一种白化与黄化品种成品茶的判别方法
阅读说明：本技术 一种白化与黄化品种成品茶的判别方法 (Method for distinguishing albino and etiolated variety finished tea ) 是由 谭俊峰 许继业 蔺志远 戴伟东 吕海鹏 朱荫 施江 郭丽 彭群华 张悦 林�智 于 2021-07-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种白化与黄化品种成品茶的判别方法,包括以下步骤：对目标数量的白化、黄化品种成品茶样本进行全组分定性和定量测定,并根据化合物类型分组,然后筛选各分组中能够区分白化与黄化品种成品茶的代表性差异成分,得到各分组的代表性差异化合物；根据各分组的代表性差异化合物建立线性判别函数；根据线性判别函数判别待测样品属于白化品种成品茶或黄化品种成品茶。本发明对白化品种成品茶和黄化品种成品茶茶汤中的水溶性化学成分进行全组分高分辨测定,通过正交偏最小二乘法判别分析对数据进行处理和筛选,通过提取和合并对品种黄茶和品种白茶区分程度较大的特征成分,构建线性判别模型,实现了对白化与黄化品种成品茶的有效判别。(The invention relates to a method for distinguishing a whitened and yellowed variety finished tea, which comprises the following steps: performing all-component qualitative and quantitative determination on the albino and etiolated variety finished tea samples of the target quantity, grouping according to the compound types, and then screening representative difference components capable of distinguishing albino and etiolated variety finished tea in each group to obtain representative difference compounds of each group; establishing a linear discriminant function according to the representative differential compounds of each group; and judging whether the sample to be detected belongs to the whitened variety finished tea or the yellowed variety finished tea according to the linear discriminant function. The method disclosed by the invention is used for carrying out full-component high-resolution determination on water-soluble chemical components in the whitened variety finished tea and the yellowed variety finished tea soup, processing and screening data through the orthogonal partial least square discriminant analysis, and constructing a linear discriminant model through extracting and combining characteristic components with larger discrimination degree between the variety yellow tea and the variety white tea, so that the effective discrimination on the whitened variety finished tea and the yellowed variety finished tea is realized.)
