一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法
阅读说明：本技术 一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法 (Method for measuring content of epicatechin in snake-soaked tendon ) 是由 李永辉 吴娇霞 吴毓皇 徐晗 李立言 于 2021-08-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法,采用高效液相色谱法测定蛇泡筋中表儿茶素的含量,所述高效液相色谱条件为：色谱柱：Hanbonlichrospher C18；流动相：乙酸水-乙腈；流速：0.8-1.2ml/min；时间：10-15min；检测波长：280nm；柱温：35-42℃；进样量：0.002-0.012ml。本发明所述方法精密、快速,专属性强,对建立蛇泡筋的质量标准,奠定了理论基础和实验依据；对扩大蛇泡筋的药用资源,促进蛇泡筋产业化利用具有重要的意义。(The invention discloses a method for measuring the content of epicatechin in a snake-soaked tendon, which adopts a high performance liquid chromatography to measure the content of epicatechin in the snake-soaked tendon, wherein the conditions of the high performance liquid chromatography are as follows: a chromatographic column: hanbonlichospher C18; mobile phase: acetic acid water-acetonitrile; flow rate: 0.8-1.2 ml/min; time: 10-15 min; detection wavelength: 280 nm; column temperature: 35-42 ℃; sample introduction amount: 0.002-0.012 ml. The method is precise, rapid and high in specificity, and lays theoretical foundation and experimental basis for establishing the quality standard of the snake-soaked tendon; has important significance for expanding the medicinal resources of the snake-soaked tendon and promoting the industrialized utilization of the snake-soaked tendon.)
技术领域
本申请涉及中药技术领域，特别涉及一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法。
背景技术
蛇泡筋为海南省常用的中草药，收载于《海南植物图志》，蛇泡筋根为蛇泡筋Rubuscochinchinensis.的药用部位，主要分布于海南和广东省的低海拔山地、丘陵以及路边疏林中。其味微辛、甘、涩，温。具有祛风止痛，散结，解毒。用于风湿腰腿痛，糖尿病，小肠气，痔疮，湿疹的治疗。蛇泡筋的化学成分研究较少，其同属植物茅莓Rubus parvifoliusL主要含有鞣制、黄酮苷、糖类、酚类、氨基酸成分。目前尚无蛇泡筋的含量测定方法研究报道。
其他植物或药材中表儿茶素的含量测定，有见CN110567984A公开了一种评价火把花根药材质量的检测方法，公开了火把花根药材中表儿茶素的含量测定方法；CN103336069B公开的桃果实中酚类化合物的高效液相测定方法，也公开了桃果实中表儿茶素的含量测定方法。但由于不同植物或药材包含的组分和含量不同，即使是相同物质的含量测定方法也可能受干扰成分和含量的影响而不同的。
发明内容
鉴以此，本申请提出一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，以期建立蛇泡筋的质量标准，扩大蛇泡筋的药用资源，促进蛇泡筋产业化利用。
本申请的技术方案是这样实现的：
一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定蛇泡筋中表儿茶素的含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取表儿茶素对照品溶解于甲醇中，制成对照品溶液；(2)供试品溶液的制备：取蛇泡筋根药材粉末溶解于乙醇中得药材溶液，称定重量，再经超声处理、放冷、定重后过滤，过滤后的滤液为供试品溶液；通过超声处理可以充分提取蛇泡筋根药材中的有效成分，减小实验误差；本申请使用乙醇作为供试品溶剂，主要原因是乙醇比甲醇安全性好，沸点高，提取过程中溶剂挥发少。
(3)取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，检测表儿茶素的含量；所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hanbon lichrospher C18 250×4.6mm；
流动相：乙酸水-乙腈；
流速：0.8-1.2ml/min；
时间：10-15min；
检测波长：280nm；
柱温：35-42℃；
进样量：0.002-0.012ml。
进一步的技术方案是，步骤(1)中所述对照品溶液中表儿茶素浓度为0.064mg/ml。
