈正相关。富含菊粉的高纤维饮食减少AAA小鼠外周血及动脉瘤局部的细菌载量。与普通饮食相比，富含菊粉而非纤维素的高纤维饮食能够降低AAA小鼠外周血促炎型Ly6C^hi单核细胞比例，同时通过下调CCR2的表达抑制其向动脉瘤局部迁移，但对Ly6C^low单核细胞和Ly6G⁺中性粒细胞无明显影响。此外，富含菊粉而非纤维素的高纤维饮食喂养的AAA小鼠中，动脉瘤局部Ly6Chi单核细胞浸润减少。

结论：富含菊粉的高纤维饮食可促进小肠杯状细胞增多，肠道上皮屏障功能相关蛋白和抗菌肽表达增加，从而保护肠道屏障功能，而富含纤维素的高纤维饮食不具有该作用。富含菊粉的高纤维饮食通过保护肠道屏障功能，减少细菌及其组分LPS易位，从而抑制Ly6C^hi单核细胞介导的系统性炎症反应及其向动脉瘤局部的浸润，延缓腹主动脉瘤进展。

本部分第四方面结合一实验项目对菊粉与腹动脉瘤关联性等进行说明：

实验内容

1实验材料

1.1实验动物：C57BL/6，8-10周，雄性小鼠于武汉同济医学院SPF级实验动物中心饲养，并根据实验分组分别给予不同的定制饲料。按照美国国立卫生研究所颁布的《实验动物饲养和使用指南》以及《华中科技大学同济医学院实验动物管理办法》规定进行动物处理。已通过华中科技大学同济医学院附属协和医院伦理委员会批准。

1.2小鼠喂养及饲料配方：普通饮食小鼠喂养饲料为含有5％纤维素的普通饲料(D10012M)。高纤维饮食小鼠分为两组，一组为含有15％纤维素的高纤维饮食饲料(RD18013004)喂养，另一组为含有15％菊粉的高纤维饮食饲料(RD18013005)喂养。每三天更换一次饲料。定制饲料喂养4周后进行AAA造模，参见图1中。辐照灭菌后进入SPF动物实验中心供小鼠喂养使用。饲料配方如下：

1.3主要实验仪器

1.4主要试剂及抗体

1.5溶液配制

1.5.1戊巴比妥钠溶：实验中所用的戊巴比妥钠-生理盐水溶液的浓度为1％。称100mg戊巴比妥钠粉末，用无菌生理盐水10ml将其溶解混匀，常温保存。麻醉时剂量为10μl/g，安乐死时剂量为20μl/g，腹腔注射。

1.5.2磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)