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种白化与黄化品种成品茶的判别方法。
背景技术
茶叶的黄化和白化是指受环境因素和遗传因素影响而导致叶绿素缺乏的表型现象，其共同特点是叶片颜色与正常绿色叶片茶叶相比叶片颜色呈浅黄。黄化和白化叶片颜色与绿色叶片相比具有显而易见的差异，但黄化与白化鲜叶相比差异却较小，鲜叶经加工后，黄化和白化成品干茶颜色差异更加不明显。随着茶叶特异品种(如安吉白茶，或称白叶1号等)良种种植面积和产量的不断上升，市场上不正确标注时有发生，普通消费者仅凭肉眼很难区分，市场监管难度大。为了规范行业发展，急需建立相应的针对黄化和白化品种成品茶叶的鉴别方法。
目前，广为认可的白化或黄化品种成品茶叶的鉴定手段主要有如基因组测序、转录组测序等遗传学判别方法。这些方法虽然判别准确，但主要针对活体茶树或鲜叶，而已经炒干的成品茶则不适合采用此方法。此外，通过视觉判别也难以通过干茶颜色对白化或黄化成品茶进行区分，误判可能性高。如何判别白化或黄化成品茶成为茶产业发展过程中出现的新问题。
已有的茶叶判别方法，主要针对六大茶类进行区分。例如：申请号为201210194109.4的专利文献公开了一种基于茶叶生化成分的多茶类判别方法实现了绿茶、白茶、乌龙茶和红茶的判别。众所周知，绿茶作为不发酵的代表、白茶作为轻微发酵茶的代表、乌龙茶作为半发酵茶的代表，以及红茶作为全发酵的代表，因发酵程度不同，这些茶类之间多酚类含量差异较大。即该专利文献利用了判别对象为发酵程度不同茶叶之特点，选取茶多酚、儿茶素类化合物为自变量作为判别依据，实现了对不同茶类的有效鉴别。但市场上黄化和白化茶叶的差别并不来自于发酵程度的差异，因此，无法通过上述方法进行区分。此外，申请号为202010855084.2的专利文献公开了一种茶类判别方法及系统以及申请号为201810521854.2的专利文献公开了一种基于化学成分的茶类判别方法，均是从茶类发酵程度差异引起的化合物差异出发，实现了对六大茶类(绿茶、黄茶、黑茶、白茶、红茶和乌龙茶)的判别。很显然，上述判别方法均未涉及对不涉及发酵程度差异的遗传突变品种茶叶的判别。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明的目的是提供一种白化与黄化品种成品茶的判别方法。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种白化与黄化品种成品茶的判别方法，包括以下步骤：
S1、对目标数量的白化、黄化品种成品茶样本进行全组分定性和定量测定，并根据化合物类型分组，然后筛选各分组中能够区分白化与黄化品种成品茶的代表性差异成分，得到各分组的代表性差异化合物；
S2、根据各分组的代表性差异化合物建立线性判别函数；
S3、根据线性判别函数判别待测样品属于白化品种成品茶或黄化品种成品茶。
作为优选方案，所述步骤S1，包括以下步骤：
S11、采集目标数量的白化、黄化成品茶样本，分别进行浸提、离心定容和过滤，得到各成品茶样本的茶汤；
S12、采用超高效液相色谱-质谱法和氨基酸自动分析仪法联合对茶汤中的水溶性化学成分进行全组分定量分析，得到定性成分及其对应的定量结果；
S13、将定性成分按照化合物类型进行分组，分为儿茶素组、氨基酸组和黄酮糖苷组；
S14、基于分组结果以及定量结果采用正交偏最小二乘法判别分析筛选出各分组中能够区分白化与黄化品种成品茶的差异化合物；
S15、筛选各分组中区分度较高的差异化合物，作为代表性差异化合物。
作为优选方案，所述步骤S15中，筛选各分组中区分度较高的差异化合物，包括：
提取正交偏最小二乘法判别分析中VIP值由大到小处于前几位且大于1.0的差异化合物。
作为优选方案，所述代表性差异化合物包括：
对于儿茶素组，代表性差异化合物包括EGC和ECg；
对于氨基酸组，代表性差异化合物包括Theanine、Glu、Asp和Arg；
