一种miRNA和人间充质干细胞在制备用于治疗关节炎的药物中的用途
阅读说明：本技术 一种miRNA和人间充质干细胞在制备用于治疗关节炎的药物中的用途 (Application of miRNA and human mesenchymal stem cells in preparation of medicine for treating arthritis ) 是由 朱文敏 孙毅 陈伟 于 2021-08-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种miRNA在制备用于治疗关节炎的药物中的用途,所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。还提供了一种表达上述miRNA的人间充质干细胞。还提供了上述的人间充质干细胞在制备用于治疗关节炎的药物中的用途。本发明已鉴定能够广泛靶向修复骨关节炎相关软骨基质及组织的miR-17-5p,并且在小鼠DMM模型中鉴定了miR-17-5p的骨关节炎治疗能力,并在临床样本中鉴定了骨关节炎严重程度与miR-17-5p表达水平高低的联系,同时还制备了能够自主、持续表达miR-17-5p的人间充质干细胞,建立以细胞为载体的miR-17-5p递送治疗系统,可作为慢性骨关节炎的治疗方法。(The invention provides an application of miRNA in preparing a medicament for treating arthritis, wherein the nucleotide sequence of the miRNA is shown in SEQ ID NO. 1. Also provides a human mesenchymal stem cell expressing the miRNA. Also provides the application of the human mesenchymal stem cells in preparing the medicament for treating arthritis. The invention identifies miR-17-5p capable of repairing cartilage matrix and tissue related to osteoarthritis in a wide-range targeted manner, identifies osteoarthritis treatment capacity of miR-17-5p in a mouse DMM model, identifies the relation between the osteoarthritis severity and miR-17-5p expression level in a clinical sample, simultaneously prepares human mesenchymal stem cells capable of autonomously and continuously expressing miR-17-5p, establishes a miR-17-5p delivery treatment system taking cells as a carrier, and can be used as a treatment method of chronic osteoarthritis.)
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种生物小分子和一种细胞，具体来说是一种有效延缓骨关节炎恶化的microRNA(miRNA)和自主、持续表达该miRNA的人间充质干细胞。
背景技术
骨关节炎又称退行性骨关节病，是一种以关节软骨损害为主，同时累及整个关节组织的慢性疾病，临床表现为关节疼痛与相关功能障碍而导致的慢性残疾。由于受损的关节软骨没有自我修复能力，目前医学上没有任何明显有效的方法可以阻止骨关节炎的进一步恶化，绝大多数疾病晚期患者只能选择人工关节置换，以提高生活质量。