混匀后调PH值至7.4即为0.01M PBS，高压灭菌后分装，4℃保存。

1.5.3肝素钠溶液：1L无菌生理盐水溶解100mg肝素钠粉末。

1.5.4组织切片染色所需溶液

2实验方法

2.1 PPE弹力蛋白酶诱导小鼠AAA模型

1)戊巴比妥钠麻醉；

2)仰卧位固定，酒精消毒后剃去腹部毛发，再次消毒腹部皮肤，依次沿腹正中线剪开皮肤及肌肉层；

3)用镊子夹取无菌棉球，将腹腔的肠子从右下轻轻拨到左上，在体式显微镜下用显微镊剥离腹主动脉周围脂肪组织，暴露腹主动脉；

4)将棉片用PPE溶液浸湿，包裹暴露的动脉，假手术组将PPE改换为生理盐水；

5)40min后取出棉片，生理盐水冲腹2次，间断缝合关腹，将小鼠至于电热毯上直至其苏醒；

6)造模后第14天将小鼠安乐死，并进行各项评估。

2.2小鼠瘤体直径测量

1)将小鼠安乐死后，注射器吸取肝素，从心尖处进针冲洗动脉；

2)在体式显微镜下用显微器械分离全主动脉；

3)单反拍照(带标尺)；

4)image J测量动脉瘤最大直径

2.3组织固定、石蜡包埋、切片

1)取样本4％多聚甲醛(PFA)固定；

2)洗去PFA：固定完毕后，流水冲洗3次，每次5min；

3)酒精梯度脱水：50％-70％-80％-95％-95％酒精各2h；100％乙醇40min，2次；

4)透明：50％乙醇+50％二甲苯5min-30min，透明过程中及时观察组织形态调整透明时间，在光照下观察组织是否透明成功，透明适度即可；

5)浸蜡：60℃条件下，先软蜡后硬蜡，各2次，每次50min；

6)包埋：快速将组织块放入盛有蜡液的模具中，所需组织切面与底部平行，防止蜡液在冷环境中凝固；

7)切片：每张切片厚度为4μm；AAA每个瘤体切8张切片，间隔100μm。

2.4 EVG染色

1)固定、包埋、切片，二甲苯脱蜡10min，

2)水化：无水乙醇5min，2次；95％-90％-80％-70％酒精各5min；水洗；

3)verhoeff’s苏木精室温染色30min至颜色呈深黑色，水洗；

4)三氯化铁溶液(2％)分化，水洗；

5)硫代硫酸钠(5％)1min，水洗；

6)Van Gieson’s液复染5min，水洗，脱水，树脂封片。

2.5免疫组织化学染色(IHC)

1)高压法抗原修复：0.01M枸橼酸钠缓冲液；

2)3％H₂O₂孵育10min；

3)PBST洗5min，摇床震荡，洗3次；

4)5％BSA封闭30min；

5)孵育一抗，4℃过夜(本研究所用抗体分别为抗小鼠CD3、CD68、MMP2、MMP9，1:100稀释后使用)；

6)在摇床上用PBST洗涤5min，3次；

7)孵育二抗即IgG-HRP辣根过氧化物酶，37℃，30min；

8)PBST洗5min，摇床震荡，洗3次；

9)DAB显色液显色2min，水洗；

10)苏木精复染10s，水洗；

11)返蓝、透明、封片。

2.6组织切片统计：显微镜观察切片并拍照(带标尺)，Adobe Photoshop和ImagePro Plus计算阳性面积比。

EVG染色率以阳性染色面积占主动脉总截面面积的百分比表示。

CD68+巨噬细胞和CD3+T细胞的数量：通过计算动脉瘤各横截面上阳性染色细胞的平均数量来评估。

基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的含量：阳性染色面积与总横断面面积之比，每只小鼠计算4-8个切片取平均值。

2.7流式细胞术

2.7.1制备小鼠动脉单细胞悬液

1)显微镜下分离全主动脉后，用显微剪将其彻底剪碎；

2)血管消化酶37℃消化20min，3次，每支血管每次消化用酶800μl；

3)收集消化液，滤网过滤，PBS洗涤后重悬即为血管单细胞悬液；

2.7.2流式细胞染色及流式分析

1)将上述单细胞悬液转移到流式管，留100μl液体；

2)加入细胞膜表面标记抗体，4℃避光孵育30min：动脉巨噬细胞(抗CD45-APCcy7、抗CD11b-PerCp/cy5.5、抗F4/80-BV421、抗CD206-PEcy7、抗I-A/I-E-APC)；

3)PBS洗去抗体，加入200μl IC固定液固定，室温避光孵育30min；

4)PBS洗去固定液，加入100μl PBS重悬；

5)上机前加入5μl流式计数微球Counting Beads；

6)流式细胞仪分析检测，细胞总数目＝5*1.03*10^3*流式检测细胞数目/流式检测beads数目。

3.统计检验方法：数据以mean±SEM表示。使用GraphPad Prism软件(GraphPadPrism 8.0 software Inc.)进行统计分析。正态检验采用Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验综合分析。如果数据符合正态分布，在分组为3的统计中采用单因素方差分析和Tukey多重比较检验。对于非正态分布的数据，采用非参数Mann-Whitney U检验。P<0.05具有统计学意义，样本量分别在各自的图表中标注。

结果分析

(一)菊粉减轻PPE-AAA小鼠瘤体扩张

在体式显微镜下分离全主动脉，拍照并测量动脉瘤瘤体最大直径；C57小鼠经普通饲料(CD)、15％纤维素饲料(HFD-Cell)、15％菊粉饲料(HFD-In)喂养4周后建立弹力蛋白酶PPE诱导的AAA模型，继续使用定制饲料喂养14天后，拍照并测量动脉瘤瘤体直径(肾下最大直径)。结果显示富含菊粉的高纤维饮食组小鼠AAA瘤体直径明显小于普通饮食组和富含纤维素的高纤维饮食组，且普通饮食组小鼠瘤体直径与富含纤维素的高纤维饮食组无明显统计学差异(图2)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001，检验方法为单因素方差分析和Tukey多重比较检验(下同)。这表明富含菊粉的高纤维饮食能够减缓AAA疾病进展，而富含纤维素的高纤维饮食并不能减缓AAA，不同成分的高纤维饮食对AAA具有不同影响。