对于黄酮糖苷组，代表性差异化合物包括Kaempherol-3-O-glucosylrutinoside、Quercetin-3-O-galactosylrutinoside、Quercetin-3-O-glucosylrutinoside和Kaempherol-3-O-galactosylrutinoside。
作为优选方案，所述步骤S2中，线性判别函数为：
Y＝0.107X1+1.978X2-5.845X3-20.131X4-1.046X5+5.0441X6-11.767X7-1.761X8+5.582X9+2.756X10-45.939
其中，X1为ECg的定量结果；
X2为EGC的定量结果；
X3为Kaempherol-3-O-glucosylrutinoside的定量结果；
X4为Kaempherol-3-O-galactosylrutinoside的定量结果；
X5为Quercetin-3-O-glucosylrutinoside的定量结果；
X6为Quercetin-3-O-galactosylrutinoside的定量结果；
X7为Asp的定量结果；
X8为Glu的定量结果；
X9为Arg的定量结果；
X10为Theanine的定量结果。
作为优选方案，所述步骤S1，包括以下步骤：
S110、采集目标数量的白化、黄化品种成品茶样本，分别进行浸提、离心定容和过滤，得到各成品茶样本的茶汤；
S120、采用氨基酸自动分析仪法对茶汤中的氨基酸成分进行定量分析，得到定性成分及其对应的定量结果；
S130、基于定性成分及其对应的定量结果采用正交偏最小二乘法判别分析筛选出能够区分白化与黄化品种成品茶的差异化合物；
S140、筛选区分度较高的差异化合物，作为代表性差异化合物。
作为优选方案，所述步骤S140中，筛选区分度较高的差异化合物，包括：
提取正交偏最小二乘法判别分析中VIP值由大到小处于前几位且大于1.0的差异化合物。
作为优选方案，所述代表性差异化合物包括Theanine、Glu、Asp和Arg。
作为优选方案，所述步骤S2中，线性判别函数为：
Y＝-5.379Z1-5.392Z2+2.211Z3+1.308Z4-5.070
其中，Z1为Asp的定量结果；
Z2为Glu的定量结果；
Z3为Arg的定量结果；
Z4为Theanine的定量结果。
作为优选方案，所述步骤S3，包括：
将待测样品的各代表性差异化合物的定量结果代入线性判别函数中，得到Y值；
若Y＜0，则待测样品属于白化品种成品茶；
若Y＞0，则待测样品属于黄化品种成品茶。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
本发明的白化与黄化品种成品茶的判别方法，基于成品茶分组特征成分的高解析度黄化和白化茶的判别，其原理是对品种黄茶和品种白茶成品茶茶汤中的水溶性化学成分进行全组分高分辨测定，通过正交偏最小二乘法判别分析的统计学方法对数据进行处理和筛选，通过提取和合并对品种黄茶和品种白茶成品茶区分程度较大的特征成分，构建了新的判别逻辑结构和线性判别模型，实现了对白化与黄化品种成品茶的有效判别。
附图说明
图1是本发明实施例1的黄酮糖苷组多元统计分析结果；其中，A为黄酮糖苷组OPLS-DA得分图；B为黄酮糖苷组OPLS-DA模型的交叉验证图；C为黄酮糖苷组OPLS-DA模型的VIP值；
图2是本发明实施例1的氨基酸组多元统计分析结果；其中，A为氨基酸组OPLS-DA得分图；B为氨基酸组OPLS-DA模型的交叉验证图；C为氨基酸组OPLS-DA模型的VIP值；
图3是本发明实施例1的儿茶素组多元统计分析结果；A为儿茶素组OPLS-DA得分图；B为儿茶素组OPLS-DA模型的交叉验证图；C为儿茶素组OPLS-DA模型的VIP值。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
实施例1：
本实施例的白化与黄化品种成品茶的判别方法，包括以下步骤：
(1)采集36个白化和黄化品种成品茶样本(其中训练集21个和验证集15个)，进行浸提、离心定容和过滤等预处理，具体步骤为：称取0.2g的磨碎茶样于10mL离心管中，加入在70℃中预热过的70％甲醇水溶液4mL，充分搅拌均匀后移入70℃水浴中浸提10min，冷却至室温后，3500r/min离心10min，将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70％甲醇水溶液重复浸提一次。合并两次浸提液定容至10mL，用0.45μm膜过滤，重复3次，得到各样本的茶汤。
