一种(r)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法
阅读说明：本技术 一种(r)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法 (Synthesis and purification method of (R) -3-aminobutyric acid ) 是由 王昭凯 胡凡 杨隆河 于 2021-08-02 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种(R)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法。本发明首先提供一种新的氨基转移酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示,该酶在不需要添加铵盐的情况下,即可有效催化巴豆酸合成(R)-3-氨基丁酸；本发明还提供一种高密度发酵方法,能使表达该氨基转移酶的工程菌在短时间内实现高密度生长,并且实现氨基转移酶的高效表达；本发明还提供一种(R)-3-氨基丁酸的分离和纯化方法,无需复杂的不同级别的膜处理设备,即可简单高效地获得纯度高于99％的(R)-3-氨基丁酸。(The invention relates to a method for synthesizing and purifying (R) -3-aminobutyric acid. The invention firstly provides a novel aminotransferase, the amino acid sequence of which is shown as SEQ ID NO: 2, the enzyme can effectively catalyze crotonic acid to synthesize (R) -3-aminobutyric acid without adding ammonium salt; the invention also provides a high-density fermentation method, which can realize high-density growth of engineering bacteria expressing the aminotransferase in a short time and realize high-efficiency expression of the aminotransferase; the invention also provides a method for separating and purifying the (R) -3-aminobutyric acid, which can simply and efficiently obtain the (R) -3-aminobutyric acid with the purity higher than 99% without complex membrane treatment equipment with different levels.)
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种(R)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法。
背景技术
(R)-3-氨基丁酸(R-3-aminobutyric acid)，CAS：3775-73-3，是一种人类免疫缺陷病毒类型I(HIV-1)整合酶抑制药度鲁特韦(Dolutegravir)合成的关键中间体。目前(R)-3-氨基丁酸的制备方法主要有化学合成法和酶催化法。化学合成包括如：利用乙酰乙酸乙酯为原料，与乙酰胺缩合，经不对称氢化，经水解得到(R)-3-氨基丁酸的方法。最几年来，随着市场对(R)-3-氨基丁酸的需求越来越大，出于降低成本，减少污染的要求，利用酶法催化生产(R)-3-氨基丁酸的报道逐渐增多。
酶催化主要利用天冬氨酸酶对巴豆酸进行转化，生成(R)-3-氨基丁酸。专利文献WO2019062222A1公开了利用一种来自大肠杆菌、具有立体异构催化活性的天冬氨酸酶，将丁烯酸转化为(R)-3-氨基丁酸。专利文献CN112725322A公开了，通过理性设计对枯草芽孢杆菌来源的天冬氨酸酶进行分子改造，提高了该酶的催化活力，并利用改造后的酶以巴豆酸为底物催化生产(R)-3-氨基丁酸。专利文献CN108374027A公开了，以巴豆酸、铵盐为底物，加入含有镁离子的盐，用氨水调节pH，然后加入来源于芽孢杆菌的重组天冬氨酸酶作为生物酶催化剂，在适宜温度和碱性条件下反应，反应后经分离、纯化、结晶，获得(R)-3-氨基丁酸。中国专利文献CN112779236A公开了，一种反式丁烯酸转氨酶工程菌及其高密度发酵方法，还公开了利用该酶生产(R)-3-氨基丁酸的方法，步骤包括转化、离心收集上清，超滤纳滤，脱色、结晶、重结晶等。
