具体实施方式

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌致病力中的应用。

在本发明中，所述VdILV2B的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板通过克隆测序得到AHAS的催化亚基基因VdILV2B。VdILV2B基因预测编码蛋白含有550个氨基酸。序列分析显示VdILV2B包含1个N-末端硫胺素焦磷酸酶(TPE) 结合结构域、1个中心TPE结构域和1个C-末端TPE结合结构域(见图1)。

为了验证VdILV2B的缺失是否会影响大丽轮枝菌致病力，本发明以野生型菌株V592为基础菌株构建了敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2B，并在ΔVdILV2B基础上进行基因互补，得到互补菌株ECVdILV2B。所述敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2B的构建方法利用同源重组原理完成，具体可参见现有技术获得敲除以及互补突变体(WANG S, XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloningstrategy simplifies the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-based gene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6):645-652.)。本发明分别以ΔVdILV2B、互补菌株ECVdILV2B和野生型菌株V592为实验对象，分别测定以下指标：病情指数、维管束变褐程度和寄主上的定殖能力，结果表明，敲除突变体ΔVdILV2B所致病害的病情指数分别为42.1～44.5；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90；同时接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV2B维管束变褐程度明显减弱；VdILV2B基因敲除使大丽轮枝菌在棉花茎中的定殖受到一定阻碍。上述实验结果表明，VdILV2B基因敲除可降低大丽轮枝菌的致病力，即VdILV2B基因与致病力相关。

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌休眠体和繁殖体产量中的应用。

所述休眠体优选包括微菌核。在本发明中，所述繁殖体优选包括分生孢子。VdILV2B基因敲除突变体产生的微菌核量明显低于V592菌株和互补菌株，说明VdILV2B基因参与大丽轮枝菌休眠体的形成。ΔVdILV2B突变体产孢量均显著低于野生型菌株V592；所有互补菌株的产孢量几乎都恢复至野生型菌菌株的水平。这表明，VdILV2B基因缺失降低了大丽轮枝菌繁殖体产量，VdILV2B基因参与大丽轮枝菌繁殖体的形成。

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在调控大丽轮枝菌生长速度中的应用。试验表明，VdILV2B基因敲除突变体的菌落生长速率显著高于V592菌株，并且产生更多的气生菌丝。

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B在大丽轮枝菌亮氨酸合成中的应用。

在本发明中，为明确VdILV2B在亮氨酸合成途径中的作用，在营养缺陷型培养基上培养敲除突变体ΔVdILV2B、互补菌株和野生型菌株V592，添加外源氨基酸，结果表明，5mMLeu对V592和ΔVdILV2B敲除突变体以及互补体ECVdILV2B均有反馈抑制作用，V592相较于敲除体与互补体反馈抑制作用最强；且5mM Leu抑制了VdILV2B基因的表达，这表明VdILV2B基因是支链氨基酸合成途径中的重要组成部分。为了明确催化亚基ΔVdILV2B基因敲除对大丽轮枝菌支链氨基酸合成途径AHAS下游基因表达的影响，通过 RT-qPCR分别对下游基因的转录表达进行测定，结果显示，下游基因的相对表达量表现显著下调，其中异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸合成都必需的二羟酸脱水酶的2个基因(VDAG-03858和VDAG-04620)、支链氨基酸转氨酶的 1个基因(VDAG-02852)和亮氨酸合成必需的2-异丙基苹果酸合成酶的1 个基因(VDAG_03299)、3-异丙基苹果酸脱水酶的1个基因(VDAG_00564)、 3-异丙基苹果酸脱氢酶的1个基因(VDAG-06467)(见图9)。上述结果表明，AHAS单个亚基基因的敲除对支链氨基酸合成途径大多数下游基因的表达都有影响。再次证实了VdILV2B参与了支链氨基酸生物合成途径。

由于AHAS是除草剂作用的靶标，为了验证VdILV2B基因与除草剂的作用关系，采用磺酰脲类除草剂和双草醚接种野生型菌株V592，观察菌落形态发现在1638.4mg/L作用下苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核；并且采用3种不同浓度的苯磺隆和双草醚分别处理V592，结果表明VdILV2B基因的相对表达量呈下调趋势，且浓度越高下调越显著。这表明VdILV2B基因为杀虫剂的作用靶点。因此，本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B作为药物靶点在防治棉花黄萎病中的应用。

