发明内容

本发明的目的在于，提供一种黑骨藤的检测方法、黑骨藤对照提取物的制备及其应用。本发明所述的检测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，降低了检验成本；使用对照提取物作为标准物质可以同时对多个组分进行含量测定，符合中药整体质量控制的思想。本发明还提供了黑骨藤乙酸乙酯部位在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用。

本发明的技术方案：一种黑骨藤对照提取物的制备方法，包括如下步骤：精密称取药材粉末，按料液比1:20-30加入60-80％乙醇溶液，加热回流提取2-4次，每次50-70min，合并提取液，于70℃水浴蒸干，加水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，将3次乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩，水浴蒸干，真空干燥，研磨至粉末状，得黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取部位HGT-C粉末；称取黑骨藤乙酸乙酯部位，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱，依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱，其中20％段合并为第一段a1，中间合并为第二段a2，后为一段a3；30％、50％段各自合并分别为a4、a5；将a5段取2g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱；依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱；各自合并为b1、b2、b3；将以上a2和b3以5:2的比例合并，即得黑骨藤对照提取物。

前述的黑骨藤对照提取物的制备方法，包括如下步骤：精密称取药材粉末，按料液比1:25加入70％乙醇溶液，加热回流提取3次，每次60min，合并提取液，于70℃水浴蒸干，加水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，将3次乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩，水浴蒸干，真空干燥，研磨至粉末状，得黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取部位HGT-C粉末；称取黑骨藤乙酸乙酯部位10g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱，依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4000mL，其中20％段前1000ml合并为第一段a1，中间2500ml合并为第二段a2，后500ml为一段a3；30％、50％段各自合并分别为a4、a5；将a5段取2g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱；依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱；各自合并为b1、b2、b3；将以上a2和b3以5:2的比例合并，即得黑骨藤对照提取物。

所述黑骨藤对照提取物在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用。

一种黑骨藤的检测方法为：对黑骨藤进行提取，得提取溶液，所述检测方法包括含量测定方法，所述含量测定方法包括对提取溶液中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、绿原酸甲酯、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的含量检测。

前述的黑骨藤的检测方法中，所述新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、绿原酸甲酯、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C的含量检测方法为：

采用ZORBAX Eclipse plus C18色谱柱2.1mm×100mm，1.8μm；以0.0.05％-0.15％甲酸水A-乙腈B为流动相，进行梯度洗脱，检测波长327nm，流速0.2ml/min，柱温30℃；

混合对照品溶液的制备：精密称取新绿原酸5.06份、绿原酸25.05份、隐绿原酸8.04份、绿原酸甲酯5.05份，异绿原酸B5.02份，异绿原酸A 5.00份，异绿原酸C 7.05份，置于50mL量瓶，加50％甲醇定容，制成混合对照品溶液①，摇匀，备用；吸取上述混合对照品溶液①1mL，置于100mL量瓶，50％甲醇定容，摇匀，制成混合对照品溶液②，摇匀，备用；

对照提取物溶液的制备：称取黑骨藤乙酸乙酯部位10g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱；依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4000mL；其中20％段前1000ml合并为第一段a1，中间2500ml合并为第二段a2，后500ml为一段a3；30％、50％段各自合并分别为a4、a5；将a5段取2g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱；依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱；各自合并为b1、b2、b3；将以上a2和b3以5:2的比例合并，即得对照提取物；精密称取黑骨藤对照提取物14mg，置10mL量瓶中，加50％甲醇2mL，超声处理1min，放冷，加50％甲醇定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得对照提取物溶液；

供试品溶液的制备：精密称取药材样品粉末10-20g，按料液体积比1:20-30加入70％乙醇溶液400mL，加热回流提取2-4次，每次50-70min，合并提取液，于70℃水浴蒸干，加水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，将3次乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩，水浴蒸干，真空干燥，研磨至粉末状，得黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取部位HGT-C粉末；精密称定HGT-C粉末25mg，置10mL量瓶，加甲醇2mL，超声处理2min，放冷，加甲醇定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

测定法：分别吸取混合对照品溶液、对照提取物溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，测定，即得。

