负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备阿尔茨海默症早期干预药物中的应用
阅读说明：本技术 负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备阿尔茨海默症早期干预药物中的应用 (Application of oxytocin-loaded chitosan nanogel in preparation of early intervention drug for Alzheimer's disease ) 是由 窦妍 叶才华 汪俊萍 于春水 于 2021-09-15 设计创作，主要内容包括：本发明涉及负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备阿尔茨海默症早期干预药物中的应用。本发明研究发现负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在早期治疗阿尔兹海症方面具有显著的功效。细胞水平实验结果表明,负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以抑制脂多糖所致的小胶质细胞激活,并减少小胶质细胞中炎症因子的表达。动物水平实验结果表明,负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以显著降低阿尔茨海默症早期模型小鼠海马炎症因子的表达水平,显著减少β-淀粉样蛋白沉积及神经元损伤,显著提高阿尔茨海默症早期模型小鼠的学习和记忆能力。且负载催产素的壳聚糖纳米凝胶制备过程简单,反应条件温和,易表面修饰。(The invention relates to application of chitosan nanogel loaded with oxytocin in preparation of an early intervention drug for Alzheimer's disease. The research of the invention finds that the chitosan nano gel loaded with oxytocin has obvious effect on treating Alzheimer's disease in the early stage. Cell level experiment results show that the chitosan nanogel loaded with oxytocin can inhibit the activation of microglia caused by lipopolysaccharide and reduce the expression of inflammatory factors in the microglia. Animal level experiment results show that the oxytocin-loaded chitosan nanogel can obviously reduce the expression level of hippocampal inflammatory factors of early-stage model mice of Alzheimer's disease, obviously reduce beta-amyloid deposition and neuron damage and obviously improve the learning and memory abilities of the early-stage model mice of Alzheimer's disease. And the chitosan nanogel loaded with oxytocin has simple preparation process, mild reaction condition and easy surface modification.)
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的新应用，具体涉及一种负载催产素的壳聚糖纳米凝胶通过抗炎效应对阿尔茨海默症进行早期干预的应用。
背景技术
阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病，其特征是进行性记忆丧失和认知能力下降。β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积和tau蛋白过度磷酸化被认为是AD的主要病理特征，但针对这两者的临床早期干预基本都以失败告终。小胶质细胞介导的慢性炎症发生在AD早期，先于以上两种致病性蛋白的积累。由于先天免疫反应不断被触发以恢复组织稳态，导致小胶质细胞过度激活，持续释放大量炎症介质，引起级联反应和恶性循环，最终导致神经元变性。因此，抑制早期神经炎症有望延缓或阻断AD的早期进展。
催产素已被证明可以减轻脂多糖导致的巨噬细胞和小胶质细胞的炎症，对小鼠急性肺损伤等具有保护作用。近年来研究表明，催产素可促进海马的可塑性，逆转Aβ诱导的小鼠海马长时程增强(LTP)损伤。大脑中小胶质细胞的催产素受体表达会随AD进展而上调，为催产素发挥抗炎作用提供大量的结合位点。由于中枢神经系统中催产素含量极低，因此外源性催产素可作为一种很有前途的抗炎药物用于AD的早期干预。然而，外源性催产素的半衰期较短，导致脑内有效作用浓度低，极大限制了其在中枢神经系统中的应用。