本发明提供了一种用于防治棉花病害的杀菌剂，主要活性成分包括降低大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B表达的试剂。

在本发明中，所述试剂优选包括磺酰脲类除草剂和/或嘧啶水杨酸类除草剂。所述磺酰脲类除草剂的浓度优选不低于409mg/L，更优选为 500～1638.4mg/L，最优选为1638.4mg/L。所述嘧啶水杨酸类除草剂的浓度优选不低于409mg/L，更优选为500～1638.4mg/L，最优选为1638.4mg/L。

本发明对所述杀菌剂的使用方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的杀菌剂的常规喷施方法即可。所述杀菌剂通过降低VdILV2B基因的致病力达到防控病害发生和发展的目的。

下面结合实施例对本发明提供的大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2B的构建方法

根据VdILV2B基因(核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示)的上下游同源臂设计引物，利用同源重组技术构建敲除载体，以野生型菌株V592为初始菌株，构建突变株，具体参见现有技术(WANG S,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloningstrategy simplifies the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-based gene-disruption method for Verticillium dahliae.Phytopathology,2016,106(6): 645-652.)获得敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株(ΔVdILV2B-1，ΔVdILV2B-2)。

实施例2

一种大丽轮枝菌VdILV2B基因互补突变体ECVdILV2B的构建方法

以实施例1构建的大丽轮枝菌突变株ΔVdILV2B为初始菌株，参见现有技术(WANGS,XING H,HUA C,GUO H S,ZHANG J.An improved single-step cloning strategysimplifies the Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation(ATMT)-basedgene-disruption method for Verticillium dahliae. Phytopathology,2016,106(6):645-652.)获得大丽轮枝菌VdILV2B基因互补突变体(ECVdILV2B-1，ECVdILV2B-2)。

实施例3

菌落生长速率的测定：以实施例1制备的敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株、实施例2制备的VdILV2B基因互补突变体以及野生型菌株V592 为实验对象进行培养，分别取挑菌丝接种于PDA培养基中央，22℃黑暗培养。于接种后的第5天以及第9天，测量所有菌株的菌落直径，按照式I计算菌落的平均生长速率。

菌落的平均生长速率＝(菌落生长速度＝(第9d平均菌落生长直径-第5 d菌落平均生长直径)/4) 式I。

每个菌株设置3个重复，在第15天拍照记录菌落形态。

菌丝的形态观察：大丽轮枝菌在PDA平板上划线培养，再将灭菌的盖玻片斜插到划线部位，22℃暗培养3d，取出盖玻片在显微镜下观察菌丝生长情况。

结果表明，VdILV2B基因敲除突变体的菌落生长速率显著高于V592菌株，并且产生更多的气生菌丝(见图2)。

实施例4

微菌核量的测定

以实施例1制备的敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株、实施例2 制备的VdILV2B基因互补突变体以及野生型菌株V592为实验对象进行培养，得到菌病。分别用打孔器对每种菌株打取10个左右菌饼接种于查氏(含 kan)液体培养基中，26℃摇床中200r/min摇培3～5d；过滤收集分生孢子；调孢子浓度将分生孢子浓度调为1.0×10⁶CFU/mL，吸取100μL均匀涂布于平铺玻璃纸的MM平板(NaNO₃2g、KH₂PO₄ 1g、MgSO₄·7H₂O 0.5g、KCl 0.5g，柠檬酸10mg,ZnSO₄·7H₂O 10mg、FeSO₄·7H₂O 10mg，NH₄Fe(SO₄)₂)·12H₂O 2.6mg，CuSO₄·7H₂O0.5mg，NnSO₄·H₂O 0.1mg，H₃BO₃ 0.1mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.1mg，葡萄糖2g，1.5琼脂，加蒸馏水至1L。在113℃下高压灭菌20min) 上，22℃黑暗条件培养15d，拍照观察，刮取玻璃纸上的培养物并进行称重测量，并记录其湿重，再将微菌核在室温下放置48h晾干，在天平上称量，记录其干重数据。