前述的黑骨藤的检测方法中，所述流动相为0.1％甲酸水A-乙腈B。

前述的黑骨藤的检测方法中，所述洗脱流程为：0-3.4min；7％-9％B；3.4-5.4min；9％-11％B；5.4-7min；11％-13％B；7-8.3min；13％-13.5％；8.3-10min；13.5％-15％B；10-14.5min；15％-15.1％B；14.5-15min；15.1％-16％B；15-17min；16％-18％B；17-21min；18％-21％B；21-23min；21％-26％B；23-25min；26％-100％B。

前述的黑骨藤的检测方法中，所述供试品溶液的制备：精密称取药材样品粉末16份，按料液比1:25加入70％乙醇溶液400mL，加热回流提取3次，每次50-70min，合并提取液，于70℃水浴蒸干，加水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，将3次乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩，水浴蒸干，真空干燥，研磨至粉末状，得黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取部位HGT-C粉末；精密称定HGT-C粉末25mg，置10mL量瓶，加甲醇2mL，超声处理2min，放冷，加甲醇定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究：

实验例1：黑骨藤对照提取物标定及其在药材质量控制中的应用

1.仪器与试剂

Agilent 1290 infinityⅡ超高效液相色谱仪(美国Agilent公司)，包括二元梯度泵，高能自动进样器，DAD检测器和色谱工作站；FA2204B型万分之一电子天平(上海天美天平仪器有限公司)；MS205DU型十万分之一电子天平(北京中仪汇丰瑞士梅特勒托利多仪器(中国)有限公司)。DZ-2BCIV型真空干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)。

新绿原酸(批号CHB190217)，绿原酸(批号CHB190121)，隐绿原酸(批号CHB1809055)，绿原酸甲酯(批号CHB190117)，异绿原酸B(批号CHB180923)，异绿原酸A(批号CHB180921)，异绿原酸C(批号CHB180925)均购于成都克洛玛生物科技有限公司，质量分数均大于98％。黑骨藤药材购自贵阳市花果园药材市场，经贵州中医药大学刘育辰教授鉴定为萝藦科(Asclepiadaceae)杠柳属植物黑龙骨(Periploca forrestii Schltr.)。

乙腈为色谱纯(美国TEDIA公司)，其他试剂均为分析纯，HPLC用水为娃哈哈有限公司纯净水。

2.方法与结果

2.1黑骨藤对照提取物的研究

2.1.1对照提取物的制备

称取黑骨藤乙酸乙酯部位10g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱。依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱，每个梯度洗脱4000mL。其中20％段前1000ml合并为第一段(a1)，中间2500ml合并为第二段(a2)，后500ml为一段(a3)。30％、50％段各自合并分别为a4、a5。将a5段取2g，用等量的PRP-512B型树脂拌样，装柱。依次用20％、30％、50％的甲醇梯度洗脱。各自合并为b1、b2、b3。将以上a2和b3以5:2的比例合并，即得黑骨藤对照提取物。

2.1.2对照提取物标定

以新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的对照品为对照，测定黑骨藤对照提取物中这7个指标成分的含量。

2.2色谱条件

采用ZORBAX Eclipse plus C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；以0.1％甲酸水(A)-乙腈(B)为流动相，进行梯度洗脱，洗脱程序为：0～3.4min；7％～9％B；3.4～5.4min；9％～11％B；5.4～7min；11％～13％B；7～8.3min；13％～13.5％；8.3～10min；13.5％～15％B；10～14.5min；15％～15.1％B；14.5～15min；15.1％～16％B；15～17min；16％～18％B；17～21min；18％～21％B；21～23min；21％～26％B；23～25min；26％～100％B。流速0.2ml/min，检测波长327nm，柱温30℃，进样量2μL，在上述色谱条件下，混合对照品和对照提取物色谱图分别见图1、图2。

2.3混合对照品溶液的配制

分别精密称取新绿原酸5.06mg、绿原酸25.05mg、隐绿原酸8.04mg、绿原酸甲酯5.05mg，异绿原酸B5.02mg，异绿原酸A 5.00mg，异绿原酸C 7.05mg，置于50mL量瓶，加50％甲醇定容，制成混合对照品溶液①，摇匀，备用。吸取上述混合对照品溶液①1mL，置于100mL量瓶，50％甲醇定容，摇匀，制成混合对照品溶液②，摇匀，备用。