现有技术中，利用酶法催化制备(R)-3-氨基丁酸普遍存在两个问题：1)酶催化方法制备(R)-3-氨基丁酸，通常需要添加铵盐来提高转化率，铵盐的添加会增加后期(R)-3-氨基丁酸的制备提纯复杂性；2)提纯(R)-3-氨基丁酸多采用微滤、超滤、纳滤等膜处理的方法来对催化反应体系进行预处理，但是膜处理生物转化反应液极易造成堵塞及膜污染的现象，影响效率。
发明内容
为了解决现有技术中存在的上述问题，本发明的主要目的在于提供一种(R)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法。本发明首先提供一种新的氨基转移酶，在不需要添加铵盐的情况下，即可有效催化巴豆酸合成(R)-3-氨基丁酸；本发明提供一种高密度发酵方法，利用本发明方法能使表达该氨基转移酶的工程菌在短时间内实现高密度生长，并且实现氨基转移酶的高效表达；本发明还提供一种(R)-3-氨基丁酸的分离和纯化方法，无需复杂的不同级别的膜处理设备，即可简单高效地获得纯度高于99％的(R)-3-氨基丁酸。
为此，第一方面，本发明提供一种氨基转移酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明的第二方面，提供一种核酸，其编码本发明所述的氨基转移酶。
进一步，所述核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的第三方面，提供一种载体，其包含本发明所述的核酸。
进一步，所述载体可选自下组中的一种：质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒。
在一些实施方式中，在所述载体中，所述核酸的表达受到转录调控，在缺少相应诱导剂的情况下，所述核酸的表达被阻遏；在存在所述诱导剂的情况下，所述核酸能够表达。
本发明的第四方面，提供一种宿主细胞，其表达本发明所述的氨基转移酶，和/或含有本发明所述的核酸，和/或含有本发明所述的载体。
进一步，所述宿主细胞为原核细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
在某实施方式中，所述宿主细胞为氨基转移酶工程菌，所述工程菌为含有本发明所述的载体的E.coli BL21(DE3)；优选地，所述载体为含有本发明所述核酸的质粒pET30a；优选地，所述核酸的序列如SEQ ID NO：3所示。
本发明的第五方面，提供本发明所述的氨基转移酶，和/或本发明所述的核酸，和/或本发明所述的载体，和/或本发明所述的宿主细胞在制备(R)-3-氨基丁酸中的应用。
本发明的第六方面，提供一种(R)-3-氨基丁酸的制备方法，包括：以巴豆酸为底物，以表达有本发明所述的氨基转移酶的宿主细胞作为催化剂，合成(R)-3-氨基丁酸。
进一步，所述表达有本发明所述的氨基转移酶的宿主细胞的制备方法包括：在适于表达本发明所述的氨基转移酶的条件下，培养本发明所述的宿主细胞。
进一步，所述培养本发明所述的宿主细胞包括：对本发明所述的宿主细胞进行发酵。发酵的方法例如：连续补料发酵、分批发酵、连续补料分批发酵等。
在一些实施方式中，所述核酸的表达受到转录调控，在缺少相应诱导剂的情况下，所述核酸的表达被阻遏；在存在所述诱导剂的情况下，所述核酸能够表达；所述发酵包括：
S1：将本发明所述的宿主细胞接种于液体培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；
所述宿主细胞优选为大肠杆菌；所述液体培养基优选为TB肉汤液体培养基；所述培养温度优选为30-37℃，更优选为37℃；
S2：取步骤S1所得菌液，按接种量5％-10％转接于发酵培养基中，培养过程中流加补料培养基，培养至对数生长中后期；
优选地，所述发酵培养基的组分包括：蛋白胨20-30g/L，酵母粉20-30g/L，甘油40-50g/L，Na2HPO4 15-20g/L，KH2PO4 5-10g/L，无水硫酸镁0.5-1g/L，NaCl 8-12g/L)；
优选地，所述补料培养基的组分包括：甘油40-60％(v/v)，蛋白胨30-50g/L,酵母粉30-50g/L；优选地，所述培养温度优选为30-37℃，更优选为37℃；优选地，pH用氨水自动流加，维持在6.5-7.5，溶氧控制在20％-30％；优选地，步骤S2的培养时间为6-8h；
S3：向步骤S2获得的培养液中加入所述诱导剂进行诱导表达；
优选地，所述诱导剂为IPGT；优选地，所述诱导表达的时长为6-8h；所述诱导表达的温度为28-30℃，优选为28℃。
