一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
阅读说明：本技术 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用 (alpha-L-rhamnosidase mutant and application thereof in preparation of praonine ) 是由 李利君 张一纯 倪辉 郑芳 李清彪 姜泽东 于 2021-09-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其应用,该突变体是由如SEQ ID NO.1所示序列的野生型α-L-鼠李糖苷酶经过其第37或165位氨基酸突变而产生的突变体。与野生型α-L-鼠李糖苷酶相比,该突变体的酶活性得到了一定的提高,并且可高效专一的转化柚皮苷制备普鲁宁。(The invention provides an alpha-L-rhamnosidase mutant and application thereof, wherein the mutant is generated by the mutation of 37 th or 165 th amino acid of wild alpha-L-rhamnosidase of a sequence shown as SEQ ID NO. 1. Compared with wild alpha-L-rhamnosidase, the mutant has certain improved enzyme activity, and can efficiently and specifically convert naringin to prepare the pranin.)
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用。
背景技术
普鲁宁是一种具有降低胆固醇、抗氧化及抗病毒等功效的黄酮苷类物质，在食品和药物方面有很好的应用前景。普鲁宁在自然界中的丰度较低，难以从生物组织中提取制备。目前制备普鲁宁主要有化学法和生物法，化学法在高温高压条件，使柚皮苷去掉糖基，该方法需要大量的化学催化剂而且反应条件一般比较激烈，得到的产品副产物多，分离纯化困难。生物法是利用α-L-鼠李糖苷酶水解柚皮苷转化为普鲁宁，该方法反应条件温和，对品质影响小，且纯度高、转化率快。
α-L-鼠李糖苷酶能特异性水解许多天然产物的末端α-L-鼠李糖基，可作用于黄酮糖苷类物质中α-1、α-1,2、α-1,3、α-1,4、α-1,6糖苷键连接的L-鼠李糖。该酶广泛存在于植物、动物和微生物中，可用于柑橘类果汁的脱苦、生物合成普鲁宁和鼠李糖、增加酒的香味、去除橙子果汁中的橙皮苷晶体及提高黄酮的生物活性等。在利用α-L-鼠李糖苷酶水解柑橘黄酮粗提物中的柚皮苷制备普鲁宁中，因为柑橘黄酮粗提物中含有多种黄酮糖苷类化合物，使得产物中不仅产生普鲁宁，还会有其它副产物生成。以柑橘黄酮粗提物为原料制备普鲁宁，需先纯化成柚皮苷，再经过α-L-鼠李糖苷酶水解，进一步纯化为普鲁宁，需要经过2次纯化及2次浓缩结晶才能制备得到普鲁宁，该工艺复杂，得率低。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术中的技术问题之一。为此，本发明提出了一种α-L-鼠李糖苷酶突变体，其可高效专一的转化柚皮苷制备普鲁宁。
为此，在本发明的第一个方面中，提供了α-L-鼠李糖苷酶突变体，由如SEQ IDNO.1所示序列的野生型α-L-鼠李糖苷酶经过其第37或165位氨基酸突变而产生的突变体。
根据本发明的实施例，所述突变体是将野生型卡拉胶酶的第37或第165位氨基酸进行突变。与野生型α-L-鼠李糖苷酶相比，突变体A37P的酶活是WT的245％，突变体G165E的酶活是WT的176％。二者均可特异性转化柚皮苷生成普鲁宁，没有其它副产物生成，转化率大幅度提高，其中A37P酶活高达8.5IU/ml，在80℃、pH7.0、底物浓度75g/L的反应条件下，转化率达73.51％。G165E酶活高达6IU/ml，在80℃、pH7.0、底物浓度75g/L的反应条件下，转化率达69.45％。该方法具有操作简单、成本低廉等优点，大大降低了生产成本，具有广阔的应用前景。
可选地，第37位氨基酸突变对应的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；第165位氨基酸突变对应的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
在本发明的第二方面中，提供了一种编码上述α-L-鼠李糖苷酶突变体的基因，第37位氨基酸突变对应的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；第165位氨基酸突变对应的突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