2.4对照提取物供试品溶液配制

精密称取黑骨藤对照提取物14mg，置10mL量瓶中，加50％甲醇2mL，超声处理1min，放冷，加50％甲醇定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.5方法学考察

2.5.1线性关系

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液①、溶液②，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液混合对照品溶液①按“2.2”项下色谱条件分别进样1μL、2μL、3μL、4μL、5μL，混合对照品溶液②按“2.2”项下色谱条件分别进样1μL、3μL、5μL进行测定，测定各色谱峰峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标(x)，色谱峰峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程；以信噪比(S/N)约为3:1的对照品溶液浓度作为检测限(LOD)，以信噪比(S/N)约为10:1的对照品溶液浓度为定量限(LOQ)。结果见表1。

表1 7个指标成分的回归方程及线性范围

Table 1 The regression equations and liner ranges of the seven markercomponents

2.5.2精密度试验

精密吸取“2.3”项下混合对照品溶液①，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测得新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD(n＝6)分别为0.1％、0.1％、0.1％、0.1％、0.1％、0.2％、0.2％，表明该仪器精密度良好。

2.5.3重复性试验

取黑骨藤对照提取物按“2.4”项下方法平行制备6份对照提取物供试品溶液，分别进样，测定新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的含量，计算其RSD分别为1.1％、0.3％、0.5％、1.2％、1.1％、1.2％、2.1％，均小于3％，表明该方法重复性良好。

2.5.4稳定性试验

按“2.4”项下方法制备对照提取物供试品溶液1份，分别于制备之后0、2、4、8、12、20、24h按照“2.2”项下色谱条件进样测定，结果新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD分别为0.4％、0.1％、0.4％、0.3％、2.3％、0.3％、0.2％，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.5.5加样回收率

取已知含量的黑骨藤对照提取物7mg，精密称定，平行6份，分别精密加入不同浓度的新绿原酸(0.1794mg/mL)、绿原酸(2.59mg/mL)、隐绿原酸(0.667mg/mL)、绿原酸甲酯(0.3984mg/ml)、异绿原酸B(0.01466mg/mL)、异绿原酸A(0.02744mg/mL)和异绿原酸C(0.0519mg/mL)对照品各1mL，按“2.4”项下方法制备对照提取物供试品溶液，按照“2.2”项下色谱条件进样测定，并计算各成分的平均加样回收率及RSD值。结果新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的平均加样回收率分别为102.51％、100.85％、99.05％、97.84％、100.33％、99.49％、97.70％，RSD分别为0.7％、1.3％、1.5％、2.4％、1.6％、1.5％、1.3％，表明建立的含量测定方法准确性良好。结果见表2。

表2加样回收率试验结果(n＝6)

Table 1.2 Results of recovery rates(n＝6)

3.对照提取物在黑骨藤药材质量控制中的应用

以黑骨藤对照提取物为对照，测定黑骨藤药材中新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C 7个成分的含量，并与单体对照品测得的结果进行比较，考察对照提取物用于药材质量控制的科学性和可行性。药材来源见表3。

表3样品来源信息

Table 3 Source information of samples

3.1对照提取物溶液配制

精密称定黑骨藤对照提取物40.03mg，置5ml量瓶中，加50％甲醇2ml，超声处理1min，放冷，加50％甲醇定容至刻度、摇匀，溶解后，制成新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的质量浓度分别为0.2050、2.9588、0.7633、0.4552、0.0168、0.0313、0.0592mg/ml的对照提取物溶液A；将上述对照提取物溶液A稀释10倍；100倍；250倍作为对照提取物溶液B、C、D。