在一些实施方式中，所述宿主细胞为氨基转移酶工程菌，所述工程菌为含有本发明所述的载体的E.coli BL21(DE3)；所述载体为含有本发明所述核酸的质粒pET30a；所述核酸的序列如SEQ ID NO：3所示；所述发酵包括：
S1：将本发明所述的宿主细胞接种于液体培养基中，培养至对数生长期，获得菌液；所述液体培养基优选为TB肉汤液体培养基；所述培养温度优选为30-37℃；
S2：取步骤S1所得菌液，按接种量5％-10％转接于发酵培养基中，培养过程中流加补料培养基，培养至对数生长中后期；
优选地，所述发酵培养基的组分包括：蛋白胨20-30g/L，酵母粉20-30g/L，甘油40-50g/L，Na2HPO4 15-20g/L，KH2PO4 5-10g/L，无水硫酸镁0.5-1g/L，NaCl 8-12g/L)；
优选地，所述补料培养基的组分包括：甘油40-60％(v/v)，蛋白胨30-50g/L,酵母粉30-50g/L；优选地，所述培养温度优选为30-37℃，更优选为37℃；优选地，pH用氨水自动流加，维持在6.5-7.5，溶氧控制在20％-30％；优选地，步骤S2的培养时间为6-8h；
S3：向步骤S2获得的培养液中加入IPGT进行诱导表达；
优选地，所述诱导表达的时长为6-8h；所述诱导表达的温度为28-30℃，优选为28℃。
进一步，所述合成(R)-3-氨基丁酸的反应体系包括：10-50％(w/v)巴豆酸，5-20％(w/v，菌体湿重)表达有本发明所述的氨基转移酶的宿主细胞，pH为8.0-9.5。优选地，所述反应体系的其他成分为水。
进一步，所述合成(R)-3-氨基丁酸的反应温度为40-50℃。
进一步，所述合成(R)-3-氨基丁酸的反应时间为6-9h。
进一步，所述合成(R)-3-氨基丁酸的反应之后，还包括以下步骤：纯化；所述纯化包括：收集所述合成(R)-3-氨基丁酸得到的反应液，离心取上清液，调节所述上清液的pH至4.0-5.0，进行第一热处理，离心得到第一滤清液；向第一滤清液中加入活性炭，进行第二热处理，离心得到第二滤清液；将第二滤清液浓缩至稀糊状后加入预冷的95％乙醇，然后抽滤得(R)-3-氨基丁酸晶体；将所得(R)-3-氨基丁酸晶体用预冷的95％乙醇进行洗涤，烘干得(R)-3-氨基丁酸纯品。
进一步，所述第一热处理的条件包括：65-75℃处理20-40min。
进一步，所述活性炭的用量为1-5％(w/v)，例如1％、2％、3％、4％、5％等。
进一步，所述第二热处理的条件包括：65-75℃处理1-2h。
进一步，所述浓缩为真空减压浓缩。
与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明提供了一种新的氨基转移酶，在不需要添加氨基盐的情况下，即可有效催化巴豆酸合成(R)-3-氨基丁酸；
(2)本发明提供一种氨基转移酶工程菌的高密度发酵方法，利用本发明方法能使工程菌在短时间内实现高密度生长，并且实现氨基转移酶的高效表达；
(3)本发明还提供一种(R)-3-氨基丁酸的分离和纯化方法，无需复杂的不同级别的膜处理设备，即可简单高效地获得纯度高于99％的(R)-3-氨基丁酸。
附图说明
通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。在附图中：
图1本发明提供的(R)-3-氨基丁酸的合成与纯化流程图；
图2为氨基转氨酶工程菌高密度发酵曲线图；
图3为氨基转移酶表达产物的SDS-PAGE检测结果；
其中，M表示蛋白质marker，数字0-7分别表示IPTG诱导时长(h)；
图4为(R)-3-氨基丁酸生物合成过程的监测图；
图5为(R)-3-氨基丁酸纯化过程对比图；
其中，a为生物催化反应液；b为反应液离心后的上清；c为调节pH及热处理后上清；d为活性炭处理60min后上清；e为活性炭处理120min后上清；
图6为纯化得到的(R)-3-氨基丁酸的HPLC检测图谱；
其中，a为根据本发明提供的方法获得的(R)-3-氨基丁酸，b为(R)-3-氨基丁酸标准样品；c为(S)-3-氨基丁酸标准样品；
图7为根据本发明提供的方法获得的(R)-3-氨基丁酸的LC-MS检测图谱。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本公开的示例性实施方式。虽然附图中显示了本公开的示例性实施方式，然而应当理解，可以以各种形式实现本公开而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了能够更透彻地理解本公开，并且能够将本公开的范围完整的传达给本领域的技术人员。
除非另外指明，本文的实施例采用本领域常规的分子生物学、微生物学及生物化学技术。
除非另外指明，本文所使用的的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。
