一种β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法
阅读说明：本技术 一种β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法 (Experimental method for using beta-sitosterol to relieve mammary fibrosis diseases ) 是由 付守鹏 徐平 柳巨雄 阚兴池 郭文晋 曹宇 于 2021-10-11 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法。实验过程如下,S1、本实验选取分娩后3至7天的ICR小鼠作为实验对象,将小鼠分为三组,空白对照组(NT),乳腺纤维化模型组(TGF-β1),给药缓解组(TGF-β1+β-sitosterol),每组5只小鼠。S2、用戊巴比妥钠将小鼠进行麻醉保定,每隔3天对小鼠的第四对乳区注射TGF-β1进行乳腺纤维化的模型构建,共5个周期,模型构建完后24h内采取样品。此β-谷甾醇(β-sitosterol)用于缓解乳腺纤维化的实验方法,通过H&E染色技术评估乳腺组织的损伤情况,Msaaon染色技术评估乳腺组织的纤维化情况并通过Westernblot的方法检测乳腺组织内Collagen II的表达量。实验结果可证明β-谷甾醇对于乳腺纤维化具有缓解的作用。(The invention relates to an experimental method for relieving a mammary fibrosis disease by using beta-sitosterol. The experimental process is as follows, S1, the ICR mice 3 to 7 days after delivery are selected as experimental subjects in the experiment, the mice are divided into three groups, a blank control group (NT), a mammary fibrosis model group (TGF-beta 1), and a drug administration and relief group (TGF-beta 1+ beta-sitosterol), and each group comprises 5 mice. S2, carrying out anesthesia and maintenance on the mouse by using sodium pentobarbital, injecting TGF-beta 1 to the fourth mammary region of the mouse every 3 days to construct a model of mammary fibrosis, wherein 5 periods are provided, and samples are collected within 24 hours after the model is constructed. The experimental method for relieving the mammary fibrosis by using the beta-sitosterol (beta-sitosterol) comprises the steps of evaluating the damage condition of the mammary tissue by using an H & E staining technology, evaluating the fibrosis condition of the mammary tissue by using an Msaaon staining technology and detecting the expression quantity of Collagen II in the mammary tissue by using a Westernblot method. The experimental result can prove that the beta-sitosterol has the function of relieving the mammary fibrosis.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体为一种β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法。
背景技术