3.2黑骨藤药材供试品溶液配制

精密称取药材样品粉末16.0g，按料液比1:25加入70％乙醇溶液400mL，加热回流提取3次，每次1h，合并提取液，于70℃水浴蒸干，加水使成混悬液，分别依次用等量石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，各萃取3次，将3次乙酸乙酯萃取液合并，减压浓缩，水浴蒸干，真空干燥，研磨至粉末状，得黑骨藤醇提物乙酸乙酯萃取部位(HGT-C)。精密称定HGT-C部位粉末25mg，置10mL量瓶，加甲醇2mL，超声处理2min，放冷，加甲醇定容至刻度、摇匀，经0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

3.3色谱条件

色谱条件同“2.2”项下条件。对照提取物和黑骨藤药材样品色谱图见图3、图4。

3.4方法学考察

3.4.1线性关系

精密吸取“3.1”项下不同倍数的黑骨藤对照提取物溶液，对照提取物A分别进1μL、3μL、5μL；对照提取物B分别进1μL、2μL、3μL；得到对照提取物C进5μL；对照提取物D分别进1μL、3μL注入超高效液相色谱仪，按照“2.2”项下色谱条件测定色谱峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标，色谱峰峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得出回归方程，最后以对照提取物B+对照提取物C+对照提取物D得出新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯的线性回归方程；对照提取物A+对照提取物B得出异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的线性回归方程结果见表4。

表4对照提取物线性关系考察

Tab 4 The regression equations and linear ranges of the referenceextracts

3.4.2精密度试验

按照“2.4”项下方法制备对照提取物供试品溶液1份，按照“2.2”项下色谱条件连续进样6次，测得测得新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD(n＝6)分别为0.4％、0.1％、0.1％、0.3％、1.5％、0.7％、0.3％，表明该仪器精密度良好。

3.4.3重复性试验

取同一批黑骨藤药材(S9)HGT-C部位粉末，按“2.2”项下方法平行制备6份黑骨藤药材供试品溶液，分别进样，测定峰面积，新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的含量，计算其RSD分别为0.2％、1.0％、1.1％、1.6％、0.7％、1.2％、1.1％，均小于3％，表明该方法重复性良好。

3.4.4稳定性试验

按“3.2”项下方法制备黑骨藤药材供试品溶液1份，分别于0、2、4、8、12、20、24h按色谱条件进样测定，结果新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C色谱峰峰面积的RSD分别为0.3％、0.5％、0.5％、1.1％、0.9％、0.5％、0.2％，表明供试品溶液在24h内稳定。

3.4.5加样回收

取同一批黑骨藤样品(S9)HGT-C部位供试品粉末12.5mg，精密称定，置于10mL量瓶中，分别精密加入不同浓度的新绿原酸(0.03372mg/mL)、绿原酸(0.852mg/mL)、隐绿原酸(0.1139mg/mL)、绿原酸甲酯(0.04568mg/mL)、异绿原酸B(0.0559mg/mL)、异绿原酸A(0.1142mg/mL)和异绿原酸C(0.5648mg/mL)对照品各1mL，超声2min，加甲醇定容至刻度，摇匀，平行制备6份。按“2.2.3”项下的色谱条件进样测定，记录各成分峰面积，计算其回收率分别98.52％、98.44％、97.44％、.26％、100.1％、99.54％、102.09％，RSD值分别为2.0％、2.5％、2.5％、2.3％、2.8％、1.6％、1.4％，表明建立的含量测定方法准确性良好。结果见表5。

表5加样回收率试验结果(n＝6)

Table5 Results of recovery rates(n＝6)

3.5样品分析

取12批黑骨藤药材，精密称定，按“3.2”项下方法制备黑骨藤供试品溶液，分别采用黑骨藤对照提取物法和单体对照品法测定新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的含量，结果见表6。

表6 12批样品测定结果(mg/g)

Table 6 Determination results of 12 batches of samples

4.小结：本申请先后比较了用70％甲醇、70％乙醇提取的供试品溶液的色谱峰。从色谱图中可以看出，50％甲醇、50％乙醇出峰数目较少，尤其是绿原酸甲酯峰面积很小，因此采用70％乙醇回流提取后，用不同极性的溶剂(石油醚、氯仿、乙酸乙酯)萃取，且本发明能同事测定7种咖啡酰基奎宁酸类成分(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、绿原酸甲酯、异绿原酸B、异绿原酸A和异绿原酸C)。