术语“载体”是指可以接收核苷酸插入或者克隆的多核苷酸分子，例如质粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或逆转录病毒等。优选地，载体含有一个或多个限制性内切酶位点，并且可以在宿主细胞中自主复制，或者可以整合在宿主细胞的基因组内，使得插入或者克隆的序列是可复制的。载体的选择通常取决于载体与要导入载体的宿主细胞的相容性。
术语“宿主细胞”指已经被引入了外源核酸的细胞，包括这样的细胞的后代。宿主细胞包括引入了外源核酸的原代细胞和来源于其的后代，不考虑传代的数目。后代在核酸含量方面可以不必与亲本细胞完全相同，而是可能包含突变，具有相同功能或生物学活性的突变体后代被包括在本文中。一般来讲，宿主细胞是适合接受和/或产生异源核酸或蛋白质的任何细胞，而不论所述细胞被指定归属哪个生命界。在一些实施例中，宿主细胞包括原核或真核细胞。示例性的宿主细胞包括大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌、分枝杆菌、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母等。
术语“工程菌”是指用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株。所述的菌类细胞株可称为受体菌。在一些实施例中，所述受体菌可以是大肠杆菌E.coliBL21(DE3)，所述外源基因是表达本发明所述的氨基转移酶的基因，例如可以是如SEQ IDNO：3所示的基因。制备工程菌的方法在本领域技术人员的技术范围内，在一些实施例中，所述工程菌的制备方法包括将如SEQ ID NO：3所示的基因克隆至质粒pET30a中，再将其转入E.coli BL21(DE3)中，以获得所述工程菌。
术语“生物催化剂”，指具有催化作用的细胞或者细胞材料。术语“生物催化剂”可以包括全细胞或破裂细胞或其部分形式的细胞材料，包括半纯化和纯化的酶制剂，并且任选地包括发酵液。在本发明的一些实施方式中，所述生物催化剂优选为“全细胞催化剂”，即全细胞形式的生物催化剂。
术语“连续发酵”、“连续流加发酵”、“连续补料发酵”具有相同含义，指以一定速度向发酵罐内添加新鲜培养基，同时以相同速度流出培养基，从而使发酵罐内的液量维持恒定的发酵方法。
术语“分批发酵”，指在发酵过程中，除了进行通气(好氧发酵)和为调节pH而加入的酸碱溶液外，与外界没有其他物料交换。
术语“连续补料分批发酵”、“分批补料发酵”，指在发酵过程中，以某种方式向发酵系统中补加一定物料，但并不连续地向外排出发酵液的发酵方法，使发酵液的体积随时间增加而增加。
实施例1氨基转移酶基因与基因工程细胞的获取
通过基因预测和数据库对比，从海洋样品的宏基因组中获得了一个编码氨基转移酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。根据大肠杆菌的密码子偏爱性对该基因进行优化，得到密码子优化后的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示。委托合成SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列并将该氨基转移酶基因克隆至pET30表达载体NdeI和XhoI之间，获得表达氨基转移酶的质粒，将其命名为pET30-AT质粒，将该质粒转化至BL21(DE3)细胞，获得氨基转移酶基因阳性的基因工程菌BL21(DE3)[pET30-AT]。
实施例2氨基转移酶工程菌的高密度发酵培养
1)氨基转移酶工程菌的种子液的培养
取实施例1制备得到的基因工程菌BL21(DE3)[pET30-AT]，将其接种于培养皿平板上活化菌种，培养时间14h；从平板上挑取单菌落接种至LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L)，在37℃、180rpm的恒温摇床中培养16h得到发酵的种子培养液。
2)氨基转移酶工程菌的高密度发酵培养
采用5L发酵罐进行氨基转移酶高密度细胞发酵，装液量为2.5L。将步骤1)培养得到的种子液按10％的接种量接入到发酵培养基中(蛋白胨30g/L，酵母粉30g/L，甘油50g/L，Na2HPO4 16.4g/L，KH2PO4 8g/L，无水硫酸镁0.6g/L，NaCl 10g/L)，温度控制在37℃，转速，通气联动保持溶氧控制在25％，自动流加氨水保持pH值控制在6.5-7.5。发酵约8h后，当OD600为25时，开始流加补料培养基(甘油50％(v/v)，蛋白胨40g/L，酵母粉40g/L)，流加速率为40mL/h；当培养约12h，OD600为45时，调节培养温度至28℃，加入0.5mM IPTG进行诱导，共诱导7h(每隔1h进行取样，用于后续蛋白表达量分析)；约18h的发酵结束后，菌体OD600最后为72.6，所得菌体湿重为3.5g/OD600/L。菌体发酵时间与OD600之间的关系如图2所示，诱导时间与蛋白表达量的关系如图3所示。根据图3，随着诱导表达的进行，氨基转移酶的表达量显著提升。