在本发明的第三个方面中，提供了一种构建体，其包含编码上述α-L-鼠李糖苷酶突变体的基因。
在本发明的第四个方面中，提供了上述α-L-鼠李糖苷酶突变体在制备普鲁宁中的应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为SDS-PAGE分析结果，其中，M：分子量标准蛋白；1：纯化后的AT-Rha；2：纯化后的突变体A37P；3：纯化后的突变体G165E；
图2为高效液相色谱测得不同柚皮苷浓度下的峰面积绘制的标准曲线；
图3为AT-Rha、A37P、G165E的酶活；
图4为实施例3中柚皮苷标品的液相色谱图；
图5为实施例3中普鲁宁标品的液相色谱图；
图6为实施例3中柑橘黄酮粗提物样品的液相色谱图；
图7为实施例3中WT反应结束后体系中柚皮苷和普鲁宁的液相色谱图；
图8为实施例3中A37P反应结束后体系中柚皮苷和普鲁宁的液相色谱图；
图9为实施例3中G165E反应结束后体系中柚皮苷和普鲁宁的液相色谱图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下文的公开提供了许多不同的实施例或例子用来实现本发明的不同实施方式。为了简化本发明的公开，下文中对特定实施例或示例进行描述。当然，他们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明提供的各种特定工艺和材料的例子，本领域普通技术人员可以意识到其他工艺的可应用性和/或其他材料的使用。除非另有说明，本发明的实施将采用本领域技术人员的能力范围之内的化学、分子生物学等领域的传统技术。另外，除非另有说明，在本文中，核酸以5’至3’的方向从左向右书写，氨基酸序列则以氨基端到羧基端的方向从左向右书写。
下面通过说明性的具体实施例对本发明进行描述，这些实施例并不以任何方式限制本发明的范围。特别说明的是：本发明所用到的试剂除特别说明外均有市售。
实施例1构建α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E
重组克隆载体的构建：
以塔宾曲霉TS529来源的α-L-鼠李糖苷酶AT-Rha为模板制备突变体。α-L-鼠李糖苷酶AT-Rha的基因核酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。将含有编码α-L鼠李糖苷酶AT-Rha的基因的菌株pPIC9K-AT-Rha在含1‰Amp抗性的LB平板上活化，37℃培养18h，挑取单菌落于同样含1‰Amp抗性的50mL LB锥形瓶中，37℃180rpm培养至OD600为1.0，按照天根生化科技有限公司的质粒小提试剂盒说明书提取质粒。
提取的质粒作为模板，使用TOYOBO公司的KOD-Plus-Mutagenesis Kit点突变试剂盒完成突变质粒的构建。突变质粒的构建参照KOD-Plus-Mutagenesis Kit说明书共有三个步骤，包括反向PCR、Dpn Ⅰ消化模板以及PCR产物的自身环化。
表1突变引物表
反向PCR反应体系及反应过程如下：
表1反向PCR体系
PCR条件为：94℃预变性2min，98℃变性10s，68℃延伸11min，11个循环，4℃保存。
Dpn I消化模板反应体系及反应过程如下：PCR反应液中加入1μL Dpn I，在37℃下反应1h。
PCR产物的自身环化反应体系及反应过程如下：
表3 PCR产物自身环化体系
反应条件：16℃下反应1h。
将上述构建好的突变质粒全部转入大肠杆菌DH5α感受态，混匀后置于冰上30min，结束后将大肠杆菌DH5α感受态放入温度42℃下热激90s后置于冰上缓和2min，再加入1mL未添加Amp的LB培养基，结束后将大肠杆菌DH5α感受态放于37℃下2h，结束后取菌体200μL涂布于含1‰Amp的LB培养基上，于37℃恒温培养箱培养直至长出单菌落。
待长出单菌落后挑取单菌落于含同样抗性的LB试管中37℃180rpm培养过夜。通过菌液PCR进行阳性验证，以菌液为模板，分别用通用引物(5’AOX和3’AOX)和特异性引物(AT-F和AT-R)进行PCR反应。
表4菌液PCR反应体系
表5 PCR验证引物表
PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，通用引物和特异引物均扩增出条带的菌送至厦门铂瑞生物科技有限公司测序。
α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E的电转化：
将验证正确的pPIC9K-A37P和pPIC9K-G165E的阳性克隆子提取质粒并使用Pme I将所提质粒线性化。
表6线性化体系
取80μL毕赤酵母感受态与已回收的线性化质粒混匀，采用电击转化法转化至毕赤酵母GS115中，吸取200μL菌体涂于MD培养基上，30℃倒置培养2-3天，直至长出单菌落。随机挑取MD平板的单菌落转接至含G418(终浓度为2.5mg/mL)抗性的YPD平板上，将筛选得到的单菌落活化培养进行鉴定阳性并保种。选择阳性鉴定的毕赤酵母GS115菌株接种到YPD培养基进行培养，培养条件为30℃、转速220rpm，培养时16h。