咖啡酰基奎宁酸类化合物存在的酯键，不饱和双键，邻二酚羟基，羟基等，是这类化合物容易发生变化的主要因素，此类化合物由许多同分异体组成，容易发生重叠化，获得单一的稳定的该类单体化合物非常困难，本发明在前期研究咖啡酰基奎宁酸类及其对照提取物制备方法的基础上，制备出含量明确的对照提取物，建立了基于咖啡酰基奎宁酸类对照提取物的黑骨藤药材含量测定方法，并分别采用了对照提取物法和对照品法对黑骨藤药材中新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C的含量进行分析测定，结果显示对照提取物与对照品法所得测定结果基本一致，表明对照提取物可替代单体对照品实现对黑骨藤药材的质量控制，且该质量控制更能满足实际需要，更符合中药多成分的特色。同时也解决了此类成分不稳定，难以制备的难题。

实验例2：黑骨藤对照提取物抗类风湿性关节炎有效性验证

1.实验动物

SPF级SD大鼠，体重(200±20g)；许可证号：SCXK(湘)2019-0014，由湖南省长沙市天勤生物技术有限公司提供。药理试验期间，动物室温度控制和相对湿度分别控制在25±2℃；60±10％。照明时间昼夜交替，动物自由饮水，进食，保持垫料干燥，大鼠的模型建立于适应喂养3d后进行。所有实验研究均符合中国伦理委员会有关动物研究指导原则。

2.药材及试剂

药材于2018年购买于贵阳市花果园药材市场，经贵州中医药大学大学刘育辰教授鉴定为萝藦科(Asclepiadacea)杠柳属(Periploca)植物黑龙骨(P.forrestii Schltr.)；雷公藤多苷片(批号：1450003，贵州汉方药业有限公司)；新绿原酸，绿原酸，隐绿原酸，绿原酸甲酯，异绿原酸B，异绿原酸A，异绿原酸C均购于成都克洛玛生物科技有限公司，质量分数均大于98％。牛Ⅱ型胶原溶液(美国Chondrex公司)；弗氏完全佐剂(美国Chondrex公司)；弗氏不完全佐剂(美国Chondrex公司)等。EDTA脱钙液(型号：B0317-11，四川杨克斯特科技有限公司)；7122苏木素(美国Thenrmo Fisher公司)；伊红(美国Thenrmo Fisher公司)。

3.实验仪器

TD5A-WS型离心机(湖南湘立科学仪器有限公司)，JE1002型电子天平(上海浦春计量仪器有限公司)，MNT-150型数显卡尺(浙江德清信泰电子科技有限公司)。MS205DU型十万分之一电子天平(北京中仪汇丰瑞士梅特勒托利多仪器(中国)有限公司)，Rayto RT-6100酶标分析仪，RM2235石蜡切片机(德国Leica)，CX22光学显微镜(日本OLMPUS)，DM1000徕卡显微成像系统(德国Leica)等。

4.实验方法

4.1供试药物制备

黑骨藤对照提取物按实验例1中2.1.1所述方法富集所得到。经含量测定，咖啡酰基奎宁酸类成分合计448.01mg/g。

4.2 CIA大鼠模型的建立

在冰浴条件下，用匀浆机将牛Ⅱ型胶原溶液与弗氏完全佐剂等体积充分乳化(将乳剂滴于水面上成团不散开即为充分乳化)，配成胶原乳剂，现配现用。大鼠适应性饲养3d后，固定器固定，剃除尾根部的毛，初次免疫尾根部皮内注射0.2mL胶原乳剂。初次免疫7d后，同样的方法配制，牛Ⅱ型胶原溶液与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化配成的胶原乳剂，尾根部皮内注射0.1mL胶原乳剂(避开初次免疫注射点)。正常组注射生理盐水。初次免疫18d后，大鼠关节炎指数(AI)≥4分为造模成功。AI＝四肢关节炎指数评分之和，最高16分。

表7 AI评分标准

4.3分组及给药

初次免疫18d后，将造模成功的大鼠随机分为雷公藤多苷(TG)组(10mg/kg)、模型组、对照提取物给药组低、高剂量组(36、144mg/kg)、对照品给药组低、高剂量组(按照对照提取物里面成分所占比率计算)，加上空白对照组，每组8只。

