具体实施方式

如本文所用，术语“活性多肽”、“本发明的多肽及其衍生多肽”、“本发明的酶”、“本发明的LrUGT2”，均指LrUGT2(SEQ ID NO:1)多肽及其衍生多肽。

如本文所用，“分离的多肽”是指所述多肽基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化所述多肽。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。所述多肽的纯度还可以用氨基酸序列进行进一步分析。

本发明的活性多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。

本发明还包括所述多肽的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持所述多肽相同的生物学功能或活性的多肽。

本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR) 以确定和/或分离编码LrUGT2蛋白的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。

术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含LrUGT2多肽以及编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的 lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、 HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到 300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA 转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

设备、材料与试剂

PCR使用Mastercycler pro(Eppendorf)。

恒温培养使用SGSP-03 300*35恒温培养箱(黄石恒丰医疗器械有限公司)和ZQZY-75AN全温震荡培养箱(天津博鑫生物科技有限公司)。

离心使用5418R高速冷冻式离心机和5418小型离心机(Eppendorf)。

OD600使用UV-1800紫外可见分光光度计检测(岛津)。

高效液相色谱使用LC-20AD液相色谱系统(岛津)。

液相色谱-质谱联用由Agilent 1200HPLC液相色谱系统串联 Bruker-MicroTOF-II质谱仪测得。

超声细胞破碎使用Scientz-IID细胞粉碎机(宁波新芝生物技术有限公司)

寡核苷酸引物购自金唯智生物科技有限公司。

大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)菌株和pET-28a(+)载体用于基因克隆及蛋白表达。

标准品化合物桂叶苷B、毛蕊花糖苷购买自成都植标化纯生物技术有限公司。

木通苯乙醇苷A标准品购买自Chemfaces。

桂叶苷A由本实验室合成，纯度大于90％。

UDP-鼠李糖购买自索莱宝生物科技有限公司。

胶回收试剂盒、植物总RNA提取试剂盒购买自Tiangen生化科技有限公司。

反转录试剂盒TransScript One-step gDNA Removal and cDNA SynthesisSupermix购买自北京全式金有限责任公司。

Phanta Max超高保真DNA聚合酶购买自诺维赞生物科技优先公司。

无缝克隆试剂盒购买自碧云天生物技术有限公司。

实施例1、LrUGT2基因及其编码蛋白的重组制备

1.LrUGT2基因的挖掘

对粗壮女贞[Ligustrum robustum]根部和叶部组织的转录组数据进行序列分析，共发现了94个糖基转移酶候选基因。对糖基转移酶候选基因的表达量、亲缘关系进行分析后，获得了叶部表达量最高而根部表达量低的而且属于糖基特异性糖基转移酶家族的LrUGT2作为候选基因，其DNA编码核苷酸序列及蛋白质的氨基酸分别如SEQ ID NO:2和SEQID NO:1所示。因此，本发明人经过上述研究，从粗壮女贞[Ligustrum robustum]这一物种中筛选出一种新型的参与桂叶苷B、毛蕊花糖苷生物合成的LrUGT2蛋白。

2.粗壮女贞叶片cDNA的制备

取植物粗壮女贞的新鲜叶片组织液氮速冻，采用Tiangen的植物总RNA提取试剂盒，按试剂盒的操作步骤提取RNA，验证合格后，参考全式金的 TransScript One-stepgDNA Removal and cDNA Synthesis Supermix反转录试剂盒，反转录RNA制备cDNA。

3.LrUGT2基因克隆和表达质粒构建

设计并合成引物(上游引物：CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCTGATTTTGAGAAATCAAAGCTTC；下游引物：TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTAAAGCTCAGAAAGACTATTGAT GAAATTATC；下划线部分，为同源臂碱基序列)，以cDNA为模板进行PCR扩增，在基因上游、下游分别引入与pET-28a(+)互补的同源臂序列。PCR扩增体系(5 0μL)：10μL 5X SF buffer，1μL dNTPMix，Primer1/Primer2终浓度0.2 μM；cDNA<200ng；剩余体积用灭菌蒸馏水补足。PCR反应条件：95℃预变性2 min，然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。

琼脂糖凝胶电泳检测，发现约1.5kb的条带(图2)，使用Tiangen胶回收试剂盒回收目的片段。

使用无缝克隆试剂盒(碧云天生物科技有限公司)，将回收片段与经NheI 和SalI酶切过的pET28a载体连接。无缝克隆体系(20μL)：10μL 2X Seamless Cloning Mix，50ng线性化载体，10ng回收片段；剩余体积用灭菌蒸馏水补至 20μL。无缝克隆反应条件：50℃孵育30min。