实施例3(R)-3-氨基丁酸的全细胞催化合成
当实施例2的高密度发酵结束后，离心收集菌体作为全细胞催化剂。配制生物转化反应液：向水中加入实施例2发酵后获得的菌体，添加量为按照菌体湿重50g/L，加入200g/L巴豆酸，用氨水调节pH至9.0，水定容至1000ml。在45℃条件下进行生物转化反应。中间过程间隔取样检测底物与产物的反应情况，9h后，底物完全转化完毕，上清液中(R)-3-氨基丁酸浓度为227g/L，转化率为95％。转化过程的监测图如图4所示。
实施例4(R)-3-氨基丁酸生物转化液的分离提纯
实施例3的生物转化反应结束后离心取上清液，调节上清液的pH至4.0，70℃处理30min，离心除去蛋白及其他杂质，得到第一滤清液；向第一滤清液中按照1％加入活性炭，70℃处理1.5h，离心除去色素及其他杂质，得第二滤清液；将第二滤清液利用真空减压浓缩至稀糊状后加入3倍体积预冷的95％乙醇，然后抽滤得(R)-3-氨基丁酸晶体；将所得(R)-3-氨基丁酸晶体用3倍体积预冷的95％乙醇洗涤3次，烘干得(R)-3-氨基丁酸纯品185g/L，回收率81.5％。
根据本发明提供的分离提纯方法，经过除杂和脱色后，(R)-3-氨基丁酸溶液表现出较好的色泽度，图5为纯化各个阶段的(R)-3-氨基丁酸溶液的对比图。图6和图7分别为(R)-3-氨基丁酸的构型鉴定HPLC图和LC-MS图，从结果可以看出，利用本方法合成与提纯的(R)-3-氨基丁酸为R构型，同时具有不低于99％的纯度。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
序列表
<110> 自然资源部第三海洋研究所
<120> 一种(R)-3-氨基丁酸的合成与纯化方法
<160> 3
<170> PatentIn Version 3.5
<210> 1
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtccacac agcgtattga aaaagacttt ttgggagaac gagttttgcc tgctgaagct 60
tattatggta tacaaacctt gagggctacc gaaaattttc ctataaccgg ttataccata 120
cacccagcct tgataaaagc catgggtatt gttaaaaaag cagccgcctt aggaaacatg 180
gaagttcatt tattgtctaa ggaaattggt gaagctattg ttgaggccgc tcaagaagtg 240
atcgatggta aatgggacgc tgaattttta gttgacccca ttcaaggtgg tgccggaact 300
tctataaaca tgaacgctaa tgaagtaatt gctaataggg cattagaaat cttaggaaaa 360
gaaaaaggtg attatcaaag tatttcaccc aactcacatg ttaatatgag tcagagtacc 420
aacgacgcat tccctactgc aattcatatt gcagttttgc acttagtaga tgaacttttg 480
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atcaaaatgg gccgaactca tcttcaggat gctgttccaa tacgattagg acaagaattt 600
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ctttatgatg ttaacatggg agctacagct gtaggaacag gattgaatgc ttttccagac 720
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actcatttag ttgatgctac ccaaaacact gatgcttaca cagaagtatc tggagctctt 840
aaaatttgta tgattaatat gtctaaaatt gctaatgatt tgagattgat ggcttcaggt 900
cctcgagctg gcttggccga gatagtactt cctgctagac agcctggttc ttctataatg 960
cctggtaagg taaatccagt tatgcccgaa gttcttaatc aagttgcttt tcaagtcatt 1020