进一步的技术方案是，步骤(2)蛇泡筋根药材粉碎过2-4号筛制成蛇泡筋根药材粉末，所述蛇泡筋根药材粉末与乙醇的质量体积比为1g:20-80ml。
进一步的技术方案是，所述乙醇的质量浓度为30-70％。
进一步的技术方案是，所述超声处理条件为：超声功率200-300W，频率30-50kHz，超声时间10-30min。
进一步的技术方案是，所述定重为放冷后加入所述乙醇使药材溶液的重量与所述称定重量相等。
进一步的技术方案是，所述步骤(3)中流动相中乙酸水与乙腈的体积比为21:4。
进一步的技术方案是，所述乙酸水为质量浓度为2％的乙酸水溶液。
进一步的技术方案是，所述色谱柱长度为250mm，所述色谱柱内径为4.6mm。
进一步的技术方案是，所述步骤(3)中流速为1.0ml/min，时间为15min，柱温为40℃，进样量为0.01ml。
本申请中使用的甲醇、乙腈均为色谱纯，来自美国Fisher公司。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
(1)本申请所述的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，对建立蛇泡筋的质量标准，奠定了理论基础和实验依据；对扩大蛇泡筋的药用资源，促进蛇泡筋产业化利用具有重要的意义。
(2)本申请所述的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，适用于不同产地的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定，经测定得知蛇泡筋药材中表儿茶素的含量范围为1.76～9.17mg/g。
(3)本申请所述的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，表儿茶素在128～768ng范围内呈良好的线性关系，方法平均回收率为101.11％，RSD为2.95％，方法精密度的RSD小于3％，因此，本申请所述的含量测定方法精密、快速，专属性强，可用于蛇泡筋药材的质量控制。
(4)本申请所述的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，表儿茶素在样品中得到了较好的分离，溶剂对样品无干扰。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的优选实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例1的对照品HPLC图谱。
图2为本申请实施例1的供试品(批号201906001)HPLC图谱。
图3为本申请实施例1中表儿茶素对照品溶液的线性范围和检出限的线性图。
具体实施方式
为了更好理解本申请技术内容，下面提供具体实施例，并结合附图对本申请做进一步的说明。
本申请提到的2、3或4号筛，根据2015年中国药典标准药筛规格，R40/3系列，2号筛的筛孔内径为850μm±29μm，目号为25目；3号筛的筛孔内径为355μm±13μm，目号为50目；4号筛的筛孔内径为250μm±9.9μm，目号为65目。
实施例1
一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定蛇泡筋中表儿茶素的含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取表儿茶素对照品溶解于甲醇中，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取蛇泡筋根药材粉末溶解于乙醇中得药材溶液，称定重量，再经超声处理、放冷、定重后过滤，过滤后的滤液为供试品溶液；
(3)取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，检测表儿茶素的含量；所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hanbon lichrospher C18 250×4.6mm；
流动相：乙酸水-乙腈；
流速：1.0ml/min；
时间：15min；
检测波长：280nm；
柱温：40℃
进样量：0.010ml
步骤(1)中所述对照品溶液中表儿茶素浓度为0.064mg/ml。步骤(2)蛇泡筋根药材粉碎过2号筛制成蛇泡筋根药材粉末，所述蛇泡筋根药材粉末与乙醇的质量体积比为1g:50ml。所述乙醇的质量浓度为50％。所述超声处理条件为：超声功率250W，频率40kHz，超声时间20min。所述定重为放冷后加入所述乙醇使药材溶液的重量与所述称定重量相等。所述步骤(3)中流动相中乙酸水与乙腈的体积比为21:4。所述乙酸水为质量浓度为2％的乙酸水溶液。
实施例2
一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定蛇泡筋中表儿茶素的含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取表儿茶素对照品溶解于甲醇中，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取蛇泡筋根药材粉末溶解于乙醇中得药材溶液，称定重量，再经超声处理、放冷、定重后过滤，过滤后的滤液为供试品溶液；
(3)取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，检测表儿茶素的含量；所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hanbon lichrospher C18 250×4.6mm；
流动相：乙酸水-乙腈；
流速：0.8ml/min；
时间：10min；
检测波长：280nm；
柱温：35℃
进样量：0.002ml