(二)菊粉减轻PPE-AAA小鼠瘤体弹力纤维的降解和组织MMP2、MMP9的表达

进一步通过EVG染色分析AAA瘤体扩张是否同时伴有中膜弹力纤维降解的特征性病理改变，结果发现，与普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食相比，富含菊粉的高纤维饮食组小鼠AAA外膜弹力纤维降解减少，且富含纤维素的高纤维饮食组相比普通饮食组没有明显改善(图3)。C57小鼠经普通饲料(CD)、15％纤维素饲料(HFD-Cell)、15％菊粉饲料(HFD-In)。由于细胞表达并分泌基质金属蛋白酶MMP2和MMP9是降解细胞外基质的重要机制，因此，通过IHC检测瘤体组织MMP2和MMP9的表达。结果与血管外膜弹力纤维降解程度一致，即相比普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食，富含菊粉的高纤维饮食组小鼠瘤体组织基质金属蛋白酶MMP2(图4)和MMP9(图5)的表达减少，且普通饮食组和富含纤维素的高纤维饮食组之间无统计学差异。C57小鼠经普通饲料(CD)、15％纤维素饲料(HFD-Cell)、15％菊粉饲料(HFD-In)。

(三)菊粉减轻PPE-AAA小鼠瘤体组织CD3+T细胞、CD68+巨噬细胞浸润

T细胞和巨噬细胞是AAA中富集程度最高的细胞，具有分泌各种炎症细胞因子和基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的能力，从而促进炎症反应，加剧AAA进展。通过免疫组织化学染色的方法评价瘤体组织局部CD3⁺T细胞和CD68⁺巨噬细胞的浸润情况。结果显示，与普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食组相比，富含菊粉的高纤维饮食组AAA瘤体局部CD3+T细胞(图6)和CD68+巨噬细胞(图7)的浸润明显减少。C57小鼠经普通饲料(CD)、15％纤维素饲料(HFD-Cell)、15％菊粉饲料(HFD-In)喂养4周后建立弹力蛋白酶PPE诱导的AAA模型，继续使用定制饲料喂养14天后，取AAA瘤体固定包埋切片，免疫组化染CD3、CD68。10倍镜下横截面中阳染细胞数的统计分析，每个点代表同一瘤体3-4个截面的平均值。富含菊粉的高纤维饮食可以改善AAA瘤体局部炎症，而富含纤维素的高纤维饮食则不具有该作用。

(四)菊粉抑制动脉瘤局部巨噬细胞向促炎表型极化

鉴于巨噬细胞促炎型M1和抑炎型M2平衡在AAA中的中心作用对动脉瘤局部巨噬细胞的M1、M2表型进行流式分析(图8中A)，A图为动脉瘤局部M1、M2巨噬细胞流式圈门示意图。相比普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食，富含菊粉的高纤维饮食组AAA局部的M1型(I-A/I-E+CD206-)巨噬细胞减少、而M2型(I-A/I-E-CD206+)巨噬细胞增多，M1/M2显著降低(图8中B)，图8中B图为动脉瘤局部M1、M2、M1/M2比例统计图。n＝5，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。该结果表明，菊粉使巨噬细胞向M2型抑炎表型极化，抑制炎症反应在AAA扩张过程中形成的正反馈，发挥AAA保护作用。

本研究通过动物实验发现，菊粉可以通过降低基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的表达减少AAA血管壁中膜弹力纤维的降解，减轻动脉瘤局部CD3+T细胞和CD68+巨噬细胞的浸润，抑制动脉瘤局部巨噬细胞向促炎M1表型倾斜，改善AAA瘤体扩张，而富含纤维素的高纤维不具有该作用。

本部分第五方面结合一实验项目对菊粉与肠道功能等关联的内容进行说明：

实验内容

1实验材料

1.1实验动物：同前述第四方面相应内容

1.2小鼠喂养及饲料配方：同前述第四方面相应内容

1.3主要实验仪器：除前述第四方面内容中所用仪器外，还需用到以下仪器：

1.4主要试剂和抗体：除第四方面内容所用试剂外，还需用到以下试剂：

1.5溶液配制：

1.5.1血管消化酶混合液(10X)

