具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

甲苄基异氰酸酯的检测方法、筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法及其在盐酸多佐胺异构体检测中的应用和盐酸多佐胺异构体的检测方法，下面将分别对其进行详细描述。

甲苄基异氰酸酯的检测方法

在本发明的一个方面，本发明提出了一种甲苄基异氰酸酯的检测方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将含有甲苄基异氰酸酯的溶液进行高效液相色谱检测，以便于分离检测甲苄基异氰酸酯中的S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，高效液相色谱检测采用的色谱柱为键合型手性柱。

根据本发明实施例的检测方法中，采用高效液相色谱检测可以有效地分离出S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，分离度高达1.0以上，甚至是1.5以上，由此，可以确定甲苄基异氰酸酯溶液中是否存在S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯。该方法具有准确性强、灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，高效液相色谱检测包括：利用流动相对含有甲苄基异氰酸酯的溶液进行梯度洗脱，其中，流动相A选自含有正己烷、乙醇和二乙胺的混合液，流动相B选自乙醇。

发明人采用高效液相色谱法检测S-(-)-α-与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯时发现，流动相的组成会显著影响两者是否可以明显分离，若流动相选择不当，会导致两者无法明显分离，从而无法准确地判断溶液中是否含有S-(-)-α-与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，进一步更难以确定具体含量。进而，发明人经过深入研究分析及优化筛选发现，采用正己烷、乙醇和二乙胺作为流动相A、以乙醇作为流动相B，可以有效地分离检测出S-(-)-α-与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，分离度高，可避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，检测结果准确性强、灵敏度高、稳定性强，并且，操作简便、快捷，效率高，适于规模化应用。

根据本发明的实施例，流动相A中正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为(90～99)：(1～10)：(0.05～0.2)。发明人经过大量实验得到上述较佳配比，由此，可以进一步有效地分离S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。

根据本发明的实施例，梯度洗脱的条件如下。由此，可以进一步有效地分离S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，提高检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。

根据本发明的实施例，高效液相色谱检测采用的色谱柱选自YMC Cellulose-SB键合型手性柱或大赛璐CHRALPAK IB手性柱。采用发现，采用上述两种色谱柱可以进一步有效地分离S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。其中，YMC Cellulose-SB键合型手性柱(尺寸为4.6*250mm，5μm)效果较佳。

根据本发明的实施例，色谱检测中采用的检测波长为250～260nm，柱温为10～20℃。由此，可以进一步有效地分离S-(-)-α-和R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。

根据本发明的实施例，获得含有甲苄基异氰酸酯的溶液的方法包括：采用稀释溶剂将含有S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的化学品进行稀释处理，其中，稀释溶剂选自含有正己烷和异丙醇的混合溶剂。

发明人发现，稀释溶剂的组成会影响S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的分离，进而，发明人经过深入研究发现，以含有正己烷和异丙醇的混合溶剂作为稀释溶剂，在色谱检测时可以有效地分离S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。

根据本发明的实施例，稀释溶剂中，正己烷和异丙醇的体积比为(85～95)：(5～15)。由此，可以进一步有效地分离S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。

根据本发明的实施例，该方法进一步包括：采用外标法对含有甲苄基异氰酸酯的溶液中S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯进行含量检测。由此，可以准确地确定S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯含量，实现定量检测目的。

筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：采用前面所述甲苄基异氰酸酯的检测方法对候选甲苄基异氰酸酯试剂进行检测，确定候选甲苄基异氰酸酯试剂中R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯和/或S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯含量；当R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯含量低于第一阈值和/或S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯含量高于第二阈值，是候选甲苄基异氰酸酯试剂为目标试剂的指示。由此，根据本发明的方法可以准确筛选出R-(+)-α-和/或S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯含量满足要求的甲苄基异氰酸酯试剂，避免该试剂中含有过多R-(+)-α-甲氧基异氰酸酯造成干扰，尤其是可以用于筛选可检测盐酸多佐胺的对映异构体(简称杂质A)的甲苄基异氰酸酯试剂。