(2)采用超高效液相色谱-质谱法和氨基酸自动分析仪法联合对茶汤中的水溶性化学成分进行全组分定量分析。
具体地，采用超高效液相色谱质谱法对步骤(1)中制得的茶汤中的儿茶素、酚酸、黄酮及其糖苷和生物碱等成分进行定性定量分析；采用Acquity BEH C18色谱柱(100×2.1mm，1.7μm，美国Waters公司)，柱温35℃；流动相A为0.1％(v/v)的甲酸水溶液，流动相B为纯乙腈；流速0.35mL/min；梯度洗脱程序：0min，5％B相；2min，5％B相；8min，35％B相；10min，60％B相；11min，95％B相；11.1min，5％B相；15min，5％B相。
质谱条件：采用多反应检测模式(MRM)；电喷雾离子源，温度200℃；毛细管电压3000V；锥孔电压45V；脱溶剂气体流速550L/H；喷雾辅助气体氮气。
采用氨基酸自动分析仪法对步骤(1)中制得的茶汤中的游离氨基酸组成进行定性定量分析。具体采用Na+型磺酸基强酸性阳离子交换树脂色谱柱(LCA K07/Li，德国Skyam公司)；柱温40℃；流动相A为pH＝2.9的柠檬酸锂缓冲液，流动相B为pH＝4.2的柠檬酸锂缓冲液，流动相C为pH＝8.0的柠檬酸锂缓冲液，流动相D为EDTA缓冲液；氨基酸衍生反应试剂茚三酮流速0.25mL/min；反应器温度130℃；紫外-可见光检测器检测波长设置为570nm和440nm。
对上述超高液相色谱-质谱联用法和氨基酸自动分析仪法获得的原始数据，通过与标准品的出峰时间、分子量大小和二级质谱裂解规律等方法进行比对，获得准确定性结果；获得定性的化合物代入相应标准曲线，获得定量结果；将获得定量检测结果的茶汤中水溶性化学成分按照化合物类型进行分组，具体分成儿茶素组、氨基酸组和黄酮糖苷组3组。
(3)对步骤(2)得到的茶汤中水溶性化学成分的分组定量结果采用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选出各分组中能够区分白化和黄化品种成品茶的差异化合物，结果如图1-3所示，OPLS-DA得分图表明按照化合物类型分组后每组的白化和黄化品种成品茶可以根据该组中的水溶性成分实现区分，即存在差异化合物；三组的OPSL-DA交叉验证图(儿茶素组：200个排列检验，R2和Q2的截距分别为0.204和-0.76；氨基酸组：200个排列检验，R2和Q2的截距分别为0.472和-1.15；黄酮糖苷组：200个排列检验，R2和Q2的截距分别为0.204和-0.76)表明三个模型的拟合和预测能力均较好；因此，可进一步采用VIP值筛选各组中的差异化合物。
(4)筛选并合并步骤(3)各分组中区分度较高的白化和黄化品种成品茶的差异化合物，方法为提取OPLS-DA分析中VIP值处于前几位且大于1.0的化合物，结果：儿茶素组中代表性差异化合物为EGC和ECg；氨基酸组中代表性差异化合物为Theanine、Glu、Asp和Arg；黄酮糖苷组中代表性差异化合物是Kaempherol-3-O-glucosylrutinoside、Quercetin-3-O-galactosylrutinoside、Quercetin-3-O-glucosylrutinoside和Kaempherol-3-O-galactosylrutinoside；将上述筛选出的差异化合物取其并集作为区分白化和黄化品种成品茶的代表性差异化合物。
(5)将步骤(4)中得到的代表性差异化合物的定量结果作为自变量构建线性判别模型，得到线性判别函数为：
Y＝0.107X1+1.978X2-5.845X3-20.131X4-1.046X5+5.0441X6-11.767X7-1.761X8+5.582X9+2.756X10-45.939
其中，X1为ECg的定量结果；
X2为EGC的定量结果；
X3为Kaempherol-3-O-glucosylrutinoside的定量结果；
X4为Kaempherol-3-O-galactosylrutinoside的定量结果；
X5为Quercetin-3-O-glucosylrutinoside的定量结果；
X6为Quercetin-3-O-galactosylrutinoside的定量结果；