结果表明，VdILV2B基因敲除突变体产生的微菌核量明显低于V592菌株和互补菌株(图3)。

实施例5

产孢量的测定

以实施例1制备的敲除VdILV2B基因的大丽轮枝菌突变株、实施例2 制备的VdILV2B基因互补突变体以及野生型菌株V592为实验对象进行培养，分离分生孢子，制备分生孢子悬浮液。分别吸取1.0×10⁶CFU/mL的孢子悬浮液100μL接种于查氏(含kan)培养基中。每个菌株设置3个生物学重复实验，26℃摇床中200r/min振荡培养，期间每隔24h吸取1mL菌液，连续7d用血球计数板测量孢子浓度并记录数据。

结果显示，在接种第7d时ΔVdILV2B突变体产孢量均显著低于野生型菌株V592；所有互补菌株的产孢量几乎都恢复至野生型菌菌株的水平(图 4)。

实施例6

为了明确VdILV2B基因敲除对大丽轮枝菌致病力的影响，以野生型菌株 V592为对照，测定了VdILV2B基因敲除突变体对棉花的致病力。致病性测定方法如下：

把上述构建的敲除突变体、互补菌株和V592接种到Czapek-Dox液体培养基中26℃，200r/min摇培5d。棉苗第5片真叶长出后，通过使用根浸接种方法，每盆棉花接种200mL浓度为1.0×10⁷CFU/mL的菌液，每个菌株重复3个水培盒(共36株棉苗)。接种后每天都观察，从发病开始数病指，每隔3d数一次一般记录到发病后一个月，病害分级标准为：0级：不发病； 1级：1～2片子叶发病；2级：1片真叶发病；3级：2片真叶发病；4级：3 片及3片以上真叶发病。病情指数按照式II计算。

病情指数＝[Σ各级病株数×级数/(总株数×最高病级)]×100 式II

病情指数为3次生物学实验重复平均值。

第30天剖秆，用体式显微镜拍照维管束(Olympus SZX7,Japan)。

结果显示，敲除突变体ΔVdILV2B-1和ΔVdILV2B-2所致病害的病情指数分别为57.0和55.0；互补菌株的致病力明显恢复至野生型菌株的水平，病情指数高于90。接种30d时，对感病植株进行剖杆观察，敲除突变体ΔVdILV2B-1 和ΔVdILV2B-2维管束变褐程度明显减弱(图5)。

实施例7

为了明确VdILV2B基因对大丽轮枝菌侵染及定殖能力的影响，对接种了野生型菌株V592、VdILV2B基因敲除突变体和互补菌株的棉株，通过qPCR 进行真菌生物量测定。接种3种不同菌株后26d，取棉花的根(红茎线以下取根5cm)、茎(棉苗一半株高处取茎5cm)、叶，分别提取根、茎、叶的总DNA。qPCR所用引物[转录间隔区(Internaltranscribed spacer，ITS)-F (5'-TGTTGCTTCGGCGGCTCGTT-3'，SEQ ID NO:6)和ITS-R (5'-GCGTTTCGCTGCGTTCTTCA-3'，SEQ ID NO:7)]是基于大丽轮枝菌核糖体RNA(Z29511)的ITS1和ITS2区设计的。以组成型表达的β-tubulin 基因(DQ266153)作为内参基因(内参基因:β-tubulin-F：TCACCAGCCGTG GCAAGGTTG，SEQ ID NO:8；β-tubulin-R:AGCAAAGGGCGGTCTGGACGTTG，SEQ ID NO:9)，对每个样品的总DNA进行标准化定量。每个反应设3个重复。

采用RT-qPCR检测定殖棉花不同组织中VdILV2B的表达情况，采用试剂盒法提取棉花不同组织的RNA，反转录得到的cDNA为模板进行RT-qPCR 检测，设计的引物序列如下：

VdILV2B-qPCR-F：ATGGTGGCCATGTCCATGGC(SEQ ID NO:2)；

VdILV2B-qPCR-R：GAAAACAAAGACTGGGGCTCGG(SEQ ID NO:3)；

β-tubulin-F：TCACCAGCCGTGGCAAGGTTG(SEQ ID NO:4)；

β-tubulin-R：AGCAAAGGGCGGTCTGGACGTTG(SEQ ID NO:5)；

大丽轮枝菌β-tubulin(DQ266153)是内参基因。

反应体系(10μL)：

PowerUpTMSYBRTMGreenMasterMix(2×)5μL

正向引物 0.2μL

反向引物 0.2μL

DNA模板 4.6μL。

RT-qPCR检测的反应程序如下：50℃2min；95℃2min；953s，60℃30s，共40个循环。结果的数据用7500 Fast Real-Time PCR System进行分析，以 2^-ΔΔCt的方法计算。