需要说明的是，本发明所描述的甲苄基异氰酸酯应作广义理解，其可以为R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，也可以为R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，也可以为R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯和S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯以任意比例组成的物质。本发明所描述的甲苄基异氰酸酯试剂也应作广义理解，凡是含有甲苄基异氰酸酯的试剂均可视作甲苄基异氰酸酯试剂，对于该甲苄基异氰酸酯试剂中R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯和S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯的含量也不做严格要求，可以根据实际需要选择特定组成的甲苄基异氰酸酯试剂。另外，本发明对于第一阈值和第二阈值的具体数值也不做严格限定，可以根据实际需要灵活选择，例如，第一阈值可以不大于1体积％，优选不大于0.1体积％；第二阈值不小于99体积％，优选不小于99.9体积％。由此，筛选所得甲苄基异氰酸酯试剂中S-(-)-α-甲氧基异氰酸酯含量较高，尤其适用于检测盐酸多佐胺的对映异构体(简称杂质A)。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对甲苄基异氰酸酯的检测方法所描述的特征和优点，同样适用于该筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法，在此不再赘述。

甲苄基异氰酸酯的检测方法或筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法在盐酸多佐胺异构体检测中的应用

在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述甲苄基异氰酸酯的检测方法或筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法在盐酸多佐胺异构体检测中的应用。如前所述，采用筛选甲苄基异氰酸酯的检测方法可以有效地分离R-(+)-α-和S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯，并进一步确定各自含量，从而筛选出满足R-(+)-α-和/或S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯含量要求的甲苄基异氰酸酯试剂，以应用于盐酸多佐胺异构体的检测。具体地，S-(-)-α-甲氧基异氰酸酯可与盐酸多佐胺的对映异构体(简称杂质A)反应生成杂质A的衍生化试剂，该衍生化试剂可进一步被诸如高效液相色谱等检出。由于上述方法可以有效地筛选出几乎不含R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的甲苄基异氰酸酯试剂，因此可以极大地降低因R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯与杂质A发生衍生化反应而导致的杂质A检测含量增加的不良影响。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对甲苄基异氰酸酯的检测方法和筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。

盐酸多佐胺异构体的检测方法

在本发明的又一方面，本发明提出了一种盐酸多佐胺异构体的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：1)利用前面所述筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法，筛选出符合要求的甲苄基异氰酸酯试剂；2)采用步骤1)筛选出的甲苄基异氰酸酯试剂对盐酸多佐胺样品进行衍生化反应，得到衍生化产物；3)对衍生化产物进行检测，并基于检测结果确定盐酸多佐胺样品中是否存在盐酸多佐胺对映异构体和/或盐酸多佐胺对映异构体含量。

如前所述，采用前述筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法可以有效地筛选出几乎不含R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的甲苄基异氰酸酯试剂，因此可以极大地降低因R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯与杂质A发生衍生化反应而导致的杂质A检测含量增加的不良影响。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地实现盐酸多佐胺异构体的检测，具有准确性强、灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于规模化应用。

本领域技术人员能够理解的是，前面针对筛选甲苄基异氰酸酯试剂的方法所描述的特征和优点，同样适用于该盐酸多佐胺异构体的检测方法，在此不再赘述。

本发明的有益效果在于：

根据本发明实施例的甲苄基异氰酸酯检测方法中，采用高效液相色谱检测可以有效地分离出S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯，分离度高达1.0以上，甚至是1.5以上，由此，可以确定含有甲苄基异氰酸酯的溶液中是否存在S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯。并且，可以进一步利用诸如外标法等方式确定S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和/或R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯含量，从而实现定量检测目的。该方法具有准确性强、灵敏度高、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于规模化应用，尤其是可以筛选出符合要求的甲苄基异氰酸酯试剂，例如筛选出R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯含量低的甲苄基异氰酸酯试剂，该试剂可以用于实现盐酸多佐胺对映异构体的检测。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

色谱条件：

色谱柱：YMC Cellulose-SB(4.6*250mm，5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：254nm；

柱温：10℃；

稀释溶剂：正己烷-异丙醇，体积比为90:10；

流动相A：正己烷-乙醇-二乙胺，体积比为90:10:0.05；

流动相B：乙醇；

梯度洗脱条件：

测定方法如下：

空白溶液：即稀释溶剂。

供试品溶液配制：量取S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯供试品试剂(市售)200μg，置于10mL量瓶中，加入稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液：量取S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品200μg，置于10mL量瓶中，加入稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液一(定位用)：量取R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品200μg，置于10mL量瓶中，加入稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品储备液：量取R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品10mg，置于100mL量瓶中，加入稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液二(定量用)：量取R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯储备液50μL，置于20mL量瓶中，加入稀释溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。