α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E的表达及纯化：
含有突变型或野生型α-L-鼠李糖苷酶基因的基因工程菌菌液以1％的接种量将活化后的菌株接种到BMGY培养基中，培养至OD600值达到3.0，室温下沉降菌体，倒掉培养基将菌体全部转接到BMMY培养基中，每间隔24h添加500μL甲醇溶液对蛋白进行诱导表达。培养7天后通过冷冻离心机在4℃温度下以5867×g离心15min，保留上清酶液，4℃储存。
收集α-L-鼠李糖苷酶WT及A37P、G165E粗酶液，经50kDa的膜进行超滤浓缩，再经Sephacry S-200HR凝胶柱进行纯化后，通过SDS-PAGE检验，结果如图1所示，WT及突变体酶A37P、G165E均为单一条带，大小为130kDa。
实施例2α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E的酶活测定
使用酶反应缓冲液pH 4.0配制0～250μg/mL的柚皮苷，过0.22μm水系滤膜，进液相瓶，使用岛津液相SPD-20L测定。
表7液相洗脱条件
测定结果如图2所示，以底物浓度为X值，峰面积为Y值绘制标准曲线为Y＝80474X+30101(R2＝0.9999)。
以pH 4.0的300μg/mL柚皮苷为底物，在60℃下孵育10min，加入2μg/mL的酶液(实施例1纯化得的WT、A37P或G165E)在60℃反应30min后沸水浴灭活10min。将反应液过滤进液相瓶，使用岛津液相SPD-20L测定底物柚皮苷的变化从而计算出酶活。测定结果如图3所示，突变体A37P的酶活是WT的245％，突变体G165E的酶活是WT的176％。
实施例3α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E专一性转化柚皮苷生产普鲁宁
以柑橘黄酮粗提物为底物，以WT、A37P、G165E为催化剂，反应条件：柚皮苷浓度75g/L，加酶量3.5～8.5IU/mL，反应温度60℃，pH为4.0下孵育15min。然后，反应液在30000g下离心10min，通过0.22μm膜过滤，在280nm处HPLC分析柑橘黄酮粗提物组成成分及其水解产物普鲁宁的浓度。测定HPLC结果如图4～图9所示，柚皮苷的出峰时间在9.5min左右(图4)，普鲁宁的出峰时间在10.5min左右(图5)。图6显示了柑橘黄酮粗提物样品的组成成分，图7～图9分别为WT、A37P和G165E反应结束后体系中柚皮苷和普鲁宁的液相色谱图。与WT相比，突变体A37P、G165E均可特异性转化柚皮苷，没有其它副产物生成，转化率大幅度提高，WT转化率38.35％，突变体A37P转化率73.51％，突变体G165E转化率69.45％。
综上，根据本发明的实施例，采用定点突变技术将野生酶进行定点突变，得到α-L-鼠李糖苷酶突变体A37P、G165E，发现了突变体具有优良的酶学特性。与WT相比，突变体A37P的酶活是WT的245％，突变体G165E的酶活是WT的176％。且均可特异性转化柚皮苷，没有其它副产物生成，转化率大幅度提高，WT转化率38.35％，突变体A37P转化率73.51％，突变体G165E转化率69.45％。该方法具有操作简单、成本低廉等优点，具有广阔的应用前景。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 集美大学
<120> 一种α-L-鼠李糖苷酶突变体及其在制备普鲁宁中的应用
<130> 无
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
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35 40 45
Pro Ser Gly Ser Val Ile Ala Asp Glu Ile Asn Ser Glu Thr Val Val
50 55 60
Leu Pro Thr Arg Tyr Gly Thr Ser Leu Gly Phe Ala Asn Tyr Thr Gln
65 70 75 80
His Gly Asn Ala Ser Cys Phe Thr Leu Asp Gln Lys Ser Ser Leu Ile
85 90 95
Thr Leu Asp Tyr Gly Thr Glu Val Gly Gly Phe Pro Phe Phe His Val
100 105 110
Asp Ser Leu Ser Asn Ala Val Gln Ile Glu Ala Lys Tyr Thr Glu Ser
115 120 125
Lys Thr Gly Leu Asp Glu Pro Phe Gly Asp Gly Pro Trp Thr Phe Ser
130 135 140
Asn Gly Leu Ser Asn Thr Phe Arg Val Glu Thr Phe Asn Val Thr Ser