X7为Asp的定量结果；
X8为Glu的定量结果；
X9为Arg的定量结果；
X10为Theanine的定量结果。
(6)将待测样品经过步骤(1)、(2)处理进行定量分析，得到各代表性差异化合物的定量结果，并将定量结果代入线性判别函数中，计算Y值；
若Y＜0，则待测样品属于白化品种成品茶；
若Y＞0，则待测样品属于黄化品种成品茶。
另外，本实施例的线性判别函数的Lambda检验显著性P＝0.000＜0.05，表明采用该函数得到的判别结果是有效的；将15个验证集样本按照步骤(1)和步骤(2)进行定量分析，将检测值代入上述线性判别函数中，最终判别的准确率为100％，说明线性判别函数的可靠性。
实施例2：
本实施例的白化与黄化品种成品茶的判别方法，包括以下步骤：
(1)采集36个白化和黄化品种成品茶样本(其中训练集21个和验证集15个)，进行浸提、离心定容和过滤等预处理，具体步骤为：称取0.2g的磨碎茶样于10mL离心管中，加入在70℃中预热过的70％甲醇水溶液4mL，充分搅拌均匀后移入70℃水浴中浸提10min，冷却至室温后，3500r/min离心10min，将上清液转移至10mL容量瓶。残渣再用5mL的70％甲醇水溶液重复浸提一次。合并两次浸提液定容至10mL，用0.45μm膜过滤，重复3次，得到各样本的茶汤。
(2)采用氨基酸自动分析仪法对茶汤中的氨基酸成分进行定量分析。
具体地，采用氨基酸自动分析仪法对步骤(1)中制得的茶汤中的游离氨基酸组成进行定性定量分析，具体采用Na+型磺酸基强酸性阳离子交换树脂色谱柱(LCA K07/Li，德国Skyam公司)；柱温40℃；流动相A为pH＝2.9的柠檬酸锂缓冲液，流动相B为pH＝4.2的柠檬酸锂缓冲液，流动相C为pH＝8.0的柠檬酸锂缓冲液，流动相D为EDTA缓冲液；氨基酸衍生反应试剂茚三酮流速0.25mL/min；反应器温度130℃；紫外-可见光检测器检测波长设置为570nm和440nm。
对上述氨基酸自动分析仪法获得的原始数据，通过与标准品的出峰时间进行比对，获得准确定性结果；获得定性的化合物代入相应标准曲线，获得定量结果。
(3)对步骤(2)茶汤中氨基酸成分的定量结果采用正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)筛选出能够区分白化和黄化品种成品茶的差异化合物，结果如图2所示。
OPLS-DA得分图表明仅以氨基酸类化合物的种类和含量差异也可以实现对白化和黄化品种成品茶的区分，其OPSL-DA交叉验证图为200个排列检验，R2和Q2的截距分别为0.472和-1.15，表明该模型的拟合和预测能力均较好；因此，可进一步采用VIP值筛选差异化合物。
(4)筛选出步骤(3)中区分度较高的白化和黄化品种成品茶的差异化合物，方法为提取OPLS-DA分析中VIP值处于前四位且大于1.0的化合物，结果为氨基酸组中代表性差异化合物是Theanine、Glu、Asp和Arg；将上述筛选出的差异化合物作为区分白化和黄化品种成品茶的代表性差异化合物。
(5)将步骤(4)中得到的代表性差异化合物的定量结果作为自变量构建线性判别模型，得到线性判别函数为：
Y＝-5.379Z1-5.392Z2+2.211Z3+1.308Z4-5.070
其中，Z1为Asp的定量结果；
Z2为Glu的定量结果；
Z3为Arg的定量结果；
Z4为Theanine的定量结果。
(6)将待测样品经过步骤(1)、(2)处理进行定量分析，得到各代表性差异化合物的定量结果，并将定量结果代入线性判别函数中，计算Y值；
若Y＜0，则待测样品属于白化品种成品茶；
若Y＞0，则待测样品属于黄化品种成品茶。
另外，本实施例的线性判别函数的Lambda检验显著性P＝0.000＜0.05，表明采用该函数得到的判别结果是有效的；将15个验证集样本按照步骤(1)和步骤(2)进行定量分析，将检测值代入上述线性判别函数中，最终判别的准确率为100％，说明线性判别函数的可靠性。
实施例3：
本实施例的白化与黄化品种成品茶的判别方法与实施例1或2的不同之处在于：
结合实施例1和2的判别结果，进行相互验证，进一步提升判别的精度；
具体的步骤可以参考实施例1和2，在此不赘述。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。