关节软骨的结构完整性是软骨健康的重要标志之一，主要由软骨细胞的细胞外基质决定。由于外界生物力学与生物化学的刺激，局部产生多种基质降解酶，使软骨基质逐渐降解，破坏了软骨结构完整性，进而内部的钙化层不断磨损，最终导致骨关节炎的产生与进行性恶化。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)来源广泛，可以自我更新与多向分化，有较强的炎症调节能力与归巢能力，靶向迁移到组织损伤部位，分泌因子、外泌体等调节微环境；或分化为特定类型的组织细胞进行细胞替代，促进损伤部位修复，在多种临床疾病的治疗中展现出了广阔的应用前景。然而，MSCs因其供体来源、组织来源、分离方法及培养体系的不同，表现出较大的异质性，因此适当的体外预处理诱导培养，可以调节并提高MSCs的特异性疾病治疗能力。其中，脂肪、皮肤与脐血来源的MSCs由于易获取、成瘤率低、性价比高、对患者伤害小且不涉及伦理问题等，成为MSCs培养的理想供体与组织来源。
miRNA是一类内源性、长度约为20-24个核苷酸的小RNA，在体内有多种重要的调节作用。目前发现的miRNA通过多种机制包括调节靶mRNA稳定性、内源性抑制性RNA途径等，可以延缓骨关节炎的部分病理进程，然而在有效修复软骨细胞及其基质方面却皆不尽如人意。研究发现，miR-17～92簇基因功能异常导致的骨骼功能障碍伴随骨单位的缩短和骨关节的融合，提示miR-17～92簇基因可能是潜在的关节疾病靶标。同时，已发现的miRNA都只能对特定的单类基质降解酶产生单向靶向作用，是否存在广泛靶向骨关节炎相关基质降解酶的miRNA，其发现和鉴定有助于研发有效修复骨关节炎病变的分子治疗措施。
目前临床上对骨关节炎的治疗采取梯度治疗措施，采取阶段性物理、药物及关节腔修复手术联合治疗，这些措施仅能轻度延缓骨关节炎的发展；当疾病恶化到晚期，需要进行关节重建手术治疗，包括昂贵且复杂的关节置换术，旨在缓解关节疼痛、恢复关节活动功能。随着关节置换术的发展，术后无进展期10年以上病例占90％以上，然而术后早期假体周围感染和术后远期的假体松动，均需要再次手术修补，极度降低患者生活质量。因此急需一种给药途径简单、创伤小、操作难度低的可逆性治疗药物分子或联合细胞的治疗措施，抑制骨关节炎的进展。
发明内容
针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种有效延缓骨关节炎恶化的microRNA(miRNA)和人间充质干细胞，所述的这种有效延缓骨关节炎恶化的miRNA和人间充质干细胞要解决现有技术对于骨关节炎的治疗效果不佳的技术问题。
本发明提供了一种miRNA(miR-17-5p)在制备用于治疗关节炎的药物中的用途，所述miRNA的核苷酸序列为:caaagugcuuacagugcagguag(如SEQ ID NO.1所示)。
本发明还提供了一种表达miRNA的人间充质干细胞，所述miRNA的核苷酸序列为:caaagugcuuacagugcagguag(如SEQ ID NO.1所示)。
本发明还提供了上述的人间充质干细胞(MSCs)在制备用于治疗关节炎的药物中的用途。
本发明还提供了上述的一种miRNA在制备作为诊断骨关节炎的生物标记物的用途，所述miRNA的核苷酸序列为:caaagugcuuacagugcagguag(如SEQ ID NO.1所示)。
具体的，所述的人间充质干细胞来自人脂肪、皮肤或脐带。
本发明还提供了一种药物递送系统，以间充质干细胞为载体，所述的载体中自主、持续表达miRNA，所述miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明提供了一种有效缓解骨关节炎进展的miRNA，并通过内侧半月板损伤的骨关节炎(DMM)小鼠模型说明其水平与骨关节炎之间的联系以及作用、治疗机制；并已鉴定骨关节炎患者软骨组织病变程度与所提供的miRNA表达水平之间的联系。
本发明所提供的有效缓解骨关节炎进展的miRNA与能有效表达、分泌该miRNA的人间充质干细胞还可用于以下目的，比如：可用于不同阶段的人骨关节炎治疗。
本发明的miR-17-5p延缓骨关节炎恶化，修复骨关节软骨外基质的原理包括：广泛靶向抑制四种可破坏关节软骨外基质的基质降解酶，分别为基质金属肽酶MMP3和MMP13、软骨蛋白聚糖ADAMTS5、一氧化氮合酶NOS2，通过四种基质降解酶的3'UTR的识别位点进行靶向抑制(如附图1所示)；以及维持软骨细胞的细胞外基质中合成代谢与分解代谢的平衡，及维持关节软骨的结构完整性。