于-20℃保存，使用前用PBS稀释10倍。

1.5.2流式细胞染色缓冲液

pH调至7.2-7.4待用，4℃保存。

2.实验方法

2.1弹力蛋白酶(PPE)诱导小鼠腹动脉瘤模型(详见第四方面)

2.2肠道通透性检测

1)普通饮食(CD)、富含纤维素的高纤维饮食(HFD-Cell)、富含菊粉的高纤维饮食(HFD-In)喂养小鼠4周后建立PPE-AAA模型。继续定制饲料喂养13天后，禁食过夜，4kDFITC-右旋糖酐灌胃；

2)灌胃后4小时，过量麻药处死小鼠，取外周血于无热原EDTA抗凝管中，取血时尽量避免溶血；

3)外周血3000rpm离心5min，吸取上清即为血浆，分装并于-80℃保存备用；

4)吸取40μl血浆于透明的96孔板中，在激发光485/发射光528nm条件下检测FITC荧光强度。

2.3 Real-time PCR检测肠道组织屏障相关蛋白、抗菌肽的表达

2.3.1肠道总RNA提取：酚-氯仿抽提法

1)取去除内容物、经冰PBS漂洗干净后的肠组织，用高压过的剪刀剪取近盲肠的小肠和结肠肠段2cm放入1.5ml离心管中，并加入2个无RNA酶的研磨珠以及1ml Trizol；

2)在快速低温匀浆机上匀浆100rpm，90s，5次；

冰上静置30-60min；

4)加入200μl氯仿后盖紧管盖，用力震荡混匀15s，冰上静置10min使之分层，提前预冷离心机；

5)4℃离心12000rpm/min，15min；

6)将离心后的上层液体(水相)转入新的1.5ml离心管中(约400μl)，注意勿吸取白色中间层和红色下层液体，加入等体积异丙醇，震荡混匀10s，冰上静置10min；

7)4℃离心12000rpm/min，15min；

8)弃上清，加1ml无水乙醇(预冷)，上下摇晃混匀，4℃离心7500rpm/min，5min；

9)弃上清，在超净工作台中风干，在管中加20-40μl DEPC水溶解总RNA；

10)用NanoDrop测量RNA纯度和浓度，纯度以260nm吸光度与280nm吸光度之比表示，1.85-2.05为宜。

2.3.2逆转录反应

采用TaKaRa公司的逆转录试剂，将提取的总RNA逆转录成cDNA，按说明书进行操作，具体操作如下：

逆转录反应体系配置如下(总体积20μl)：

逆转录反应条件如下：

逆转录反应产物cDNA保存于-20℃。

2.3.3 Real-time PCR反应

1)采用TaKaRa公司的Real-time PCR试剂盒，检测cDNA中目的基因表达量，10μl体系配置如下：

2)在实时荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR反应，反应条件如下；

3)计算目的基因的相对表达量：

内参基因为GAPDH，待测样品相对值＝2-△△Ct，△Ct＝Ct目的基因–CtGAPDH，△△Ct＝△Ct待测样品-△Ct内参。

2.3.4引物设计

以Genebank的cDNA序列为依据，用Primer 3.0网页进行设计，引物序列如下表：

2.4阿利新蓝-过碘酸-雪夫染色(Alcian Blue Periodic acid Schiff,PAS-AB)

PAS-AB染色为阴性即非黏蛋白。(红色：糖原、中性粘液；蓝色：酸性粘液，蓝紫色：混合性粘液。)

剪取小肠和结肠近盲肠的肠段，卡氏固定液固定过夜，石蜡包埋，切片；

脱蜡、水洗(具体步骤详见第四方面相关内容)

AB染色液(PH2.5阿利新蓝染色液)染色5-10min，水洗至无染料脱落；

PAS染色液A试剂(过碘酸)染色5miin，蒸馏水轻轻漂洗；

PAS染色液B试剂(Schiff氏试剂)染色5-10min，水洗；

脱水、透明、封片。

2.5 LPS检测(终点显色法)

根据BIOENDO公司内毒素检测鲎试剂盒使用说明操作(均需使用无热原耗材)，步骤如下：

样品预处理：

肝素钠抗凝管采血，3000rpm离心5min，取上清即血浆100μl；加入900μl样本处理液，混匀即为10X稀释液

70℃水浴锅加热10min，封口避免水珠流入；

冰水冷浴3min；

测定样本空白管吸光度(溶血样本需扣除样本空白管吸光度)