145 150 155 160
Pro Gly Thr Val Glu Ser Phe Phe Ile Gln Gly Gly Leu Arg Trp Gln
165 170 175
Asn Leu Lys Leu Leu Thr Asp Gly Ser Val Arg Ile Cys Glu Ala Gly
180 185 190
Ile Lys Ser Gly Asn Asp Arg Thr Pro Val Asn Lys Leu Pro Gly Phe
195 200 205
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Arg Thr Val Gln Gln Ala Cys Ile Ala Ala Asp Thr Ala Pro Ser Thr
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Gln Ser Val Ala Gly Ala Ser Phe Asp Asn Tyr Thr Met Thr Phe Gln
260 265 270
Thr Lys Ile Ile Arg Gly Gly Thr Gly Trp Lys Val Ala Ala Gly Val
275 280 285
Gly Gly Phe Gly Pro Tyr Phe Val Leu Thr Ser Glu Tyr Pro Ala Asp
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Ser Thr Phe Val Asn Thr Asn Arg Thr Thr Val Pro Ala Asn Thr Leu
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Ala Val Gly Tyr Gly Trp Asn Leu Val Asn Gln Thr Ser Leu Thr Thr
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Phe Gly Pro Tyr Gln Asp Gln Thr Ala Leu Val Lys Asp Val Glu Val
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Leu Asp Gly Ala Lys Arg Asp Arg Leu Val Trp Asn Gly Asp Phe Val
450 455 460
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Thr Gly Ser Leu Glu Tyr Trp Ile Asp Arg Gln Ala Pro Asp Ser Ser
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530 535 540
Ala Phe Val Ala Lys His Trp Thr Lys Ile Arg Lys Gly Val Glu Ala
545 550 555 560
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Ile Gly Ala Phe Phe Ser Gly Ser Asp Asn Gly Thr Ala Val Ser Gly
580 585 590
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Trp Ala Ile Leu Ala Gly Val Ala Asn Ala Thr Gln Ala Glu Ser Ser
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<210> 4
<211> 2667
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
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ccaaaggcgc gtaaacatac tgaccctagt ggctcggtta ttgctgacga aattaacagt 180
gagactgtcg tgcttcctac ccgatacgga actagcttgg gatttgcgaa ttatacgcag 240
catggaaacg catcctgctt cacgcttgac cagaaaagct cattgattac cctagactac 300
ggtaccgaag ttgggggatt ccccttcttc catgtggact ctctatccaa tgcagtccag 360
atcgaggcca agtacaccga atccaagacc ggtcttgacg agccgtttgg tgatggccca 420