将无缝克隆产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将菌落PCR验证阳性的质粒送金唯智生物科技有限公司测序，得到的DNA编码序列及蛋白质分别如SEQ ID NO:2和1所示，该重组质粒为pET28a-LrUGT2。

4.LrUGT2的表达

将重组质粒pET28a-LrUGT2转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布在LB固体培养基(卡那霉素50μg/mL),37℃培养过夜，得到重组菌株 BL21(DE3)/pET28a-LrUGT2。挑取单菌落到5mL LB液体培养基(卡那霉素50 μg/mL)，过夜培养后，转接至50mL新鲜LB液体培养基中，200rpm培养至 OD₆₀₀＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，在200rpm、16℃条件下继续培养20h。空白质粒pET28a转化BL21(DE3)后，得到重组菌株 BL21(DE3)/pET28a。

表达结束后，使用SDS-PAGE检验表达情况：菌液离心(4000rpm，30min) 弃去上清，用15mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl)重悬，置冰上超声破碎获得菌体裂解液，冷冻离心(12000rpm，15min，4℃)。分别菌体裂解液、上清液、沉淀，用SDS-PAGE验证蛋白表达情况(图3)。

实施例2、LrUGT2的体外功能鉴定

1.获取LrUGT2粗酶液

接种保存的单菌落BL21(DE3)/pET28a-LrUGT2到5mL LB液体培养基(含有50μg/mL)中，37℃、200rpm过夜培养，转种1mL培养物到50mL新鲜LB 培养基中，37℃、200rpm培养到OD600＝0.6-0.8后，加入IPTG至终浓度0.1mM，在16℃、200rpm条件下继续培养20h。携带pET28a的BL21(DE3)重组菌株作为空白对照，操作同上。离心收菌，使用15mL裂解缓冲液重悬，在冰水混合物中超声破碎，12000rpm离心15min，上清液即为LrUGT2粗酶液。

2.粗酶催化反应

粗酶反应体系总体积为100μL，包括：0.1mM的桂叶苷A或木通苯乙醇苷 A，1mM的UDP-鼠李糖，50μL LrUGT2粗酶液，用裂解缓冲液补足体积至100 μL。混合体系后，在30℃反应6h，加入100μL甲醇，终止反应。反应混合物离心(12000rpm，10min)后，使用HPLC和LC-MS进行产物分析。

3.产物检测

HPLC检测参数如下：色谱柱SilGreen C18(5μm,4.6×250mm)；柱温40℃；截取波长为312nm；流动相由溶液A(0.1％甲酸水溶液)和溶液B(乙腈)组成，梯度洗脱方法为：0-5min保持18％流动相B，在5-35min流动相B由18％升至 21％，流速为1ml/min。

进行LC-MS分析时，将流动相A更换成含有5mM乙酸铵的水溶液，其余色谱条件不变。质谱条件如下：化模式为电喷雾(ESI)负离子，毛细管电压为4500 V，雾化气压为1bar，除溶剂气体为氮气，流速6.0L/min，除溶剂温度和离子源温度均为180℃，扫描范围m/z为50-1000，LC-MS数据收集软件为MassLynx 4.0(Waters，USA)，精确分子量用三氟乙酸钠作校正液。

LrUGT2催化桂叶苷A的HPLC结果如图4所示，LrUGT2粗酶的反应体系中出现桂叶苷B的吸收峰(RT＝24.8min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a未出现，说明LrUGT2能够有效转化底物桂叶苷A生成新产物。通过LC-MS检测 (图5)，该化合物的精确分子量([M-H]^-＝591.2123)为桂叶苷A精确分子量加上一个鼠李糖基基团。因此，鉴定该产物为桂叶苷B。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为94.96％。

LrUGT2催化木通苯乙醇苷A的HPLC结果如图6所示，LrUGT2粗酶的反应体系中出现毛蕊花糖苷的吸收峰(RT＝10.1min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a 未出现，说明LrUGT2能够有效转化底物木通苯乙醇苷A生成新产物。通过LC-MS 检测(图7)，该化合物的精确分子量([M-H]-＝623.1488)为木通苯乙醇苷A精确分子量加上一个鼠李糖基基团。因此，鉴定该产物为毛蕊花糖苷。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为2.41％。