血浆10X稀释液100μl，加200μl内毒素检查用水，再依次加入500μl偶氮化试剂1、500μl偶氮化试剂2、500μl偶氮化试剂3，混匀后于λ＝545nm测定样本空白管吸光度；

细菌内毒素标准溶液配制(现配现用，4h内用完)

取细菌内毒素标准品1瓶，加入1ml细菌内毒素检查用水，在旋涡混匀器上剧烈振摇15分钟，注意振摇过程不能溅出；

将上述溶液用细菌内毒素检查用水稀释为1.0EU/ml的内毒素溶液。

按照下表分别配置0.01U/ml-0.1EU/ml；0.1U/ml-1U/ml的标准溶液

1)100μl内毒素检查用水(阴性对照)/内毒素标准溶液/待测样本(预处理后的10X稀释液)；

2)加入100μl鲎试剂溶液，混匀；

3)37℃温育；

4)加入100μl显色基质溶液，混匀，37℃温育；

5)依次加入500μl偶氮化试剂1溶液、2溶液、3溶液，混匀；

6)静置5min，测量545nm波长吸光度

数据处理：根据标准液吸光度绘制标准曲线(应为线性关系)，纵坐标为吸光度值，横坐标为内毒素浓度。根据待测样本的吸光度求样本浓度。

细菌定量PCR

基因组DNA提取

使用TIANGEN公司基因组DNA提取试剂盒：

称重后，处理组织：

外周血加入三倍体积红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5min，10000rpm离心1min，吸去上清，沉淀即为白细胞；动脉瘤组织用玻璃匀浆器研磨处理为单细胞悬液，10000rpm离心1min，吸去上清；在沉淀中加入110μl TE缓冲液(20mM Tris，pH8.0；2mM Na2-EDTA；1.2％Triton)和70μl溶菌酶溶液(50mg/ml)，震荡混匀，37℃水浴30min；

加入20μl Proteinase K溶液，混匀(动脉瘤组织混匀后还需再在56℃放置，直至组织溶解，瞬离去除管壁水珠)；

加入200μl缓冲液GB，颠倒混匀，70℃放置10min(溶液变清亮)，瞬离去除管壁水珠；

加入200μl无水乙醇，振荡混匀15s(出现絮状沉淀)，瞬离去除管壁水珠；

将溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB3(吸附柱放入收集管)，12000rpm离心30s，弃废液，再将吸附柱放回收集管；

500μl缓冲液GD，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管；

600μl漂洗液PW，12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放回收集管，重复一次；

不加入任何液体，12000rpm离心1min，弃废液，室温晾干吸附柱；

将吸附柱放入新的离心管，向吸附膜中部悬空滴加20μl DEPC水，12000rpm离心2min，收集离心管中的液体即为总DNA；重复一次，-20℃保存。

2.6绘制标准曲线

将目的基因PCR产物克隆至质粒载体；

将质粒标准品(1ng/μl)按照10倍梯度稀释，并计算质粒拷贝数＝(ng/μl)*10^9*6.02*1023/(660*450bp)＝copies/μl

定量PCR检测Ct值(具体步骤如下)，并绘制标准曲线：log(拷贝数)与Ct值成线性关系；

2.7细菌定量PCR

1)荧光定量PCR体系建立(15μl)