壳聚糖纳米凝胶作为一种有效的纳米药物载体，具有制备过程简单、生物相容性好等优点，多年来被广泛应用于生物医学领域。例如CN104817660A公开了一种改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶的制备方法，该方法通过自由基聚合以N,N-双(丙烯酰)胱胺为交联剂制备了改性羧甲基壳聚糖纳米凝胶，所述纳米凝胶成功负载抗癌药物盐酸阿霉素，具有较好的pH和还原敏感性。例如CN107496984A公开了一种负载纳米硅酸二钙/纳米银的壳聚糖凝胶的制备方法和应用，通过在京尼平交联剂作用下混合纳米硅酸二钙/纳米银混悬液和壳聚糖/醋酸溶液，得到所述负载纳米硅酸二钙/纳米银的壳聚糖凝胶；其具有促成骨和抗菌性能，可引导植骨周围的骨组织再生，能够有效防止骨吸收及植骨周围感染。
然而，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶应用于阿尔茨海默症早期干预的研究尚无相关报道。
发明内容
本发明目的是解决因外源性催产素的半衰期较短，导致脑内有效作用浓度低，而限制其应用于阿尔茨海默症早期干预的问题，提供一种负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备阿尔茨海默症早期干预药物中的应用，即通过抗炎效应对阿尔茨海默症进行早期干预。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备阿尔兹海默症早期干预药物中的应用。
本发明所涉及的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶通过抗炎效应对阿尔茨海默症进行早期干预。本发明的细胞水平实验结果表明，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以抑制脂多糖所致的小胶质细胞激活，并减少小胶质细胞中炎症因子的表达。动物水平实验结果表明，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以显著降低AD早期模型小鼠海马炎症因子的表达水平，显著减少Aβ沉积及神经元损伤，显著提高AD早期模型小鼠的学习和记忆能力。
本发明所涉及的通过壳聚糖纳米凝胶负载催产素的方法本领域技术人员可以根据现有技术中已公开的常规方法制备得到，本发明不对负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的制备方法做具体限定。示例性地，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以通过一步法制备得到，其具体制备步骤包括如下：
(1)将壳聚糖溶于去离子水中，调节PH至4.8～5.2；随后在磁力搅拌下加入催产素，壳聚糖与催产素质量比为2：1，常温搅拌(850转/分)3～5分钟；
(2)加入三聚磷酸钠溶液，壳聚糖与三聚磷酸钠的质量比为4.2：1，常温磁力搅拌3～5分钟，离心洗涤，得到无功能化修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。
本发明所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶为经过功能化修饰或未经功能化修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶中催产素通过氨基与壳聚糖的羟基形成氢键实现负载。所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的粒径为75-200nm。
本发明所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶制备过程简单、反应条件温和且易于表面修饰，本领域技术人员可以根据实际应用的需要在其表面进行功能化修饰。
优选地，所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶为跨越血脑屏障功能分子的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。所述跨越血脑屏障功能分子包括Angiopep-2、TAT肽、转铁蛋白、乳铁蛋白或RVG29中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述的壳聚糖包括羧基化壳聚糖、聚乙二醇化壳聚糖、聚乙烯醇化壳聚糖、聚亚乙基氧化壳聚糖中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述催产素包括催产素及醋酸催产素中的任意一种或两种的组合。
优选地，所述负载催产素的壳聚糖纳米凝胶为药物组合物中含有的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。
本发明所涉及的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶也可以与其他具有抗炎效应的生物活性成分按照不同比例进行搭配形成药物组合物，共同作用发挥功效。
优选地，所述药物的剂型包括注射剂、喷雾剂、滴鼻剂、滴丸剂、溶液剂、混悬剂、颗粒剂或胶囊剂。
优选地，所述药物地给药途径包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射、口服给药、舌下给药或鼻腔给药。
本发明所涉及的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶也可以应用于制备治疗涉及到炎症发病机制的其他神经系统退行性疾病的药物中，不仅限于阿尔兹海默症，还包括抑郁症、多发性硬化症、帕金森氏病及亨廷顿氏病。
上述神经系统退行性疾病的发生发展都与炎症反应有关，即在疾病的早期阶段，先天免疫反应不断被触发去恢复组织稳态，从而导致小胶质细胞的过度激活；小胶质细胞过度激活而释放大量的炎症介质；由此产生的持续炎症反应会引起病理级联反应及恶性循环，而导致神经元的损伤及丢失，最终导致上述疾病的发生。