奶牛乳腺炎是奶牛最常见的疾病之一，奶牛乳腺炎导致产奶量明显下降，严重时无奶最终导致奶牛淘汰，给奶牛业造成巨大的经济损失。引起奶牛乳腺炎的病原有病毒、细菌、支原体和真菌等，但大多数为细菌感染，其中以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、链球菌为主，约占乳腺炎病原菌的90％以上。在临床实践中患有乳腺炎的奶牛往往患有乳腺局部或整体硬化的显现，然而这一现象并未得到足够的重视。
奶牛乳腺纤维化通常由久治不愈的乳腺炎迁延所致，不同的病原菌引起的临床型和隐型乳腺炎均可引起乳腺不同程度的纤维化。纤维化的乳腺泌乳量降低，严重时可发展为乳腺硬化导致奶牛淘汰，据报道每年因奶牛乳腺纤维化及乳腺炎症而造成的经济损失高达3000亿元人民币，给奶牛业造成严重的损失。在临床上奶牛乳腺发生纤维化时常常以抗炎药物进行缓解，而抗炎药物往往不具有缓解纤维化的功能。因为乳腺纤维化疾病而造成的经济损失可能远高于奶牛乳腺炎疾病而造成的经济损失。
在乳腺炎症发展早期，成纤维细胞无明显病理变化，但到了急性炎症的后期，由于炎症对乳腺造成持续损伤使组织内稳态无法恢复，多种炎症细胞合成并释放细胞因子，引起成纤维细胞的增生和活化，并分泌胶原蛋白导致细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)累积，使炎症由急性转为慢性，乳腺组织出现不同程度的纤维化。
天然产物具有来源广、易获取、不会引起抗生素残留、不易引起细菌耐药等优点。天然产物缓解乳腺炎逐渐被人所重视，并且取得了一定的效果，然而天然产物是否可以作为预防和缓解乳腺纤维化的潜在药物，目前关于这方面的研究还比较少。近年来天然化合物缓解奶牛乳腺纤维化逐渐被人们所探究，β-谷甾醇广泛存在于自然界中的各种植物油、坚果等植物种子中，其具有抗炎，降胆固醇,抗氧化及抑制肿瘤等广泛的药理活性。因此本研究的目的是探究β-谷甾醇对小鼠乳腺纤维化是否具有缓解作用，以期望为临床奶牛乳腺纤维化疾病提供参考。
发明内容
(一)解决的技术问题
根据目前关于缓解乳腺纤维化的不足之处，本发明提供了一种β-谷甾醇用于乳腺纤维化疾病缓解的实验方法，本发明具备药物提取材料无害且来源广泛、缓解乳腺纤维化的效果明显，有利于解决缓解奶牛乳腺纤维化过程中抗生素残留、耐药细菌的产生以及备选缓解药物不足等问题。
(二)技术方案
为达到上述要求，本专利提供以下实验步骤：一种β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法，具体操作如下：
S1、本实验选择8周龄的ICR小鼠进行合笼，每笼1公4母，选取分娩后3至7天的ICR小鼠作为实验对象。实验分为3组，分别是空白对照组(NT)、乳腺纤维化模型组(TGF-β1)、药物缓解组(TGF-β1+β-sitosterol)，每组5只小鼠。
S2、给小鼠进行腹腔注射β-谷甾醇1次，给药浓度为50mg/kg，给药时间为每次注射TGF-β1前1h。
S3、在注射TGF-β1后24h内进行乳腺的取样，一部分乳腺组织用于石蜡切片的制作，观察乳腺组织的病理损伤情况以及纤维化程度。
S4、取一部分乳腺组织用于Westernblot测定，通过Collagen II蛋白表达量的高低来反应细胞外基质的分泌情况，用来评估乳腺组织纤维化的严重程度。
优选的：小鼠乳腺纤维化模型构造方法为:每只小鼠按照45mg/kg的比例配制戊巴比妥钠溶液进行麻醉，仰面保定后，将第四对乳区周围进行消毒，剪掉约1mm乳头，两侧乳头均注射50μL浓度为100ng/mL的TGF-β1，共注射5次，周期为每隔3天注射一次，最后一次TGF-β1注射后24h内采取样品并放在-80℃冰箱保存。
优选的：石蜡切片的制作过程如下：取出新鲜的乳腺组织，用PBS涮洗后，放入4％的甲醛溶液中固定24h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、放入二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、H&E染色等步骤获取H&E染色结果，评估乳腺组织的病理损伤情况；通过Masson染色操作说明书对乳腺组织石蜡切片进行Masson染色，评估乳腺组织纤维化的损伤情况。
优选的：Westernblot的实验步骤如下：将乳腺组织放入添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，研磨后4℃12000rpm离心10min收集上清。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白转移到4％SDS-PAGE胶中，75V电泳30min，随后调节电压为110V下电泳60min。电泳后，蛋白质转移到PVDF膜上。用5％的脱脂牛奶封闭2h，一抗Collagen II(1：1000)4℃孵育过夜,洗涤5次，羊抗兔二抗(1:8000)常温孵育1h，洗涤5次后检测蛋白条带。获取蛋白条带后分析乳腺组织内纤维化的严重程度。
(三)有益效果