2)在实时荧光定量PCR仪上进行Real-time PCR反应，反应条件如下；

3)将Ct值带入标准曲线方程，求得拷贝数

2.8 ELISA检测IL-1β

使用NEOSCIENCE公司ELISA试剂盒检测小鼠血浆原液IL1β浓度，根据说明书操作如下：

1)将板条平衡至室温，空白孔加梯度稀释后的标准品，其余孔加样本，封板膜封板，37℃孵育90min；

2)提前20min准备生物素化抗体工作液；

3)洗板5次；

4)100μl生物素化抗体：空白孔加稀释液，其余孔加工作液，封板膜封板，37℃孵育90min；

5)提前20min准备酶结合物工作液，室温避光放置；

6)洗板5次；

7)100μl酶结合物：空白孔加稀释液，其余孔加工作液，封板膜封板，37℃孵育90min；

8)洗板5次；

9)每孔加100μl显色底物，避光37℃孵育15min，预热酶标仪；

10)每孔加100μl反应终止液，混匀后测量OD450值；

11)根据标准品OD值绘制标准曲线，将测得样本OD值带入，计算待测样浓度。

2.9流式细胞术：制备小鼠外周血单个核细胞悬液

1)小鼠处死后，取外周血500μl，加入1ml PBS混匀；

2)将上述液体缓慢加入1.5ml淋巴细胞分离液，室温下2350rpm密度梯度离心20min，+9/-0；

3)离心后吸取中间白色细胞层，加PBS至15ml洗涤，500G离心10min，弃上清；

4)细胞沉淀重悬即为外周血单个核细胞；

2.10制备小鼠动脉单细胞悬液(同第四方面所述)

2.11流式细胞染色及流式分析

1)将上述单细胞悬液转移到流式管，留100μl液体；

2)加入细胞膜表面标记抗体，4℃避光孵育30min：外周血单核/中性粒细胞(抗CD45-FITC、抗CD11b-PerCp/cy5.5、抗Ly6C-PEcy7、抗Ly6G-APCcy7、抗CCR2-BV605)；动脉单核细胞(抗CD45-APCcy7、抗CD11b-PerCp/cy5.5、抗Ly6C-FITC)，稀释比例参考说明书；

3)PBS洗去抗体，加入200μl IC固定液固定，室温避光孵育30min；

4)PBS洗去固定液，加入100μl PBS重悬；

5)上机前加入5μl流式计数微球Counting Beads；

6)流式细胞仪分析检测，细胞总数目＝5*1.03*10^3*流式检测细胞数目/流式检测beads数目。

3.统计检验方法：同前述第四方面中相应内容。

结果分析

(一)菊粉保护肠道屏障功能

检测高纤维饮食和普通饮食AAA小鼠的肠道通透性。AAA小鼠在处死前禁食过夜，4kD FITC-右旋糖酐灌胃，灌胃后4小时取血浆检测FITC荧光强度。肠道屏障功能越完善的小鼠，其入血的FITC-右旋糖酐即血浆中FITC强度越低。

结果显示，普通饮食组与纤维素饮食组无明显差异；相比普通饮食和纤维素饮食，富含菊粉的高纤维饮食组AAA小鼠血浆FITC荧光强度明显降低(图9)。这说明菊粉降低了AAA小鼠肠道通透性。

对高纤维饮食和普通饮食AAA小鼠的肠道屏障进行评估。通过检测小肠和结肠肠组织与屏障功能相关的紧密连接蛋白(ZO-1)、闭合蛋白(Occludin)、粘蛋白(Muc2)和钙粘蛋白(CDH1)的基因表达，我们发现菊粉可以促进小肠屏障功能相关蛋白的基因表达，而对结肠无明显作用，并且纤维素对肠道屏障功能无明显改善(图10)。通过PAS-AB染色检测小肠和结肠杯状细胞的数目和粘蛋白含量，结果发现，相比普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食，富含菊粉的高纤维饮食AAA小鼠的小肠杯状细胞(goblet cell,GC)数目增多，且细胞内粘蛋白含量丰富，但结肠杯状细胞数目无明显增多(图11)。最后，我们通过检测肠道组织抗菌肽(Reg3γⅢ)、磷脂酶A2(Pla2g2)、防御素(α-defensins)、溶菌酶C(lysozyme C)的基因表达，对高纤维饮食和普通饮食AAA小鼠的化学屏障功能进行评估。结果显示，富含菊粉的高纤维饮食能够显著增加AAA小鼠抗菌复合物的表达，包括小肠的α-defensins、lysozyme C和结肠的Pla2g2，而富含纤维素的高纤维饮食不具有该作用(图12)。

普通饮食(CD)、富含纤维素的高纤维饮食(HFD-Cell)、富含菊粉的高纤维饮食(HFD-In)AAA小鼠，4kD FITC-右旋糖酐灌胃后取血浆检测FITC荧光强度。每个点代表一只小鼠，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。检验方法为单因素方差分析和Tukey多重比较检验，下同。