本发明还提供了负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备炎症反应标志物表达抑制剂中的应用，所述炎症反应标志物包括小胶质细胞激活标志物Iba-1、炎症因子TNF-α和炎症因子IL-1β。
本发明还提供了负载催产素的壳聚糖纳米凝胶在制备Aβ沉积标志物淀粉样蛋白MOAB-2、细胞凋亡TUNEL表达抑制剂中的应用。
本发明提供了一种早期干预阿尔茨海默症的药物，所述早期干预阿尔茨海默症的药物包括负载催产素的壳聚糖纳米凝胶，也可以用于制备涉及到炎症发病机制的其他神经系统退行性疾病的药物。
本发明的优点和有益效果：
本发明涉及负载催产素的壳聚糖纳米凝胶通过抗炎效应在早期干预阿尔茨海默症方面具有显著的功效。本发明的细胞水平实验结果表明，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以抑制脂多糖所致的小胶质细胞激活，并减少小胶质细胞中炎症因子的表达。动物水平实验结果表明，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶可以显著降低AD早期模型小鼠海马炎症因子的表达水平，显著减少Aβ沉积及神经元损伤，显著提高AD早期模型小鼠的学习和记忆能力。且负载催产素的壳聚糖纳米凝胶制备过程简单，反应条件温和、易表面修饰。
附图说明
图1是负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的透射电镜图；
图2是负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的粒径表征图；
图3是负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的电位表征图；
图4是细胞免疫荧光检测小胶质细胞激活的结果图；
图5是采用蛋白质印迹法检测细胞炎症因子表达水平的结果图；
图6是采用蛋白质印迹法检测动物炎症因子及Aβ沉积水平的结果图；
图7是采用TUNEL试剂盒检测脑切片中神经元凋亡水平的结果图；
图8是水迷宫试验结果图。
具体实施方式
下面通过附图及具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应该视为对本发明的具体限制。
下述实施例中涉及的试剂或原料若无特别说明，均可通过市售途径购买得到或根据本领域技术人员公知常识制备得到。
小鼠小胶质细胞株BV-2细胞由天津医科大学总医院赠予或购自于ATCC细胞库，APP/PS1转基因小鼠和C57BL/6小鼠均购自于北京华阜康生物科技股份有限公司。
实施例1
本实施例制备一种无功能化修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。其制备方法包括如下步骤：
(1)10mg聚乙二醇修饰的羧甲基壳聚糖溶于10mL超纯水中，并调节PH至5.0。
(2)在磁力搅拌下(850转/分钟)加入5mg催产素，随后加入3.96mL浓度为0.6mg/mL的TPP溶液，搅拌3分钟。
(3)将上述溶液在9000转/分钟下离心20分钟，得到无功能化修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶，并在4℃中避光保存备用。
将制备的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶进行粒径和电位表征，结果为：动态光散射粒径为91nm，表面电位在0mV左右。
实施例2
本实施例制备一种跨越血脑屏障功能分子修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶。其制备方法包括如下步骤：
(1)10mg聚乙二醇修饰的羧甲基壳聚糖溶于10mL超纯水中，之后加入400μL浓度为10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及200μL浓度为10mg/mL的N-羟基丁二酰亚胺在超纯水中磁力搅拌1小时。
(2)将3.5mg的angiopep-2加入上述溶液，在黑暗条件下磁力搅拌6小时，之后在黑暗条件下于超纯水中透析24小时，获得angiopep-2修饰的壳聚糖溶液。
(3)将angiopep-2修饰的壳聚糖溶液的PH调节至5.0，取10mL上述溶液，向其中加入5mg催产素，随后加入3.96mL浓度为0.6mg/mL的三聚磷酸钠溶液，搅拌3分钟。
(4)将上述溶液在9000转/分钟下离心20分钟，得到跨越血脑屏障功能分子修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶，并在4℃中避光保存备用。
将制备得到的跨越血脑屏障功能分子修饰的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶进行如下表征试验：
(Ⅰ)透射电镜表征，结果如图1所示：该纳米凝胶呈球状，粒径均匀，分散性好。
(Ⅱ)粒径及电位表征，结果如图2和图3所示：该纳米凝胶的粒径为120nm左右，电位为8.6mV左右。
实施例3
本实施例评价实施例2制得的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶对早期干预阿尔茨海默症的功效。
(一)细胞水平试验：
以小胶质细胞株BV-2细胞作为实验对象，通过脂多糖刺激构建具有炎症反应的阿尔兹海默症细胞模型，方法如下：将BV-2细胞以每孔2.5×105个细胞的密度接种在24孔板中，在37℃培养24h，待细胞增长至80％左右，加入1mL含有50μg/mL脂多糖的培养基，持续孵育24小时。