本发明的能够自主、持续表达miR-17-5p的MSCs递送系统，实现原理包括：MSCs静脉或原位输注能够起一定的疾病缓解作用；Agomir是一种根据成熟miRNA反义链，经过3'端胆固醇修饰、5'端两个硫代骨架修饰、3'端四个全链甲氧基修饰的双链小RNA，与细胞膜亲和力更高，转染进入细胞后表达时间长达一周，并且具备生物安全性，本发明所述Agomir-17购买于广州锐博生物(RiboBio)科技有限公司，用于在细胞内或体内模拟miR-17-5p，同时购买的Agomir-NC作为对照。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的。本发明已鉴定能够广泛靶向修复骨关节相关软骨基质及组织的miR-17-5p，并且在小鼠DMM模型中鉴定了miR-17-5p的骨关节炎治疗能力，并在临床样本中鉴定了骨关节炎严重程度与miR-17-5p表达水平高低的联系，同时还制备了能够自主、持续表达miR-17-5p的人MSCs，建立以细胞为载体的miR-17-5p递送治疗系统，可作为慢性骨关节炎的治疗方法，具有重要的临床意义。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1显示miR-17-5p通过3'UTR区靶向抑制四种基质降解酶。
图2显示小鼠DMM模型构建成功，miR-17-5p表达水平与软骨退化及骨关节炎的恶化程度密切相关。
图3显示DMM手术或敲除miR-17～92簇基因均可导致骨关节炎评分上升，而注射Agomir-17后评分下降，表明miR-17-5p可抑制骨关节炎病理进程。
图4显示正常人关节软骨中miR-17-5p的表达水平远高于骨关节炎患者，约为早期的2倍，中晚期的4倍，提示人软骨与小鼠软骨中miR-17-5p的表达模式和机制存在相似性。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
实施例1
1、实验对象
C57BL/6小鼠从上海维通利华实验动物技术有限公司购买，miR-17～92fl/fl小鼠和Col2CreERT小鼠从Jackson实验室购买，饲养于同济大学实验动物中心SPF级环境。实验中涉及对于动物的操作、手术及安乐死的人员，均已经过同济大学实验动物中心的内部操作培训。
2、实验方法
以下细胞实验操作均在符合临床标准的GMP实验室中完成；动物实验均在SPF环境中完成。
2.1 miR-17-5p能够广泛靶向关节软骨相关的基质降解酶
2.1.1 miRanda数据库(http://www.microrna.org/)提供了关于人类、果蝇和斑马鱼基因组的miRNA靶基因的预测信息以及miRNA在不同组织的表达谱，TargetScan(http://www.targetscan.org/)是通过搜索和每条miRNA区域匹配的mRNA位点来预测靶基因；通过miRanda和TargetScan，预测了mRNA 3'UTR包含miR-17-5p识别位点的关节软骨相关的基质降解酶，包括基质金属肽酶MMP3和MMP13、软骨蛋白聚糖ADAMTS5、一氧化氮合酶NOS2，结合位点如附图1A所示，并根据结合位点进行特异性位点突变(mutant)；wt 3'UTR序列及mutant 3'UTR由生工生物工程有限公司合成并载入荧光报告基因载体psiCHECK-2，载体购买于Promega公司，可监测与报告基因(海肾萤光素酶)融合的目的基因表达的变化；
本发明提供的caaagugcuuacagugcagguag(如SEQ ID NO.1所示)可以从miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库查询获取。