结果表明，ΔVdILV2B突变体在茎组织中的生物量均显著低于V592菌株和2个互补体菌株(图6)。以上结果表明，VdILV2B基因敲除使大丽轮枝菌在棉花茎中的定殖受到一定阻碍；该结果与ΔVdILV2B突变体在棉苗上引起的病情指数和维管束褐变程度一致。

实施例8

为了确定亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型对ΔVdILV2B、互补菌株和野生型菌株V592的菌丝生长的影响，在FGA固体培养基中添加不同浓度(1mM、5mM)的外源氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)，进一步阐明亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸营养缺陷型对菌丝生长的影响，三种菌株在 FGA固体培养基上的接种位置如图7A所示。

AHAS催化亚基基因ΔVdILV2B在FGA培养基上正常生长，为明确 AHAS催化亚基基因在支链氨基酸合成途径中起的作用，发现5mM Leu对 V592和ΔVdILV2B敲除突变体以及互补体ECVdILV2B均有反馈抑制作用， V592相较于敲除体与互补体反馈抑制作用最强，而异亮氨酸和缬氨酸并未产生相同结果(图7B)。

采用RT-qPCR法检测野生型菌株V592中VdILV2B基因的表达量，检测方法见实施例5记载。结果表明，5mM Leu抑制了VdILV2B基因的表达， VdILV2B参与了Leu的生物合成途径(图8)。

采用RT-qPCR法检测ΔVdILV2B基因敲除突变体中AHAS合成途径下游基因的相对表达量。

结果所显示的Ct值(Threshold cycle)定义为达到超出荧光信号的检测阈值时所需要的循环数，结果的数据用7500 Fast Real-Time PCR System进行分析，以2^-ΔΔCt的方法计算。

所用引物序列如下：

表1 AHAS合成途径下游基因的RT-qPCR检测结果

RT-qPCR检测的反应条件和反应程序同上。

结果见图9。通过RT-qPCR分别对ΔVdILV2B敲除突变体下游基因的转录表达进行测定，结果显示，下游基因的相对表达量表现显著下调，其中异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸合成都必需的二羟酸脱水酶的2个基因(VDAG-03858和VDAG-04620)、支链氨基酸转氨酶的1个基因 (VDAG-02852)和亮氨酸合成必需的2-异丙基苹果酸合成酶的1个基因 (VDAG_03299)、3-异丙基苹果酸脱水酶的1个基因(VDAG_00564)、 3-异丙基苹果酸脱氢酶的1个基因(VDAG-06467)(见图9)。上述结果表明，AHAS单个亚基基因的敲除对支链氨基酸合成途径大多数下游基因的表达都有影响。再次证实了VdILV2B参与了支链氨基酸生物合成途径。

实施例9

AHAS抑制剂处理实验

选择了2种不同化学类型的除草剂，分别为苯磺隆(磺酰脲类除草剂) 和双草醚(嘧啶水杨酸类除草剂)，分别配制浓度为12.8～1638.4mg/L的药液，分别接种至野生型菌株V592的菌落上，观察药剂对菌株生长的影响。

观察菌落形态发现，在1638.4mg/L作用下苯磺隆和双草醚明显抑制了大丽轮枝菌的生长，V592不产生微菌核(图10A)。

选择了3种浓度(409.6mg/L、819.2mg/L和1638.4mg/L)的苯磺隆和双草醚分别处理V592，测定VdILV2B基因的相对表达量，测定方法同实施例 5记载。

结果表明，VdILV2B基因的相对表达量呈下调趋势，且浓度越高下调越显著(图10B)。这些结果表明，苯磺隆和双草醚都能抑制VdILV2B基因的表达。再次证明，VdILV2B是支链氨基酸合成的必需基因。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 石河子大学