步骤(1)中所述对照品溶液中表儿茶素浓度为0.064mg/ml。步骤(2)蛇泡筋根药材粉碎过3号筛制成蛇泡筋根药材粉末，所述蛇泡筋根药材粉末与乙醇的质量体积比为1g:20ml。所述乙醇的质量浓度为30％。所述超声处理条件为：超声功率200W，频率30kHz，超声时间10min。所述定重为放冷后加入所述乙醇使药材溶液的重量与所述称定重量相等。所述步骤(3)中流动相中乙酸水与乙腈的体积比为21:4。所述乙酸水为质量浓度为2％的乙酸水溶液。
实施例3
一种蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，采用高效液相色谱法测定蛇泡筋中表儿茶素的含量，具体包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：取表儿茶素对照品溶解于甲醇中，制成对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备：取蛇泡筋根药材粉末溶解于乙醇中得药材溶液，称定重量，再经超声处理、放冷、定重后过滤，过滤后的滤液为供试品溶液；
(3)取对照品溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪，检测表儿茶素的含量；所述高效液相色谱条件为：
色谱柱：Hanbon lichrospher C18 250×4.6mm；
流动相：乙酸水-乙腈；
流速：1.2ml/min；
时间：12min；
检测波长：280nm；
柱温：42℃
进样量：0.012ml
步骤(1)中所述对照品溶液中表儿茶素浓度为0.064mg/ml。步骤(2)蛇泡筋根药材粉碎过4号筛制成蛇泡筋根药材粉末，所述蛇泡筋根药材粉末与乙醇的质量体积比为1g:80ml。所述乙醇的质量浓度为70％。所述超声处理条件为：超声功率300W，频率50kHz，超声时间30min。所述定重为放冷后加入所述乙醇使药材溶液的重量与所述称定重量相等。所述步骤(3)中流动相中乙酸水与乙腈的体积比为21:4。所述乙酸水为质量浓度为2％的乙酸水溶液。
对比例1
流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
所述对照品溶液中的甲醇替换为含有0.1％磷酸的甲醇溶液，所述供试品溶液中质量浓度为30％的乙醇替换为含有0.1％磷酸的甲醇溶液，其他步骤与实施例1相同。
实施例1-3和对比例1-2表儿茶素的含量测定结果显示，本发明实施例1-3的表儿茶素和相邻峰达到基线分离，而且迷迭香酸峰的保留时间、理论塔板数、均符合要求，对比例1-2测定方法的理论塔板数不符合要求，分离度低。测定结果见表1.
表1系统适用性结果
名称
保留时间(min)
峰面积
理论塔板数
分离度
实施例1
8.548
342786.2
9465.0
1.97
实施例2
8.484
347563.8
9398.5
1.92
实施例3
8.647
345538.1
9422.7
1.95
对比例1
10.468
156368.4
5487.3
1.42
对比例2
9.156
27389.5
5259.4
1.28
实施例1的验证实验
1、线性关系考察
取对照品溶液(0.064mg/ml)，采用序列进样法依次进样2μL、4μL、6μL、8μL、10μL、12μL，以进样量(ng)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明表儿茶素在128-768ng范围内线性关系良好(见图3)，线性回归方程为Y＝832.1X+6083，R＝0.9998。
2、精密度考察
精密称取蛇泡筋根药材粉末(201906001，过二号筛)1.0g，置具塞锥形瓶中，加入50％乙醇50ml，称定重量，超声提取20分钟，取出，放冷，以50％乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液连续进样7次，记录表儿茶素的峰面积，并计算RSD值以考察精密度，结果见表2。结果表明：表儿茶素峰面积的RSD为3.17％，说明仪器精密度良好。
表2精密度考察结果
3、稳定性考察
精密称取蛇泡筋根药材粉末(201906001，过二号筛)1.0g，置具塞锥形瓶中，加入50％乙醇50ml，称定重量，超声提取20分钟，取出，放冷，以50％乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液分别与0h、2h、3.5h、5.5h、7.5h、11.5h、15.5h和19.5h进样，记录表儿茶素的峰面积，并计算RSD值以考样品稳定性，结果见表3。结果表明：表儿茶素在19.5h内稳定，峰面积的RSD为2.58％。
表3稳定性考察结果
4、重复性考察
精密称取蛇泡筋根药材粉末(201906001，过二号筛)6份，每份约1.0g，置具塞锥形瓶中，加入50％乙醇50ml，称定重量，超声提取20分钟，取出，放冷，以50％乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液进样，记录表儿茶素的峰面积，并计算药材中表儿茶素的含量和RSD，以考察重复性，结果表明该提取方法重复性的RSD为4.42％。结果见表4。
表4重复性考察结果
5、加样回收率考察
精密称取蛇泡筋根药材粉末(201906001，过二号筛)6份，每份约0.5g，置具塞锥形瓶中，分别加入对照品溶液(0.064mg/ml)15ml，再加入50％乙醇35ml，称定重量，超声提取20分钟，取出，放冷，以50％乙醇补足减失的重量，滤过，取续滤液进样，记录表儿茶素的峰面积，并计算表儿茶素的加样回收，结果见表5。
表5加样回收结果
实验例
采用本申请实施例1所述的蛇泡筋的表儿茶素的含量测定方法，对不同批次的蛇泡筋药材中表儿茶素的含量测定，结果见表6，表明蛇泡筋根中表儿茶素含量差异较大，范围在1.76～9.17mg/g之间。
表6不同批次蛇泡筋药材中表儿茶素的含量
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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