结果表明，在AAA小鼠中，富含菊粉的高纤维饮食具有肠道屏障保护功能，而富含纤维素的高纤维饮食不具有该作用。菊粉可以降低肠道通透性，主要促进小肠的肠道屏障完整性，对结肠的肠道屏障无明显改善。

(二)菊粉改善AAA小鼠肠道通透性，降低外周血LPS及系统性炎症水平保护AAA

细菌内毒素LPS作为肠道含量最丰富的革兰氏阴性菌细胞壁组分，常用来指征细菌易位。我们的实验结果表明，相比普通饮食和富含纤维素的高纤维饮食，LPS及其引起的系统性炎症指标IL-1β水平在肠道屏障功能更完善的富含菊粉的高纤维饮食AAA小鼠的血浆中均降低(图13中A、B)。

在肠道通透性与外周血细菌组分LPS的相关性分析中，FITC-dextran与内毒素LPS水平呈正相关(图13中C，R2＝0.7126，P＝0.0011)，表明AAA小鼠血浆LPS水平升高与肠道通透性增加有关。AAA小鼠血浆内毒素LPS水平与AAA直径呈正相关(图13中D，R2＝0.7658，P＝0.0004)，表明LPS水平越高，小鼠AAA瘤体扩张越严重。AAA小鼠肠道通透性与动脉瘤直径呈正相关(图13中E，R2＝0.8962，P<0.0001)，这与高纤维饮食改善AAA的趋势一致，表明富含菊粉的高纤维饮食通过保护肠道屏障功能发挥AAA保护作用。肠道通透性FITC、内毒素LPS与AAA直径三者间具有相关性，提示我们高纤维饮食可能通过改善小鼠肠道屏障功能，减少肠道菌群LPS易位，从而保护AAA。

(三)菊粉减少AAA小鼠外周血及动脉瘤局部的细菌载量

高纤维饮食完善肠道屏障功能，可能通过减少易位细菌总量影响炎症反应和AAA疾病进展。

为了探究AAA小鼠循环以及动脉瘤病灶处是否存在易位细菌，以及富含菊粉的高纤维饮食对易位细菌总量的影响，通过细菌定量PCR的方法测定了外周血及动脉瘤局部的细菌载量，即细菌DNA拷贝数。结果表明AAA小鼠血液和动脉瘤中存在易位细菌，且富含菊粉的高纤维饮食确实可以减少AAA小鼠细菌易位，使之恢复至与普通饮食假手术组相当的生理水平(图14)，这与其在肠道屏障保护和减少LPS易位中的作用一致。

(四)菊粉降低外周血促炎型Ly6C^hi单核细胞及其迁移能力

易位的细菌组分，无论是LPS还是细菌DNA都是固有免疫的强刺激剂，故而我们对AAA小鼠外周血固有免疫细胞(单核细胞、中性粒细胞)进行了检测。通过流式分析，粘连圈出单个细胞—Ly6G-(去除中性粒细胞)—CD11b+单核细胞—CD11b+Ly6Chi单核细胞，最后圈出CCR2，检测CD11b+Ly6Chi单核细胞中CCR2的表达(图15)，普通饮食和高纤维饮食小鼠外周血CD11b+Ly6G+中性粒细胞和CD11b+Ly6Clo巡逻单核细胞比例无明显差异(图16中B、F)，但富含菊粉的高纤维饮食可降低AAA小鼠外周血促炎型CD11b+Ly6Chi单核细胞(图16中A)、CD11b+Ly6Clo单核细胞及Ly6Chi单核细胞中趋化因子CCR2的表达(图16中C、D)。

中性粒细胞主要参与炎症反应的急性期，AAA造模14天后已经降至较低水平，故而菊粉即使可以通过保护肠道屏障功能抑制LPS和细菌DNA等组分易位，也不能明显降低中性粒细胞水平。而单核巨噬细胞系统通过促炎和抑炎的平衡转化参与疾病的慢性阶段，在富含菊粉的高纤维饮食AAA小鼠的动脉瘤局部同样检测到了促炎型Ly6C^hi单核细胞的减少(图16中E)。结合外周血单核细胞的变化，提示菊粉可以降低AAA小鼠外周血Ly6C^hi单核细胞及其向AAA病变组织迁移的能力，抑制促炎型单核细胞向动脉瘤局部浸润，从而发挥疾病保护作用。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。