<120> 大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2B的应用

<160> 27

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1653

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggtgaaag gccagcgcga gaaaaagggc cggttcccgc gtatgattac ctgtcccaat 60

gagatggtgg ccatgtccat ggccgacggc tacgccaggc tgacgggcaa acctcaatgt 120

gttattgtcc acgttgatgt cggaacccag ggcctcggcg ctgctgtaca caactcttcc 180

acgggccgag ccccagtctt tgttttcgcc ggtctctctc catttacctt ggagggcgag 240

ctccgaggca gtcggaccga gtatatccat tggatccagg atgtgcccga tcagaagcag 300

attctcgcgc agtactgtcg ctactcgggc gaagtcaaga ctggcactaa tgtgaaacaa 360

atggtgaacc gcgctctgca attctccaag tcggaccctc aggggccagt ctatctctgc 420

ggcgccaggg aagtcatgga ggctgaaatt gagccatatt ccatcccgca ggaagaatgg 480

gatccagttg agctcggcgg cctgccgtca aaggccgtgg acaagattgc cgaagcgctg 540

gccggcgcca aggaaccgct aatcatcact ggctacggcg gcagggatca caagttcccc 600

agcgcactgg ttgagctggc caatgcagtc aagggtctgc gagttctgga cactggcgga 660

agcgacatgt gtttccctgc agaccatccc gcatggctcg gcctcaggtt tggatccgac 720

gaggcaatca agacggccga tgtcatactt gtcctgaact gcgacgtgcc ctgggtcaac 780

acgctgtgtc acccgcgcca agatgcgagg gttttccacg ttgacgttga tccgttgaaa 840

cagcaaatgc ctgttttcta catcaaggcc gagtcgaggt accgcgcaga cagcctggcc 900

gccgttggtc agatcacaga tcagctcaag tcagacaaat tggcgtcttt gctcaacacc 960

aaggaagccg agacccgtgg catgcagttg cagcaatctt acgagcgacg gctagccacg 1020

attcaggcaa agacgaagcc ctcggaagat ggagagtttg gcactggtca cctctgccga 1080

gagctacgcc gtctctgccc tgacgacacc atttgggcga tcgaagcggt gaccaacact 1140

ggctttgtgc atgacaacat tcagccagta caccctgggt cgtggatcaa ctgtggtggc 1200

ggcggtctag gatggtctgg cggaggagcg ctgggcatta aactggcgag tgacgctgag 1260

aatggcggca agggcaagtt tgtggtccag attgtgggcg acggtacctt cttgttctcg 1320

gtcccaggaa gcgtctactg gattgcgaag cggtacaaca ttccaatctt gaccatcgtc 1380

ttgaacaaca aaggttggaa cgcaccacgg cggtcgcttc tgctcgttca tcccgacggc 1440

gctggcgcta aggcatcgaa tgaggagatc aacatttcct ttgacccatc gcctgactat 1500

gcaggcattg ccaaggcagc ggcgggtggt gacctgatgg ctgcgagggt gggccatgtg 1560

gaggaactcg agggcatgtt gaagaaggcg attcagacag tccagggagg acaatcggct 1620

gttctcgacg ttaaggttac gagtggctgt tga 1653

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggtggcca tgtccatggc 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaacaaag actggggctc gg 22

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccagccg tggcaaggtt g 21

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agcaaagggc ggtctggacg ttg 23

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgttgcttcg gcggctcgtt 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcgtttcgct gcgttcttca 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaccagccg tggcaaggtt g 21

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcaaagggc ggtctggacg ttg 23

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agagctcgag gccctcatct c 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ctcctccgtc gtcagtccg 19

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

atgctttcga ggtcatttgg catg 24

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gacgagaatt tgttcagcgt ctcg 24

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

atggcagacc aacatcaaca gg 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cttgcgcagg aatagcgaga ag 22

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cgagagggca tgatttcccc g 21

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gcagggattg ccctcccac 19

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaccccatca agaagtacaa gccc 24

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggcagacttt ggttaccatc gc 22

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagtcccagt tcccaagacc 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gtcagtggtc gcaagagtgc aatc 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

attgactggg ccaatgtcgg 20

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gtggatgcgc ataaagggc 19

<210> 24

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

atgtctgaca caaagacgtt tcgc 24

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

cgccgacaat gtctgtggtg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

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<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

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