精密量取空白溶液、供试品溶液、S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液一、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液二各10μL，分别注入高效液相色谱仪，流速为0.6ml/min，记录色谱图，参见图1～图4。

从图1可知，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在17.55分钟，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在16.67分钟。S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的分离度为1.58。

R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的含量(％)＝(A样×C对)/(A对×C样)×100％

上式中：

A样－供试品溶液中，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的峰面积，本实施例中具体为1.584；

A对－R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液(二)中，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的峰面积，本实施例中具体为1.059；

C对－R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液(二)中，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的浓度(μg/mL)，本实施例中具体为0.25μg/mL；

C样－供试品溶液的浓度(μg/mL)，本实施例中具体为20μg/mL。

按上式计算得出供试品溶液中杂质R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的含量为：1.87％。采用上述高效液相色谱条件可以对R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯进行准确测定。

实施例2

色谱条件：

色谱柱：YMC Cellulose-SB(4.6*250mm，5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：260nm；

柱温：20℃；

稀释溶剂：正己烷-异丙醇，体积比为85:15；

流动相A：正己烷-乙醇-二乙胺，体积比为95:5:0.0.1；

流动相B：乙醇；

梯度洗脱条件：如实施例1。

按照实施例1所述的测定方法配置供试品溶液、S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液一和二、空白溶液，记录色谱图，其中图5为供试品溶液的高效液相色谱图。

从图5可知，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在17.37分钟，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在16.55分钟。S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的分离度为1.24。

实施例3

色谱条件：

色谱柱：YMC Cellulose-SB(4.6*250mm，5μm)；

检测器：UV检测器；

检测波长：250nm；

柱温：15℃；

稀释溶剂：正己烷-异丙醇，体积比为95:5；

流动相A：正己烷-乙醇-二乙胺，体积比为99:1:0.2；

流动相B：乙醇；

梯度洗脱条件：如实施例1。

按照实施例1所述的测定方法配置供试品溶液、S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液一和二、空白溶液，记录色谱图，其中图6为供试品溶液的高效液相色谱图。

从图6可知，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在17.28分钟，R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰时间约在16.51分钟。S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯和R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的分离度为1.09。

对比例1

按照实施例1的方法检测，区别在于，色谱柱为CHIRALPAK AD-H(4.6*250mm，5μm)。

如图7所示，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯出峰重叠在一起，无法有效分离。

对比例2

按照实施例1的方法检测，区别在于，稀释溶剂为正己烷和乙醇，体积比为90:10。

S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的峰形均不好，从而无法准确计算R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯含量。并且，色谱峰分离度小于1。

对比例3

按照实施例1的方法检测，区别在于，正己烷和异丙醇的体积比为99:1。

结果显示，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的色谱峰分离度小于1。

对比例4

按照实施例1的方法检测，区别在于，流动相A：正己烷-乙醇-三氟乙酸，体积比为90:10:0.05。

结果显示，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的出峰重叠在一起，无法有效地分离这两种物质。

对比例5

按照实施例1的方法检测，区别在于，流动相A中，正己烷、乙醇和二乙胺的体积比为80:20:0.05。

结果显示，S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯与R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯的色谱峰分离度小于1。

实施例4

为进一步验证本发明所提供的检测方法的各方面效果，进行了如下实验：

1.专属性

按照实施例1的方法，取空白溶剂(稀释溶剂)、供试品溶液、S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品二溶液各10μL进样。

实验结果表明：在本发明检测方法下，空白溶剂对S-(-)-α-甲苄基异氰酸酯标准品溶液、R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品二溶液的检测无干扰，证明本发明检测方法专属性强。

2.系统精密度

取实施例1中R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品二溶液10μL，连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积，结果见表1。

表1出峰时间和出峰面积

计算得到R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品保留时间的RSD为0.01％，峰面积的RSD为1.470.67％，说明本发明检测方法系统精密度良好。

3.线性实验

分别取实施例1中R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯标准品储备液20μL、40μL、50μL、80μL、100μL置于5个20ml量瓶中，加实施例1的稀释溶剂定容，摇匀。分别进样，峰面积结果如下表2所示：

表2峰面积结果

线性方程为y＝4.1779x-0.0057，相关系数R²＝0.9998，结果表明，当R-(+)-α-甲苄基异氰酸酯浓度在0.103～0.513μg/ml范围内浓度与峰面积呈良好线性关系。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。