1、该β-谷甾醇用于乳腺纤维化疾病缓解的实验方法，通过乳腺组织石蜡切片、H&E染色、Masson染色的方法，从病理组织学的角度出发，证明了β-谷甾醇缓解了小鼠乳腺腺泡壁的增厚、乳腺组织炎性细胞的浸润、纤维化胶原沉积。有力的证明了β-谷甾醇减轻了乳腺病理组织的损伤，对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化具有良好的缓解作用。
2、该β-谷甾醇用于乳腺纤维化疾病缓解的实验方法，通过Westernblot的实验方法，乳腺组织Collagen II表达量的高低来反应细胞外基质的分泌情况，β-谷甾醇预处理后可以显著抑制乳腺组织中Collagen II表达量的升高，实验结果证实了β-谷甾醇对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化具有较好的缓解作用。
3、该β-谷甾醇用于缓解乳腺纤维化疾病的实验方法，通过注射的方式给药，以利于药物中有效成分的充分吸收。具有方便携带、成分无害、抗炎效果明显、细菌不易产生耐药性、不产生抗生素残留等优点。
附图说明
图1、为本专利中β-谷甾醇的分子结构示意图；
图2、为本专利中β-谷甾醇在TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中对乳腺组织病理损伤影响以及纤维化损伤程度的示意图；
图3、为β-谷甾醇在TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中对乳腺组织的病理损伤评分图；
图4、为β-谷甾醇在TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化模型中对乳腺组织中CollagenII表达量影响的示意图。
具体实施方式
结合本专利中所提供的数据，下面将对本发明实施例中的技术方案进行完整、准确的描述。本专业领域内的其他技术人员在没有做出突破性成果的前提下，所获得的其他实施例，均属于本发明的保护范畴。
S1、选择8周龄的ICR小鼠进行合笼，每笼1公4母，待小鼠分娩后3至7天内完成小鼠乳腺纤维化症模型的构建，实验分为3组，分别是空白对照组(NT)、乳腺纤维化模型组(TGF-β1)、药物缓解组(TGF-β1+β-sitosterol)，每组5只小鼠。
S2、给小鼠进行腹腔注射β-谷甾醇1次，给药浓度为50mg/kg，给药时间为每次注射TGF-β1前1h。
S3、取出新鲜的乳腺组织，用PBS涮洗后，放入4％的甲醛溶液中固定24h，经过不同浓度的酒精梯度脱水、放入二甲苯中透明、浸蜡、包埋、切片、H&E染色等步骤获取H&E染色结果，评估乳腺组织的病理损伤情况；通过Masson染色操作说明书对乳腺组织石蜡切片进行Masson染色，评估乳腺组织纤维化的损伤情况。
S4、取一部分乳腺组织用于Westernblot测定。Westernblot的实验步骤如下：将乳腺组织放入添加蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，研磨后4℃12000rpm离心10min收集上清。使用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度，将蛋白转移到4％SDS-PAGE胶中，75V电泳30min，随后调节电压为110V下电泳60min。电泳后，蛋白质转移到PVDF膜上。用5％的脱脂牛奶封闭2h，一抗Collagen II(1：1000)4℃孵育过夜,洗涤5次，羊抗鼠二抗(1:8000)常温孵育1h，洗涤5次后检测蛋白条带。获取蛋白条带后分析乳腺组织内纤维化的严重程度。
通过以上实验操作得到以下实验结果，统计分析如下：
图1为本专利中β-谷甾醇的分子结构示意图；
由图2可以看出，NT组的乳腺腺泡轮廓清晰完整、腺泡之间的基质厚度正常、腺泡没有萎缩。而TGF-β1显著的促使乳腺腺泡萎缩、促使炎性细胞浸润、纤维化胶原沉积破坏了乳腺的正常结构。在注射β-谷甾醇后，这些病理症状得到了明显的改善，该结果证明β-谷甾醇对TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化具有明显的缓解作用。
图3为依据乳腺组织的病理损伤程度而得到的病理组织损伤评分结果。评分标准为，无损伤为0分、轻度损伤为1分、中度损伤为2分、重度损伤为3分、极度损伤为4分。评分由三位病理评分经验丰富的专业内人员完成。从评分结果我们可以看出，β-谷甾醇可以显著的缓解由TGF-β1引起的乳腺组织损伤(**p<0.01)。
由图4的结果我们可以得出，TGF-β1显著的引起乳腺组织内Collagen II表达量升高(#p<0.01)。表明TGF-β1模型组内发生了严重的炎症反应。而β-谷甾醇处理后，乳腺组织内Collagen II水平显著下降，表明纤维化程度得到了有效的缓解(**p<0.01)。该结果证明β-谷甾醇能够使Collagen II水平显著降低，间接反映了β-谷甾醇可以抑制细胞外基质的分泌以达到缓解TGF-β1诱导的小鼠乳腺纤维化的作用。