实施例3、LrUGT2的同源基因RgUGT的体外功能鉴定

1.RgUGT序列获取

对地黄[Rehmannia glutinosa]转录组数据使用本地Blastp程序搜索 LrUGT2的同源基因，获得一致度大于80％的同源基因，称为RgUGT，其DNA编码序列和蛋白质序列分别如SEQ ID NO:4、3所示。

2.RgUGT原核表达和获取粗酶液

在生物科技公司合成RgUGT的DNA编码序列，并克隆至pET-28a(+)载体的 NheI和SalI酶切位点之间，得到质粒pET28a-RgUGT。将重组质粒pET28a-RgUGT 转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布在LB固体培养基(卡那霉素 50μg/mL),37℃培养过夜，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a-RgUGT。挑取单菌落到5mL LB液体培养基(卡那霉素50μg/mL)，过夜培养后，转接至50mL新鲜LB液体培养基中，200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，在200rpm、16℃条件下继续培养20h。空白质粒pET28a转化BL21(DE3) 后，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a。表达结束后，使用SDS-PAGE检验表达情况：菌液离心(4000rpm，30min)弃去上清，用15mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mMNaCl)重悬，置冰上超声破碎获得菌体裂解液，冷冻离心(12000rpm，15min，4℃)。分别菌体裂解液、上清液、沉淀，用SDS-PAGE 验证蛋白表达情况(图8)。

上清液即为RgUGT粗酶液。粗酶反应体系总体积为100μL，包括：0.1mM 的桂叶苷A或木通苯乙醇苷A，1mM的UDP-鼠李糖，50μL LrUGT2粗酶液，用裂解缓冲液补足体积至100μL。混合体系后，在30℃反应6h，加入100μL甲醇，终止反应。反应混合物离心(12000rpm，10min)后，使用HPLC进行产物分析。

3.产物检测

HPLC检测参数如下：色谱柱SilGreen C18(5μm,4.6×250mm)；柱温40℃；截取波长为312nm；流动相由溶液A(0.1％甲酸水溶液)和溶液B(乙腈)组成，梯度洗脱方法为：0-5min保持18％流动相B，在5-35min流动相B由18％升至 21％，流速为1ml/min。

RgUGT催化桂叶苷A的HPLC结果如图9所示，RgUGT粗酶的反应体系中出现桂叶苷B的吸收峰(RT＝24.8min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a未出现，说明RgUGT能够有效转化底物桂叶苷A生成桂叶苷B。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为95.23％。

RgUGT催化木通苯乙醇苷A的HPLC结果如图10所示，RgUGT粗酶的反应体系中出现毛蕊花糖苷的吸收峰(RT＝10.1min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a 未出现，说明RgUGT能够有效转化底物木通苯乙醇苷A生成毛蕊花糖苷。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为18.36％。

实施例4、LrUGT2的同源基因OlUGT的体外功能鉴定

1.OlUGT序列获取

在NCBI上用Blastp程序搜索到LrUGT2的同源基因中，来自油橄榄[Oleaeuropaea]的蛋白质序列与LrUGT2一致度大于80％，分别称为OlUGT，DNA编码序列和蛋白质序列分别如SEQ ID NO:6、5所示。

2.OlUGT原核表达和获取粗酶液

在生物科技公司合成OlUGT的DNA编码序列，并克隆至pET-28a(+)载体的 NheI和SalI酶切位点之间，得到质粒pET28a-OlUGT。将重组质粒pET28a-OlUGT 转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布在LB固体培养基(卡那霉素50μg/mL)，37℃培养过夜，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a-OlUGT。挑取单菌落到5mL LB液体培养基(卡那霉素50μg/mL)，过夜培养后，转接至50mL新鲜LB液体培养基中，200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，在200rpm、16℃条件下继续培养20h。空白质粒pET28a转化BL21(DE3)后，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a。表达结束后，使用SDS-PAGE检验表达情况：菌液离心(4000rpm，30min)弃去上清，用15mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mM NaCl)重悬，置冰上超声破碎获得菌体裂解液，冷冻离心(12000rpm，15min，4℃)。分别菌体裂解液、上清液、沉淀，用SDS-PAGE 验证蛋白表达情况(图11)。