黑骨藤药材对照提取物的低、高剂量分别相当于人临床生药用量的12.6，50.4倍。各药物用生理盐水溶液分散，正常组和模型组给予生理盐水溶液，给药体积均为10mL/kg，灌胃28d，每天一次。

4.4 AI值评分和足趾厚度测量

给药第一天记第0d，间隔6d，评分一次，间隔7d，测量大鼠足趾厚度并拍照。测量足趾厚度时，均平行测三次取平均值。

4.5血清因子测定和滑膜病理变化观察

给药28d后，禁食12h以上，不禁水，用新配置的10％水合氯醛0.4mL/100g麻醉大鼠，采用腹主动脉取血，将血液样本于冰浴上静置30min后，置离心机中4000rpm/min离心20min，移液枪取上清液，置于-80℃，备用。根据ELISA试剂盒说明书操作。大鼠取完血脱颈处死，去除左后足踝关节皮毛，用动物骨剪取下踝关节，用4％多聚甲醛中性固定液固定，常规脱钙后包埋组织块于石蜡中，切成5μm厚的薄片，脱蜡后伊红染色，显微镜下观察组织病理学变化。

4.6统计学分析

采用SPSS 24.0和Graphpad Prism 8.0.2统计软件进行分析及作图，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，进行单因素方差分析，方差齐性时，各组间两两比较采用LSD检验，方差不齐性时，各组间两两比较采用Tamhance’s T2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

5.实验结果

5.1黑骨藤对照提取物对CIA大鼠的影响

5.1.1黑骨藤对照提取物对CIA大鼠右后足足趾厚度的影响

给药前，与模型组比较，各药物组无显著性差异，正常组有极显著差异(P<0.01)且给药28d后仍有极显著性差异(P<0.01)，说明造模成功且模型相对稳定；给药28d后，与模型组比较TG组；对照提取物低、高剂量组有极显著性差异(P<0.01)。见表8。

表8黑骨藤对照提取物对CIA大鼠右后足足趾厚度的影响mm

注：与模型组比较，^*P<0.05，^**P<0.01(下同)

5.1.2黑骨藤对照提取物对CIA大鼠左后足足趾厚度的影响

给药28d后，与模型组比较TG组；对照提取物低、高剂量组有极显著性差异(P<0.01)。见表9。

表9黑骨藤对照提取物对CIA大鼠左后足足趾厚度的影响mm

5.1.3黑骨藤对照提取物对CIA大鼠AI值的影响

给药前，与模型组比较，各药物组无显著性差异；给药28d后，与模型组比较，TG组和对照提取物低，高剂量组有显著性差异(P<0.01)。见表10。根据图10，模型组0d到28d无显著性差异，对照提取物高在给药13d之后均有极显著差异，TG组与对照提取物低组在给药20d后有极显著性差异。

表10黑骨藤对照提取物对CIA大鼠AI值的影响

5.1.4黑骨藤对照提取物对CIA大鼠血清促炎细胞因子表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α含量显著升高(P<0.01)和TG组TNF-α含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，对照提取物低、高剂量组TNF-α含量显著降低(P<0.01，P<0.05)；对照提取物低剂量组与TG组TNF-α含量显著降低(P<0.05)。见表11。

表11对照提取物对CIA大鼠血清促炎细胞因子表达的影响pg/mL

5.1.5黑骨藤对照提取物对CIA大鼠滑膜组织病理变化的影响

将大鼠关节组织样品石蜡包埋切片HE染色之后在显微镜下观察组织病理学变化。主要的病变特征包括：增生性病变，其特征为关节滑膜衬里细胞增生及结缔组织增生；炎症反应，该病变又表现为滑膜组织内存在不同程度的炎性细胞浸润，部分关节腔内见大量炎性细胞和红细胞。详见图12：(单位：Bar＝100μm)