ggaaatgatc atacaatctc tttggctagt gaggcaggcc agttggagtt gaatgttatg 1080
gagcctgttc ttgtctttaa tttgatacaa tctatctcca ttatgaataa tgtattccgt 1140
gcttttaccg aaaattgctt aaaagatatt gaagctaatg aggaacgtat gaaagaatat 1200
gttgaaaaaa gtgttggtgt tttgacagcc gttaatcctc atattggtta cgaaattgct 1260
gcacgtttag ctcgagaagc aattctttcc ggccgttcta ttcgagagtt atgtgtagag 1320
gctggtgttt taactgctga acagttggac cttattttag acccttatga aatgactcat 1380
cctggtattg caggatcctc catcttaaag catcgttaa 1419
<210> 2
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ser Thr Gln Arg Ile Glu Lys Asp Phe Leu Gly Glu Arg Val Leu
1 5 10 15
Pro Ala Glu Ala Tyr Tyr Gly Ile Gln Thr Leu Arg Ala Thr Glu Asn
20 25 30
Phe Pro Ile Thr Gly Tyr Thr Ile His Pro Ala Leu Ile Lys Ala Met
35 40 45
Gly Ile Val Lys Lys Ala Ala Ala Leu Gly Asn Met Glu Val His Leu
50 55 60
Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Ile Val Glu Ala Ala Gln Glu Val
65 70 75 80
Ile Asp Gly Lys Trp Asp Ala Glu Phe Leu Val Asp Pro Ile Gln Gly
85 90 95
Gly Ala Gly Thr Ser Ile Asn Met Asn Ala Asn Glu Val Ile Ala Asn
100 105 110
Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gly Lys Glu Lys Gly Asp Tyr Gln Ser Ile
115 120 125
Ser Pro Asn Ser His Val Asn Met Ser Gln Ser Thr Asn Asp Ala Phe
130 135 140
Pro Thr Ala Ile His Ile Ala Val Leu His Leu Val Asp Glu Leu Leu
145 150 155 160
Val Thr Met Glu Asp Met Gln Ala Val Phe His Gln Lys Ala Glu Gln
165 170 175
Phe Ala His Val Ile Lys Met Gly Arg Thr His Leu Gln Asp Ala Val
180 185 190
Pro Ile Arg Leu Gly Gln Glu Phe Glu Ala Tyr Cys Arg Val Ile Asn
195 200 205
Arg Asp Ile Val Arg Ile Arg Gln Thr Arg Pro Asn Leu Tyr Asp Val
210 215 220
Asn Met Gly Ala Thr Ala Val Gly Thr Gly Leu Asn Ala Phe Pro Asp
225 230 235 240
Tyr Ile Lys Thr Val Asp Glu His Leu Ala Glu Ile Ser Gly Phe Pro
245 250 255
Leu Lys Gly Ala Thr His Leu Val Asp Ala Thr Gln Asn Thr Asp Ala
260 265 270
Tyr Thr Glu Val Ser Gly Ala Leu Lys Ile Cys Met Ile Asn Met Ser
275 280 285
Lys Ile Ala Asn Asp Leu Arg Leu Met Ala Ser Gly Pro Arg Ala Gly
290 295 300
Leu Ala Glu Ile Val Leu Pro Ala Arg Gln Pro Gly Ser Ser Ile Met