上清液即为OlUGT粗酶液。粗酶反应体系总体积为100μL，包括：0.1mM 的桂叶苷A或木通苯乙醇苷A，1mM的UDP-鼠李糖，50μL LrUGT2粗酶液，用裂解缓冲液补足体积至100μL。混合体系后，在30℃反应6h，加入100μL甲醇，终止反应。反应混合物离心(12000rpm，10min)后，使用HPLC进行产物分析。

3.产物检测

HPLC检测参数如下：色谱柱SilGreen C18(5μm,4.6×250mm)；柱温40℃；截取波长为312nm；流动相由溶液A(0.1％甲酸水溶液)和溶液B(乙腈)组成，梯度洗脱方法为：0-5min保持18％流动相B，在5-35min流动相B由18％升至 21％，流速为1ml/min。

OlUGT催化桂叶苷A的HPLC结果如图12所示，OlUGT粗酶的反应体系中出现桂叶苷B的吸收峰(RT＝24.8min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a未出现，说明OlUGT能够有效转化底物桂叶苷A生成桂叶苷B。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为94.31％。

OlUGT催化木通苯乙醇苷A的HPLC结果如图13所示，OlUGT粗酶的反应体系中出现毛蕊花糖苷的吸收峰(RT＝10.1min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a 未出现，说明OlUGT能够有效转化底物木通苯乙醇苷A生成毛蕊花糖苷。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为2.34％。

实施例5、LrUGT2的同源基因SiUGT的体外功能鉴定

1.SiUGT序列获取

在NCBI上用Blastp程序搜索到LrUGT2的同源基因中，芝麻[Sesamum indicum]的蛋白质序列与LrUGT2一致度大于80％，分别称为SiUGT，DNA编码序列和蛋白质序列分别如SEQ ID NO:8、7所示。

2.SiUGT原核表达和获取粗酶液

在生物科技公司合成SiUGT的DNA编码序列，并克隆至pET-28a(+)载体的 NheI和SalI酶切位点之间，得到质粒pET28a-SiUGT。将重组质粒pET28a-SiUGT 转化到大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中，涂布在LB固体培养基(卡那霉素 50μg/mL),37℃培养过夜，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a-SiUGT。挑取单菌落到5mL LB液体培养基(卡那霉素50μg/mL)，过夜培养后，转接至50mL新鲜LB液体培养基中，200rpm培养至OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度0.1mM，在200rpm、16℃条件下继续培养20h。空白质粒pET28a转化BL21(DE3) 后，得到重组菌株BL21(DE3)/pET28a。表达结束后，使用SDS-PAGE检验表达情况：菌液离心(4000rpm，30min)弃去上清，用15mL裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.5，100mMNaCl)重悬，置冰上超声破碎获得菌体裂解液，冷冻离心(12000rpm，15min，4℃)。分别菌体裂解液、上清液、沉淀，用SDS-PAGE 验证蛋白表达情况(图14)。

上清液即为SiUGT粗酶液。粗酶反应体系总体积为100μL，包括：0.1mM 的桂叶苷A或木通苯乙醇苷A，1mM的UDP-鼠李糖，50μL LrUGT2粗酶液，用裂解缓冲液补足体积至100μL。混合体系后，在30℃反应6h，加入100μL甲醇，终止反应。反应混合物离心(12000rpm，10min)后，使用HPLC进行产物分析。

3.产物检测

HPLC检测参数如下：色谱柱SilGreen C18(5μm,4.6×250mm)；柱温40℃；截取波长为312nm；流动相由溶液A(0.1％甲酸水溶液)和溶液B(乙腈)组成，梯度洗脱方法为：0-5min保持18％流动相B，在5-35min流动相B由18％升至 21％，流速为1ml/min。

SiUGT催化桂叶苷A的HPLC结果如图15所示，SiUGT粗酶的反应体系中出现桂叶苷B的吸收峰(RT＝24.8min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a未出现，说明SiUGT能够有效转化底物桂叶苷A生成桂叶苷B。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为93.1％。

SiUGT催化木通苯乙醇苷A的HPLC结果如图16所示，SiUGT粗酶的反应体系中出现毛蕊花糖苷的吸收峰(RT＝10.1min)，而空白菌株BL21(DE3)/pET28a 未出现，说明SiUGT能够有效转化底物木通苯乙醇苷A生成毛蕊花糖苷。使用上述反应体系，该反应的最终转化率为1.94％。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种参与桂叶苷B和毛蕊花糖苷生物合成的LrUGT2蛋白及其编码基因与应用