2.1.2荧光素酶报告基因实验通过HEK293T细胞(购买于ATCC，CRL-11268)完成，将HEK293T细胞接种在96孔板中培养，转染试剂Lipofectamine 2000购买于Invitrogen公司，根据说明书进行转染操作，每孔转染10pmol的miR-17-5p和10ng的3'UTR-psiCHECK-2，转染48小时后收集细胞，根据双荧光素酶报告分析试剂盒(购买于Promega公司)操作说明检测荧光酶活性。如附图1B所示，miR-17-5p能够显著降低wt 3'UTR的荧光酶活性，而不能降低mutant 3'UTR的荧光酶活性，在基质金属肽酶MMP3和MMP13、软骨蛋白聚糖ADAMTS5、一氧化氮合酶NOS2中均观察到类似的水平变化。因此，miR-17-5p具备广泛基质降解酶靶向性，同时靶向调节基质金属肽酶MMP3和MMP13、软骨蛋白聚糖ADAMTS5、一氧化氮合酶NOS2。
2.2在构建的小鼠DMM模型中，miR-17-5p表达水平与骨关节炎发展程度相关
2.2.1用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉10周龄小鼠，进行横切左膝关节内侧半月膜韧带的手术，破坏左膝关节软骨，诱导半月板不稳定相关的骨关节炎。对照组的小鼠仅进行假手术处理，未横切左膝关节内侧半月膜韧带；
2.2.2分别在手术后第0、4、8、12周对两组小鼠进行安乐死，获取左膝关节并进行番红O-固绿、苏木精伊红(HE)染色，并通过荧光原位杂交(FISH)检测microRNA-17的表达；
具体步骤如下：
2.2.2.1组织固定及石蜡包埋
收集小鼠左膝关节后，经质量体积比浓度(g/ml)4％多聚甲醛后固定48小时，随后经质量体积比浓度(g/ml)10％的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙10天，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内；
将脱水盒放进脱水机中，依次进行梯度酒精(体积百分比浓度)脱水，50％酒精90分钟，70％酒精90分钟，85％酒精90分钟，90％酒精90分钟，无水乙醇I 60分钟，无水乙醇II60分钟；
透明：醇苯5-10分钟，二甲苯I 5-10分钟，二甲苯II 5-10分钟；
石蜡渗透：苯蜡90分钟，石蜡I 60分钟，石蜡II 60分钟，石蜡III 60分钟；
包埋：将渗透好石蜡的左膝关节组织于包埋机内进行包埋，待石蜡凝固后将蜡块从包埋盒中取出并修整蜡块；
切片：于石蜡切片机上切片，对软骨组织矢状面或冠状面切片，厚度6μm，烤干后室温保存备用；
2.2.2.2番红O-固绿染色
嗜碱性的软骨组织和碱性染料番红O结合呈红色，嗜酸性的骨和酸性染料固绿结合形成绿色或者蓝色，当软骨受到损伤后，软骨中的糖蛋白会释放出来，使基质成分分布不均匀，从而导致番红O染色浅淡或不着色。
石蜡切片常规脱蜡至蒸馏水，根据常规新鲜配置Weigert染液，染色3-5分钟；
经盐酸-乙醇溶液进行分化15秒，随后用蒸馏水轻洗1分钟；
经固绿染料染色5分钟，随后用蒸馏水轻洗1分钟；
经番红O(Safranin O)染料浸染2分钟，随后用蒸馏水轻洗1分钟；
经乙酸溶液轻洗切片1分钟，进一步去除残留的染料，随后用蒸馏水轻洗1分钟；
依次经体积百分比浓度95％乙醇和无水乙醇进行脱水，随后经二甲苯透明，利用光学树脂封片以备后续观察评估；
2.2.2.3 HE染色
石蜡切片常规脱蜡至蒸馏水，根据常规配置苏木精和伊红乙醇染料；
经苏木精染色10-30分钟，随后用自来水水流轻轻冲洗，使颜色变蓝；
经盐酸-乙醇溶液进行分化15秒左右，直至切片变为浅红，随后用自来水水流轻轻冲洗，使颜色恢复蓝色；
脱水I：依次经体积百分比浓度50％乙醇、体积百分比浓度70％乙醇、体积百分比浓度80％乙醇各3-5分钟进行脱水；
经质量体积比浓度(g/ml)0.5％伊红乙醇染料复染1-3分钟；
脱水II：依次经体积百分比浓度95％乙醇、无水乙醇各3-5分钟进行脱水，晾干后经二甲苯透明化两次，利用光学树脂封片以备后续观察评估；
2.2.2.4 miR-17-5p-FISH检测
miR-17-5p的FISH是根据国际标准方案进行的。地高辛(DIG)标记的miR-17-5p寡核苷酸探针购买于Qiagen公司，用于标记组织切片中的miR-17-5p分子；DAPI染色用于观察细胞核。
简言之，收集小鼠左膝关节后，经质量体积比浓度(g/ml)4％多聚甲醛固定，质量体积比浓度(g/ml)10％EDTA溶液脱钙并浸入蔗糖溶液中进行梯度脱水，在最佳切割温度化合物(OCT)中包埋冷冻，以10μm的厚度切片；切片在37℃下用蛋白酶K渗透5分钟，并用体积百分比浓度3％过氧化氢水处理以阻断内源性过氧化物酶活性；随后将贴有软骨组织冰冻切片的载玻片与相关探针(1nM)孵育过夜；最后经抗地高辛-过氧化物酶(抗DIG-POD)和Cy3-酪酰胺(溶于体积百分比浓度0.001％过氧化氢水)显色，DAPI染色用于细胞核显色，进一步观察统计结果；