305 310 315 320
Pro Gly Lys Val Asn Pro Val Met Pro Glu Val Leu Asn Gln Val Ala
325 330 335
Phe Gln Val Ile Gly Asn Asp His Thr Ile Ser Leu Ala Ser Glu Ala
340 345 350
Gly Gln Leu Glu Leu Asn Val Met Glu Pro Val Leu Val Phe Asn Leu
355 360 365
Ile Gln Ser Ile Ser Ile Met Asn Asn Val Phe Arg Ala Phe Thr Glu
370 375 380
Asn Cys Leu Lys Asp Ile Glu Ala Asn Glu Glu Arg Met Lys Glu Tyr
385 390 395 400
Val Glu Lys Ser Val Gly Val Leu Thr Ala Val Asn Pro His Ile Gly
405 410 415
Tyr Glu Ile Ala Ala Arg Leu Ala Arg Glu Ala Ile Leu Ser Gly Arg
420 425 430
Ser Ile Arg Glu Leu Cys Val Glu Ala Gly Val Leu Thr Ala Glu Gln
435 440 445
Leu Asp Leu Ile Leu Asp Pro Tyr Glu Met Thr His Pro Gly Ile Ala
450 455 460
Gly Ser Ser Ile Leu Lys His Arg
465 470
<210> 3
<211> 1419
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtctactc aacgcatcga aaaagacttc ctgggcgagc gtgttctgcc agctgaagcg 60
tactacggta tccagaccct gcgcgccacg gaaaacttcc cgatcaccgg ttacaccatt 120
cacccggcgc tgattaaagc aatgggtatt gtgaagaaag cggcggcgct gggcaacatg 180
gaagtgcacc tgctgtctaa agaaatcggc gaggcgatcg tggaggcggc ccaggaagtg 240
atcgacggta aatgggacgc tgaattcctg gttgacccga ttcagggtgg tgccggcact 300
tctatcaaca tgaacgctaa tgaagtgatt gccaaccgtg ctctggaaat tctgggtaaa 360
gaaaaaggtg actaccagag catcagcccg aactcccatg ttaacatgtc tcagagcacc 420
aacgatgcgt ttccgactgc gattcacatc gctgttctgc acctggttga tgaactgctg 480
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atcaaaatgg gtcgcaccca cctgcaggac gcggttccga ttcgcctggg ccaggaattt 600
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tacatcaaaa ctgttgatga acatctggct gaaatctctg gcttcccgct gaagggtgct 780
acgcacctgg ttgatgccac gcagaacacc gacgcttata ccgaggtgtc tggcgctctg 840
aaaatttgca tgatcaacat gtccaaaatc gctaacgatc tgcgtctgat ggcgtccggt 900
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ggcaacgacc acacgatctc cctggcatcc gaggcaggtc agctggagct gaatgttatg 1080
gaaccggtgc tggttttcaa cctgattcag agcatcagca tcatgaacaa cgtgttccgt 1140
gcatttactg aaaattgcct gaaagatatt gaagctaacg aagagcgcat gaaagaatac 1200
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