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 456

<212> PRT

<213> Ligustrum robustum

<400> 1

MSDFEKSKLHLAMFPWLAMGHITPFIHLSNELAKRGHKISFLLPNKALIQLGNNNFYPDLIKFHVVAVPQVEGLPPGAETASDIDITGKNPLAIAFDSMAEQVEVLLSELKPDFVFYDFADWIPKLATKLGFKTICYNVICASCLAIGIVPARKIPKDRPLTVEELMEPPKGYPSSTVVLRGQEARTLSFIAMVYGATTFDVRITAAMKGCDAISIRTCQELEGPMCDYLSSQYGKPVILTGPVLPVTPKGQLEEKWDKWLNQFEPKSVVYCAFGSQLILQQNQFQELVLGFEMSGLPFFIALSKPAGANSIEEALPEGFEERVKGRGVVYGGWVQQTQILSHPSVGCFVSHCGFGSMWESLLSDSQIVLVPRLADQILNTRLLAEELKVAVEVERGDMGWFSKEDLCKAIKSVMDKDSEIGNLIRRNHSKWKETLVSPGFMDNYIDNFINSLSEL 456

<210> 2

<211> 1371

<212> DNA

<213> Ligustrum robustum

<400> 2

ATGTCTGATTTTGAGAAATCAAAGCTTCATCTTGCCATGTTCCCATGGCTAGCCATGGGGCACATAACTCCATTCATCCATCTATCCAATGAGCTAGCTAAGAGAGGCCATAAGATCAGCTTCTTGTTGCCGAATAAGGCTTTGATTCAATTGGGCAACAACAACTTTTACCCAGATTTAATCAAGTTCCATGTTGTTGCTGTTCCTCAAGTTGAAGGCCTGCCACCGGGTGCAGAAACTGCTTCTGATATAGACATCACTGGCAAGAATCCACTCGCTATAGCCTTTGATTCCATGGCTGAACAAGTTGAGGTCTTGTTGAGTGAATTGAAGCCTGATTTTGTGTTCTATGATTTTGCCGATTGGATTCCCAAATTGGCTACCAAGCTTGGGTTCAAGACTATTTGTTATAATGTTATTTGTGCTTCTTGTTTAGCTATTGGGATTGTTCCGGCCAGGAAAATTCCCAAAGACAGGCCTTTGACTGTGGAGGAGCTGATGGAGCCACCCAAAGGGTACCCTTCTTCCACGGTGGTGCTCCGTGGGCAGGAGGCACGTACCTTATCATTCATAGCTATGGTTTACGGCGCAACCACTTTTGATGTGCGTATCACTGCTGCAATGAAGGGTTGTGATGCGATCTCTATAAGGACTTGCCAAGAATTGGAAGGGCCAATGTGTGATTATTTGTCAAGCCAGTATGGGAAGCCTGTGATTCTAACAGGGCCAGTTTTGCCAGTGACACCCAAAGGACAACTAGAAGAAAAGTGGGACAAATGGCTAAACCAATTTGAGCCAAAATCTGTGGTGTACTGTGCATTTGGGAGCCAATTGATCCTCCAACAGAACCAATTTCAAGAACTTGTATTGGGTTTTGAAATGTCAGGGCTACCATTTTTCATAGCCCTTTCAAAACCAGCAGGAGCAAATTCTATAGAAGAAGCACTGCCGGAGGGTTTCGAAGAGAGGGTCAAAGGAAGAGGGGTTGTCTATGGTGGCTGGGTGCAACAGACTCAGATTCTCAGCCACCCCTCAGTAGGGTGTTTTGTGAGTCATTGTGGTTTTGGATCCATGTGGGAGTCTTTGCTAAGTGACAGCCAAATTGTGCTTGTGCCAAGACTTGCCGACCAAATCTTGAATACACGGCTGCTGGCGGAGGAGCTCAAGGTGGCGGTGGAGGTGGAGAGAGGCGATATGGGATGGTTTTCGAAGGAGGATTTATGCAAGGCCATTAAATCTGTGATGGATAAAGACAGTGAAATTGGAAATTTGATCAGGAGAAACCACTCCAAATGGAAAGAAACTCTGGTAAGCCCAGGATTTATGGACAATTACATAGATAATTTCATCAATAGTCTTTCTGAGCTTTAG 1371