2.2.3引入国际骨关节炎研究协会的OARSI评分，由两名观察员进行评分，以评估软骨破坏的程度，评分越高则证明破坏程度越严重；
2.2.4如附图2A所示，经番红O-固绿染色，DMM小鼠模型随着时间增长，骨关节表面深染的软骨组织分布紊乱，甚至断层，表明该模型中，骨关节中软骨组织完整性进行性破坏；如附图2A所示，经HE染色，同样观察到关节腔面的组织完整性和连续性丧失，表明DMM术后，小鼠关节软骨退化程度进行性加重；通过FISH检测，结果显示随着小鼠关节软骨退化程度进行性加重，miR-17-5p表达量显著减少；如附图2B所示，手术后第4周，手术组小鼠的OARSI评分约为对照组的2倍，在第8周与第12周趋于稳定，约为对照组的5倍；手术后第4周，手术组小鼠关节面miR-17-5p阳性细胞数量约为对照组的二分之一，在第8周与第12周趋于稳定，约为对照组的四分之一。以上图例与实验结果证明，小鼠DMM模型构建成功，miR-17-5p表达水平与软骨退化及骨关节炎的恶化程度密切相关。
2.3 miR-17-5p可抑制骨关节炎病理进程
2.3.1 miR-17-5p类似物可以有效修复小鼠DMM模型中的骨关节软组织损伤和功能障碍
2.3.1.1用氯胺酮和甲苯噻嗪麻醉10周龄小鼠，进行横切左膝关节内侧半月膜韧带的手术，破坏左膝关节软骨，诱导半月板不稳定相关的骨关节炎。对照组的小鼠仅进行假手术处理，未横切左膝关节内侧半月膜韧带；
2.3.1.2将1.5nmol的Agomir-17溶于8μl磷酸盐缓冲液中，自DMM手术后4周开始，每周对小鼠关节腔注射1次Agomir-17稀释液，共注射4次；对照组小鼠注射Agomir-NC；
2.3.1.3于DMM手术后第8周，安乐死后收集三组小鼠(假手术组、手术且注射Agomir-NC组、手术且注射Agomir-17组)的左膝关节，经质量体积比浓度(g/ml)4％多聚甲醛后固定48小时，随后经质量体积比浓度(g/ml)10％的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙10天，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内，脱水后经石蜡包埋，进一步切片脱蜡至蒸馏水中，通过番红O-固绿染色检验关节腔软骨组织的结构完整性，具体操作同于实施例1中2.2.2.1-2；
2.3.1.4如附图3A所示，小鼠DMM模型中，经4周的miR-17-5p类似物Agomir-17的关节腔注射治疗，关节软骨层结构完整，而Agomir-NC治疗组中软骨组织分布不均匀、不连续，完整性已破坏；相应的，Agomir-17治疗组的OARSI评分显著低于Agomir-NC治疗组，趋向于假手术组；
2.3.2敲除miR17～92簇基因导致关节腔出现类似于骨关节炎的病理变化，miR-17-5p类似物可以有效逆反相应的病理变化
2.3.2.1 miR-17～92fl/fl小鼠和Col2CreERT小鼠杂交得到Col2CreERT；miR-17～92fl/+小鼠，进而Col2CreERT；miR-17～92fl/+小鼠与miR-17～92fl/fl小鼠杂交，得到Col2CreERT；miR-17～92fl/fl小鼠(miR-17～92cKO小鼠)，miR-17～92cKO小鼠体内的软骨细胞和其他通常表达内源性II型胶原基因的细胞中的miR-17～92簇基因可以被诱导性敲除；
2.3.2.2雌激素受体ER的激活剂tamoxifen购买于Sigma公司，7周龄的miR-17～92cKO小鼠经腹腔注射接受100μg/g剂量的tamoxifen，每天一次，一共6天，诱导性敲除miR-17-5p；
2.3.2.3将1.5nmol的Agomir-17溶于8μl磷酸盐缓冲液中，自诱导敲除后4周开始，每周对小鼠关节腔注射1次Agomir-17稀释液，共注射4次；对照组小鼠注射Agomir-NC，空白对照组为miR-17～92fl/fl小鼠；