5.2混合对照品对CIA大鼠的影响

5.2.1混合对照品对CIA大鼠右后足足趾厚度的影响

给药前，与模型组比较，各药物组无显著性差异，正常组有极显著差异(P<0.01)且给药28d后仍有极显著性差异(P<0.01)，说明造模成功且模型相对稳定；给药28d后，与模型组比较TG组；对照提取物低、高剂量组有极显著性差异(P<0.01)。见表12。

表12混合对照品对CIA大鼠右后足足趾厚度的影响mm

5.2.2混合对照品对CIA大鼠左后足足趾厚度的影响

给药28d后，与模型组比较TG组；对照提取物低、高剂量组有极显著性差异(P<0.01)。见表13。

表13混合对照品对CIA大鼠左后足足趾厚度的影响mm

5.2.3混合对照品对CIA大鼠AI值的影响

给药前，与模型组比较，各药物组无显著性差异；给药28d后，与模型组比较，TG组和对照提取物低，高剂量组有显著性差异(P<0.01)。见表14。

表14混合对照品对CIA大鼠AI值的影响

5.2.4混合对照品对CIA大鼠血清促炎细胞因子表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清中TNF-α含量显著升高(P<0.01)、TG组和混合对照品低剂量血清中TNF-α含量显著升高(P<0.05)；与模型组比较，混合对照品高剂量组血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低(P<0.01)；混合对照品低剂量血清中TNF-α含量显著降低(P<0.05)；与TG组比较，混合对照品高剂量血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低(P<0.05，P<0.01，P<0.01)；混合对照品高剂量与混合对照品低剂量比较血清中IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著降低(P<0.01，P<0.01，P<0.01)。见表15。

表15混合对照品对CIA大鼠血清促炎细胞因子表达的影响pg/mL

5.2.5混合对照品对CIA大鼠滑膜组织病理变化的影响

将大鼠关节组织样品石蜡包埋切片HE染色之后在显微镜下观察组织病理学变化。详见图19：(单位：Bar＝100μm)

6小结

实验结果表明，黑骨藤对照提取物和混合对照品共7个咖啡酰基奎宁酸类成分可有效缓解足趾肿胀，减小关节炎评分，改善组织病理学变化，并且有效减少了CIA大鼠血清中的促炎细胞因子水平，尤其是TNF-α。得出黑骨藤乙酸乙酯部位所含的咖啡酰基奎宁酸类成分具有良好的抗RA活性。

RA是一种自身免疫性疾病，它导致滑膜组织和关节慢性炎症，导致关节功能障碍，最终导致残疾。CIA模型与人RA具有共同的免疫学和病理学特征，因此常用于新药或其他治疗药物的初步药理学研究[34]。RA的病理学涉及多种淋巴细胞，例如T细胞，B细胞等，其中滑膜炎是RA最典型的特征。TNF-α在RA的发生和发展中起着关键作用，它可以增强天然免疫反应，刺激其他炎症细胞因子的释放，最终导致滑膜基质降解和滑膜增生。IL-6的水平升高在RA患者血清中已得到普遍证实，并与疾病严重程度的临床指标直接相关。抗IL-1β治疗Ⅱ型CIA小鼠能有效的阻止软骨和骨破坏，TNF-α拮抗剂可以改善滑膜炎。TNF-α，IL-6和IL-1β均是反映患者疼痛和炎症症状的重要指标。

本发明采用了系统的药理学实验来验证黑骨藤乙酸乙酯部位中的咖啡酰基奎宁酸类成分是否是黑骨藤抗类风湿性关节炎的指标性成分。其中对照提取物的抗RA效果略优于咖啡酰基奎宁酸类成分混合对照品，说明在黑骨藤对照提取物中还有其他化学成分也对抗RA有活性，研究结果也将为明确黑骨藤药材抗RA的药效物质基础和建立全面的、科学的黑骨藤药材质量评价体系提供理论基础。

与现有技术相比，本发明所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，结果可靠，降低了检验成本；使用对照提取物作为标准物质可以同时对多个组分进行含量测定，符合中药整体质量控制的思想。本发明还提供了黑骨藤对照提取物在制备抗类风湿性关节炎的药物中的应用，为研究黑骨藤抗类风湿性关节炎的指标性成分具有重要的意义。