<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> Rehmannia glutinosa

<400> 3

MPEFEKPKLHITMFPWVAIGHITPFIHLANELAKRGHSISILIPKKAHTQLGHNNLYPDLIKFHIVTVPHVEGLPAGAETASDIDITAKNPLAIAFDAMYEQVETLLYGLKPDIVFYDFADWIPKLAAQIGFKTVCYNVICASCMAIGIVPARHIPKDRPLTEEELMTPPEGYPSSTVVLRGQEARTLSFIGMDYGATKFDVRITAAMQGCDAIGIRTCRELEGPMCDYLSAQYNKPVFLSGPVLPESPKGPLEEKWEKWLNKFEPKSVVYCAFGSQMILQKNQFQELVLGFEMTGLPFFVALSKPHGADSIEEALPEGFLERVGDRGVVHGGWVQQTQILNHQSVGCFVSHCGFGSMWESLLSDSQIVLVPRLADQILNTRLLAEELKVAVEVERGDMGWFSKEDLCKAIKSVMDEESEVGKLVKKNHAKWRETLVSPGYMDNYLEDFIQQLYGL 456

<210> 4

<211> 1371

<212> DNA

<213> Rehmannia glutinosa

<400> 4

ATGCCTGAATTTGAAAAGCCTAAGCTTCACATAACCATGTTCCCATGGGTAGCCATAGGCCACATCACTCCATTCATCCATCTCGCCAACGAGCTCGCCAAAAGAGGCCATTCTATCTCCATTTTGATCCCCAAAAAGGCCCATACTCAGCTCGGCCACAACAATCTCTACCCAGATCTCATCAAATTCCACATCGTCACCGTGCCTCATGTCGAAGGCCTACCTGCCGGCGCCGAGACTGCTTCCGATATCGACATCACCGCCAAAAATCCACTCGCCATAGCCTTCGACGCCATGTACGAACAAGTCGAAACCCTATTGTACGGCCTTAAACCTGACATCGTGTTCTACGATTTCGCCGATTGGATCCCCAAGCTCGCCGCTCAGATTGGCTTCAAAACTGTTTGTTATAATGTCATCTGCGCTTCGTGTATGGCGATTGGTATTGTTCCGGCGAGGCATATCCCGAAAGACCGGCCGTTGACGGAGGAGGAACTGATGACGCCGCCGGAAGGGTACCCTTCGTCCACCGTGGTCCTCCGCGGACAGGAGGCGCGGACTCTGTCTTTCATCGGCATGGATTACGGCGCCACCAAGTTCGACGTGCGTATCACCGCCGCGATGCAGGGCTGCGACGCTATTGGTATTCGTACTTGCCGCGAGCTGGAGGGCCCCATGTGCGATTACTTATCCGCACAGTACAATAAGCCCGTTTTTCTATCCGGCCCGGTTTTGCCGGAGTCTCCTAAAGGCCCGCTGGAGGAGAAATGGGAAAAATGGCTCAACAAATTCGAGCCCAAATCCGTCGTCTACTGCGCTTTCGGAAGCCAAATGATTCTCCAAAAAAATCAATTTCAGGAATTAGTGTTAGGTTTCGAGATGACGGGTTTGCCCTTTTTCGTAGCTCTCTCGAAACCCCACGGCGCGGACTCCATTGAAGAAGCTCTGCCGGAGGGGTTTTTGGAGAGGGTGGGCGATAGAGGAGTGGTCCACGGCGGTTGGGTCCAGCAGACCCAGATCCTGAACCACCAATCAGTGGGCTGCTTCGTGAGCCATTGCGGGTTCGGGTCGATGTGGGAGTCATTGCTGAGTGACAGCCAGATAGTGCTAGTGCCGCGTTTGGCGGATCAGATATTGAACACGCGGCTGCTGGCGGAGGAGCTGAAGGTGGCGGTGGAGGTGGAGAGAGGGGATATGGGGTGGTTTTCCAAGGAGGATTTGTGTAAGGCGATTAAGAGTGTGATGGATGAGGAGAGTGAGGTGGGGAAATTGGTGAAGAAGAATCATGCTAAGTGGAGGGAGACTTTGGTGAGCCCTGGATATATGGATAATTATCTTGAGGATTTTATTCAGCAATTGTATGGGCTTTAA 1371