2.3.2.4于诱导敲除后第8周，安乐死后收集三组小鼠(空白对照组、诱导且注射Agomir-NC组、诱导且注射Agomir-17组)的左膝关节，经质量体积比浓度(g/ml)4％多聚甲醛后固定48小时，随后经质量体积比浓度(g/ml)10％的乙二胺四乙酸(EDTA)溶液脱钙10天，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内，脱水后经石蜡包埋，进一步切片脱蜡至蒸馏水中，通过番红O-固绿染色检验关节腔软骨组织的结构完整性，具体操作同于实施例1中2.2.2.1-2；
2.3.2.5如附图3B所示，敲除miR-17-5p后，经4周的miR-17-5p类似物Agomir-17的关节腔注射治疗，关节软骨层结构完整，而Agomir-NC治疗组中软骨组织分布不均匀、不连续，完整性已破坏；相应的，Agomir-17治疗组的OARSI评分显著低于Agomir-NC治疗组，趋向于空白对照组；
综上，miR-17-5p的表达水平高低与小鼠DMM模型中骨关节的病理恶化程度呈高度相关，miR-17-5p能够广泛靶向4种骨关节软骨基质相关的基质降解酶，包括基质金属肽酶MMP3和MMP13、软骨蛋白聚糖ADAMTS5、一氧化氮合酶NOS2，维持关节软骨组织的结构完整性和功能。
实施例2
1、试验对象
无关节炎的正常人膝关节或髋关节软骨组织于术中取自6例骨肉瘤或创伤患者(1男5女，中位年龄为53岁)，骨关节炎软骨标本于关节重建术后2小时内取自18例骨关节炎患者(4男14女，中位年龄为66岁)，按照美国风湿病学会的骨关节炎诊断标准对患者进行分级诊断。收集废弃人体组织已由徐州医科大学附属医院研究伦理委员会批准，所有参与本研究的患者均可提供书面知情同意书。
2、实验方法
2.1人软骨组织total RNA提取和特异性反转录
收集的人软骨组织经TissueLyser-48L(购买于上海京新生物医药有限公司)裂解成匀浆，根据RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit(购买于Qiagen公司)操作说明书进行total RNA提取，随后0.5μg的total RNA用于反转录合成cDNA文库，按照Takara公司的反转录试剂盒操作说明结合设计的miR-17-5p特异性茎环引物配置反应体系，大体如下：
组分
添加体积
5×PrimeScript buffer
4μl
PrimeScript RT Enzyme Mix I
1μl
茎环引物
1μl
Total RNA
0.5μg
RNase Free dH<sub>2</sub>O
Up to 20μl
其中茎环引物序列如下(利用软件Primer Premier 5.0设计)：
5'-gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctacct-3'；(如SEQ IDNO.2所示)
充分混匀后，短暂离心，置于PCR仪上，运行程序，反转录程序如下：
37℃，15分钟；85℃，5秒；4℃，∞；
反转录的cDNA产物立即用于Quantitative RT-PCR(qRT-PCR)检测或储存于-20℃；
2.2人软骨组织qRT-PCR检测miR-17-5p相对表达水平
根据TaKaRa公司SYBR Green mix qRT-PCR试剂盒配置总体积为20μl的反应体系，所有引物稀释到10μM，实施例2中2.1合成的cDNA文库按照1:10的比例稀释使用，体系如下：
组分
添加体积
cDNA
1μl
2×SYBR Green qPCR Super Mix
10μl
上游引物(10μM)
0.5μl
上游引物(10μM)
0.5μl
ROX
0.4μl
RNase Free dH<sub>2</sub>O
7.6μl
其中上下游引物序列分别为(利用软件Primer Premier 5.0设计)：
上游引物：5'-cgcaaagtgcttacagtgc-3'；(如SEQ ID NO.3所示)
下游引物：5'-agtgcagggtccgaggtatt-3'。(如SEQ ID NO.4所示)
加样后2000rpm离心1分钟，于ABI 7500 Fast System(Applied Biosystems)仪器中运行程序：
95℃10分钟，(95℃15秒，56℃30秒，72℃30秒)×40个循环，加入溶解曲线分析引物特异性；