以小胶质细胞株BV-2细胞作为实验对象，通过负载催产素的壳聚糖纳米凝胶预处理构建阿尔兹海默症早期细胞模型，方法如下：将BV-2细胞以每孔2.5×105个细胞的密度接种在24孔板中，在37℃培养24h，待细胞增长至80％左右，先加入1mL含有100μg/mL负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的培养基孵育24h，然后加入30μL，50μg/mL的脂多糖，持续孵育24小时。以不做任何处理的细胞、单独孵育负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的细胞作为对照组。
通过细胞免疫荧光检测小胶质细胞激活程度：将细胞在4％多聚甲醛中固定15分钟，用5％BSA阻断30分钟，然后用抗Iba-1一抗(稀释度1：300)孵育并在4℃下过夜。随后，用PBS清洗细胞，再用含红色荧光标签的二抗孵育1小时。最后，用DAPI(10μg/mL)孵育5分钟，用PBS清洗细胞，使用倒置荧光显微镜观察并拍摄荧光图像，研究该负载催产素的壳聚糖纳米凝胶对小胶质细胞激活的抑制作用。结果如图4所示：对于空白对照组和单纯负载催产素的壳聚糖纳米凝胶组，两组细胞的红色荧光比较微弱；脂多糖刺激组细胞表现出较强的红色荧光，而通过先负载催产素的壳聚糖纳米凝胶处理再脂多糖刺激，细胞中的红色荧光几乎无法检测到，表明负载催产素的壳聚糖纳米凝胶能够显著抑制脂多糖诱导的小胶质细胞激活。
随后收集细胞，提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测小胶质细胞中炎症因子的表达水平，研究该负载催产素的壳聚糖纳米凝胶对炎症因子表达的影响，结果如图5所示：与空白对照组相比，单纯负载催产素的壳聚糖纳米凝胶组不会造成TNF-α和IL-1β水平的变化，脂多糖刺激会显著增加TNF-α和IL-1β的表达水平；而通过先负载催产素的壳聚糖纳米凝胶处理再脂多糖刺激催产素凝胶预处理，细胞中TNF-α和IL-1β的水平明显降低，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶对脂多糖诱导小胶质细胞中炎症因子表达有显著的抑制作用。
(二)动物水平试验：
以12周龄(雌性)APP/PS1转基因小鼠作为阿尔茨海默症早期动物模型，以相同周龄、雌性C57BL/6小鼠为对照，分组如下：(1)野生型组：C57BL/6小鼠；(2)阿尔茨海默症组：APP/PS1小鼠；(3)治疗组：给予负载催产素的壳聚糖纳米凝胶治疗的APP/PS1小鼠；每组20只。对于治疗组，负载催产素的壳聚糖纳米凝胶(1M,100μL)通过尾静脉注射途径给药到小鼠体内，每周给药一次，共给药12次。治疗后每组小鼠分别取材检测相关指标。
分别提取各组小鼠海马提取总蛋白，采用蛋白质印迹法检测病理特征标志物的表达水平，包括：TNF-α、IL-1β及MOAB-2的表达情况。结果如图6所示：阿尔茨海默症组中TNF-α、IL-1β及MOAB-2的水平明显高于野生型，而治疗组中TNF-α、IL-1β及MOAB-2的水平比阿尔茨海默症组显著降低，表明负载催产素的壳聚糖纳米凝胶早期干预能显著抑制APP/PS1小鼠海马炎症因子表达，降低Aβ沉积水平，起到神经保护作用。
分别获取各组小鼠全脑组织，通过多聚甲醛固定，制成全脑石蜡切片，通过TUNEL细胞凋亡试剂盒检测神经元凋亡水平。结果如图7所示：阿尔茨海默症组的TUNEL绿色荧光明显高于野生型，主要分布在海马和皮层，而治疗组中TUNEL绿色荧光水平比阿尔茨海默症组显著降低，表明负载催产素的壳聚糖纳米凝胶早期干预能显著抑制APP/PS1小鼠海马和皮层的神经元凋亡，起到神经保护作用。
治疗结束后通过矿场试验、水迷宫试验、新物体识别试验评估小鼠的学习和记忆能力，具体方法如下：(1)矿场试验：观测小鼠的自主行为、探究行为与紧张度。保持实验在安静的环境下进行。将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时，观察小鼠在120s内的运动情况，记录内容包括每只小鼠的运动距离、运动轨迹及运动速度(2)水迷宫试验：Morris水迷宫测试检测小鼠空间学习和记忆能力，包括隐藏平台的定位航行试验和撤去平台的空间探索试验。在定位航行试验中，连续5天每天将小鼠面向池壁分别从四个象限放入水池，在60s内实验观察和记录小鼠寻找到平台的时间，考察小鼠的学习能力；最后一天撤去平台，从距离平台位置最远的位置将小鼠放入水中，观测其游泳轨迹，考察小鼠对原平台的记忆能力。(3)新物体识别试验：测试小鼠先天对新物体有探索倾向的学习记忆能力。包括训练及测试试验。在训练实验中，将A、B两个物体放在一侧壁的左右两端，小鼠背朝两物体放入场地内，并且小鼠鼻尖距离两物的长度一致。小鼠放入10分钟，并观察记录小鼠与这两物体接触的情况，包括鼻子、嘴巴触及物体的次数和距离物体2-3厘米范围内探究的时间。待小鼠休息1小时后开始测试试验，将场地内的B物体换作C物体，仍将小鼠背向两物体，鼻尖据两物体距离相同，观察2-5分钟，观察指标同前所述。
水迷宫试验结果如图8所示：野生组和治疗组小鼠的游泳轨迹均表现出对平台所在象限和平台位置有明显的趋向性，而阿尔茨海默症组小鼠的游泳轨迹无目的性，且具有绕圈现象，表明负载催产素的壳聚糖纳米凝胶早期干预能够提高APP/PS1小鼠的学习和记忆能力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的负载催产素的壳聚糖纳米凝胶的制备及在阿尔茨海默症早期干预中的应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围之内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
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