<210> 5

<211> 456

<212> PRT

<213> Olea europaea

<400> 5

MPDFEKSKLHLVMFPWLAMGHITPFIHLSNELAKRGHKISFLLPKKALIQLGNNNLYPDLIKFHVVAVPQVEGLPPGAETASDIDITGKNPLAIAFDSMAEQVEVLLSDLKPDFVFYDFADWIPKLATKIGFKTICYNVICASCLAIGIVPARKIPKDRPMTVEELMEPPKGYPSSTVVLRGQEARTLSFIAMDYGTTTFDVRITAAMKGCDAISIRTCQELEGPMCDYLSSQYGKPVILTGPVLPETPEGQLEEKWDKWLNQFEPKSVVYCAFGSQLILQKNQFQELVLGFEMTGLPFFIAVSKPAGANSIEEALPEGFEERIEGRGVVYGGWVQQTQILSHPSVGCFVSHCGFGSMWESLLSDSQIVLVPRLADQILNTRLLAEELKVAVEVERGDMGWFSKEDLCKAIKSVMDKDSEIGNLIKKNHSKWKETLVSPGYMDNYIDNFINSLYEL 456

<210> 6

<211> 1371

<212> DNA

<213> Olea europaea

<400> 6

ATGCCTGATTTTGAGAAGTCAAAGCTTCATCTTGTCATGTTCCCATGGCTAGCCATGGGGCACATAACTCCATTCATCCATCTATCCAATGAGTTAGCTAAAAGAGGCCATAAGATCAGCTTCTTGTTGCCCAAAAAGGCTTTGATTCAACTGGGCAACAACAACTTGTACCCAGATTTAATTAAATTCCATGTTGTTGCTGTTCCTCAAGTCGAGGGCCTGCCTCCAGGTGCAGAAACTGCTTCTGATATAGACATCACTGGCAAGAATCCACTGGCTATAGCCTTTGATTCCATGGCTGAACAAGTTGAAGTCTTGTTGAGTGATCTAAAGCCAGATTTTGTGTTCTATGATTTTGCCGATTGGATTCCCAAATTGGCAACCAAGATTGGGTTCAAGACTATTTGTTATAATGTTATTTGTGCTTCTTGTTTGGCTATTGGGATTGTTCCGGCGAGGAAAATTCCCAAAGACAGGCCTATGACGGTGGAGGAACTGATGGAGCCACCCAAAGGGTACCCTTCTTCCACGGTGGTGCTGCGTGGGCAGGAGGCGCGTACCTTATCATTCATAGCTATGGATTACGGCACAACCACTTTTGATGTGCGTATTACGGCTGCAATGAAGGGTTGTGATGCAATCTCTATAAGGACTTGCCAAGAATTGGAAGGGCCAATGTGTGATTATTTGTCAAGCCAGTACGGGAAGCCTGTGATTCTAACAGGGCCGGTTTTGCCAGAGACGCCTGAAGGACAACTAGAAGAAAAGTGGGACAAATGGCTAAACCAATTTGAGCCAAAATCTGTAGTGTACTGTGCATTTGGGAGCCAATTGATCCTCCAAAAGAACCAATTTCAAGAACTTGTATTGGGTTTTGAAATGACAGGGCTACCATTTTTCATAGCCGTTTCGAAACCAGCAGGTGCAAATTCGATAGAAGAAGCACTACCTGAGGGTTTTGAAGAGAGGATCGAAGGTAGAGGGGTTGTTTATGGTGGCTGGGTGCAGCAGACACAGATTCTCAGCCACCCCTCAGTAGGGTGTTTTGTGAGTCATTGTGGTTTTGGATCCATGTGGGAGTCTTTGTTAAGTGACAGCCAAATTGTGCTTGTGCCAAGACTTGCCGACCAAATTTTGAATACACGGCTGCTGGCGGAGGAGCTGAAGGTGGCGGTGGAGGTGGAGAGAGGCGATATGGGGTGGTTTTCGAAGGAGGATTTATGCAAGGCCATTAAATCTGTGATGGATAAAGACAGTGAAATTGGCAATTTGATCAAGAAAAACCACTCCAAGTGGAAAGAAACTTTAGTAAGCCCAGGATATATGGACAATTACATTGATAATTTCATCAACAGTCTTTATGAGCTTTAG 1371