2.3数据分析
qRT-PCR仪器扩增结束后，观察溶解曲线并拷贝CT值，根据荧光定量PCR相对定量公式2-△△Ct进行样本表达倍数的计算，结果采用SPSS软件进行Student’s t-test分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。
2.4如附图4所示，正常人关节软骨中miR-17-5p的表达水平远高于骨关节炎患者，约为早期的2倍，中晚期的4倍，提示人软骨与小鼠软骨中miR-17-5p的表达模式存在相似性。这些发现表明，miR-17-5p可以用于临床上骨关节炎的治疗。
实施例3
以下细胞实验操作均在符合临床标准的GMP实验室中完成。
1、关节腔中单独的miR-17-5p小分子注射或miR-17-5p类似物Agomir-17注射，其安全性较难掌控，且副作用较难评估；MSCs治疗已在多种类型疾病中进行了临床试验，安全性、可靠性及有效性已有一定的评估；通过对MSCs预处理Agomir-17，使其获得miR-17-5p自主、持续表达能力，建立以MSCs为载体，进行miR-17-5p联合细胞治疗，是更为安全有效的临床治疗骨关节炎的潜在策略。
2、MSCs的制备及自主、持续表达miR-17的MSCs制备
2.1 MSCs的制备及质检
2.1.1人脐带组织样本放入含抗生素的生理盐水缓冲液中，冰上运输至GMP细胞间，用含抗生素的生理盐水缓冲液洗涤，转移至干净的培养皿中，剥离去除血管组织，取华氏胶部分，洗涤后，剪成约1mm3的组织块，加入质量体积比浓度(g/ml)为0.2％的胶原酶后转移至15ml离心管中，放于37℃水浴锅中消化1小时，类似的，人脂肪、皮肤等组织来源同样适用；
2.1.2配制含体积百分比浓度为5％的KSR(人血清替代物)、体积百分比浓度为0.032％肝素钠的α-MEM完全培养基，终止消化，随后用70μm的细胞筛过滤掉未消化的组织块，并用离心机设定参数1200rpm离心5分钟；
2.1.3用完全培养基清洗2次，计数后按照5×106/ml的细胞密度铺板，置于37℃、5％CO2的湿润培养箱中培养；细胞成长至汇合度约为80％时弃去未贴壁细胞，消化后按1:3传代；
2.1.4进行支原体污染检测，确定培养的细胞未被支原体污染；
2.1.5通过肉眼观察，培养的细胞可以贴壁生长；通过三系分化检测，培养的细胞具有向脂肪细胞、成软骨细胞、成骨细胞分化的能力；通过细胞的流式鉴定，培养的细胞表面表达阳性细胞表面标志物CD44、CD73、CD90和CD105，不表达阴性细胞表面标志物CD45、CD19、CD11b、CD34和HLA-DR。以上三点证明，所培养的细胞为MSCs；
2.2制备含有miR-17-5p表达组件的MSCs
2.2.1从广州锐博生物(RiboBio)科技有限公司购买合成Agomir-17；
2.2.2将实施例3中步骤2.1制备培养得到的MSCs培养至70％的密度，转染前1个小时更换KSR减半的培养基；
2.2.3将HD(购买于Promega公司)试剂及Agomir-17溶液平衡至室温；
2.2.4 1.5nmol的Agomir-17溶于50μl无RNA酶的超纯水中，储存浓度为30μM，转染时取1μl稀释于49μl Opti-MEM培养基中，终浓度为600nM；取HD 0.1μl/cm2，与Agomir-17稀释液混匀，室温孵育5-15min，加到细胞培养体系中；
2.2.5转染后继续培养6-16h，用完全培养基进行换液，即为制备成功的含有miR-17-5p表达组件的MSCs。
序列表
<110> 朱文敏
<120> 一种miRNA和人间充质干细胞在制备用于治疗关节炎的药物中的用途
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caaagugcuu acagugcagg uag 23
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacctacct 50
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcaaagtgc ttacagtgc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtgcagggt ccgaggtatt 20