<210> 7

<211> 456

<212> PRT

<213> Sesamum indicum

<400> 7

MPEFEKSKLHIAMFPWVAIGHITPFIHLANELAKRGHSISILIPNKPLLQLGHHSLYPDLIKFHVVTIPQVEGLPPGAETASDIDITAKNPLAIAFDATAEQVETILSGLKPDIVFYDFADWIPKMAARVGFKTVCYNVICASCMAIGIVPARHIPKDRRLTEEELGQPPKGYPSSTVVLRGQEALTLSFIAMDYGATKFDVRITAAMQGCDAIGIRTCRELEGPMCDYLSEQYNKPVFLSGPVLPENPKGALEEKWDKWLSKFKPKSVVYCAFGSQLMLQKKQFQEMVLGFEMTGLPFFVAVSKPHGADSIEEALPEGFLERVGDRGVVHGGWVQQTQGLNHPSVGCFVSHCGFGSMWESLLSESQIVLVPRLADQILNTRLLAEELKVAVEVERGEMGWFSKEDLSKAIKSVMDEESEVGKLVKENHGKWRETLMSPEFMDNYVDNFIRQLYQLL 456

<210> 8

<211> 1371

<212> DNA

<213> Sesamum indicum

<400> 8

ATGCCTGAGTTTGAGAAGTCAAAGCTTCACATAGCCATGTTTCCATGGGTGGCCATTGGCCACATCACTCCCTTCATCCATCTCGCCAACGAGCTCGCCAAAAGGGGCCACTCTATCTCCATTTTGATTCCCAATAAACCTCTTCTTCAGCTCGGCCACCACAGTCTCTACCCAGATCTCATCAAATTTCATGTTGTTACTATTCCTCAAGTAGAGGGCCTGCCGCCCGGCGCTGAGACTGCTTCCGATATCGACATCACAGCCAAGAATCCACTAGCCATAGCCTTCGATGCTACGGCCGAACAAGTCGAGACCATTTTATCCGGGCTGAAACCTGATATCGTGTTTTACGATTTCGCCGACTGGATCCCCAAGATGGCAGCCCGGGTTGGCTTTAAAACTGTTTGTTATAATGTCATCTGCGCTTCTTGTATGGCGATTGGTATTGTTCCCGCCAGGCATATTCCTAAAGACAGGCGGCTGACGGAGGAGGAACTCGGGCAGCCCCCCAAAGGGTACCCTTCTTCCACGGTGGTGCTTCGCGGCCAAGAGGCACTGACTCTATCTTTCATCGCCATGGATTACGGCGCCACCAAGTTTGACGTGCGTATTACCGCCGCGATGCAGGGCTGCGACGCTATTGGCATCCGAACTTGCCGCGAGCTGGAGGGCCCTATGTGCGATTACTTGTCGGAACAGTACAATAAACCCGTCTTCCTAAGCGGGCCGGTTTTGCCGGAGAATCCAAAAGGGGCGCTGGAGGAGAAGTGGGACAAGTGGCTGAGCAAATTCAAGCCCAAATCCGTTGTCTACTGCGCGTTCGGGAGCCAACTGATGCTGCAAAAGAAGCAGTTTCAAGAAATGGTGTTGGGTTTCGAGATGACGGGGCTGCCGTTCTTCGTAGCCGTGTCGAAACCCCATGGAGCGGACTCCATAGAAGAAGCTCTGCCGGAGGGATTCTTGGAGAGGGTGGGAGATAGAGGAGTGGTTCATGGCGGGTGGGTCCAGCAGACCCAGGGCCTGAACCACCCGTCAGTGGGTTGCTTCGTGAGCCACTGCGGGTTCGGATCCATGTGGGAGTCTCTGCTGAGCGAGAGCCAGATAGTGCTGGTGCCGCGGTTGGCGGATCAAATACTGAACACACGGCTGCTGGCGGAGGAGCTGAAGGTGGCGGTGGAGGTAGAAAGAGGGGAGATGGGGTGGTTTTCCAAGGAGGATCTAAGCAAGGCGATCAAGAGTGTGATGGATGAGGAGAGTGAGGTGGGGAAATTGGTGAAGGAGAATCATGGCAAGTGGAGGGAGACTCTGATGAGCCCTGAATTTATGGATAATTACGTTGATAACTTCATCCGACAATTGTATCAACTGTTATAG

<210> 9

<211> 1377

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

CGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGTCTGATTTTGAGAAATCAAAGCTTC 49

<210> 10

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

TGCGGCCGCAAGCTTGTCGACCTAAAGCTCAGAAAGACTATTGATGAAATTATC  54