tggaccttct ccaacggcct ctctaatacc ttccgcgtcg aaacgttcaa tgtcacctca 480
cccgggacag tgggatcctt cttcattcaa gggggccttc gctggcagaa cctcaagctc 540
ctcacagatg gcagtgttcg catatgcgaa gctggtatca aatctggaaa tgaccgcact 600
ccggtaaaca aactgccagg gttcttcgag agctcgaaca agctgtataa tgaaatatgg 660
gccttagggc cacgcacagt ccagcaagca tgcatcgcgg cagataccgc accatcaaca 720
tgggaagtca ctgacgaagg tgtgtatctt cgtggacagc aacctgctca atcagtggca 780
ggagcgtcct ttgacaacta caccatgacc ttccagacca agattatccg tggaggaaca 840
ggttggaagg ttgccgctgg tgtgggcgga tttggtcctt attttgttct taccagcgaa 900
taccctgctg actccacatt tgtcaatacc aaccgaacga ccgtccctgc aaacacacta 960
gctgtgggtt acgggtggaa ccttgtgaat cagacatctc tcaccaccgg aaaagtgaac 1020
cattattcct tacctttcaa cattaaggag ggagaatggt atgagatctc gacttccatc 1080
aatgcgaccg gatatgctgt taccatcaat ggaaccgaga cattcgtggc actggatgac 1140
ctgcaaattg tatctggtac tactggctcc tctggcagtc tgacaggcgg tacctggggg 1200
tttgggccat atcaggatca aaccgctctt gtcaaggacg tggaggtcat cgcacaaaat 1260
ggtacccagt tgtaccggaa tccgatgacg ctcagctccg tcctcgagga atacggagtg 1320
atggccagta agcactccgt ctgtctggac ggtgcgaaaa gggaccgtct tgtctggaat 1380
ggtgattttg tacacactta tcgcgtcatc cagtccagca cctatcgctc cgattttata 1440
accggttccc tagagtactg gatcgaccgt caggcaccag actcgtcgca gtacgctggc 1500
tacttcagca tgtcacctgc tatgggccaa tcggcgaaat atgttgacac gtatgcttct 1560
ttcggacttc ttgattacca gctttttctt ctcaacgtat ttgctggtca ctacagaaac 1620
tctggcgaca aagcgtttgt ggccaagcat tggacaaaga tcaggaaagg cgtggaagcc 1680
atcctgcctt tgatcgatga ccaatctgga ctggccgtcg ccaccaatat cggggcattc 1740
ttctcgggat ccgacaatgg cactgcagta tcggggctcc ttgcccacac actcgaccag 1800
atggctgatg tggcgtccgc gatgaatgag acagatgtcg cgacaatgtg gactcgttcg 1860
gcgacttcaa tcaaagctgc gatcagccag cggctctgga attcccgctt ggggtactat 1920
gcgaccgacc tgagcgaccc gaccgagcag tctatcaccg gcactgcctg ggctattctt 1980
gcgggagtcg ccaatgccac gcaagcagaa tcctccctcg cagcattatc ctctcttcgg 2040
cttggaatag gctacaaaac gtcgagctcc gttgccaacg catcaacgac taatcttgcg 2100
ccttttctca ccggtttcct cttagaatcg attttgcagg agagtcgcaa cagtcccaac 2160
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gtgacccagg ataaatacta tactggtaca acttgggaat acctttaccc tgatggccga 2280
cccgggcttg acctctacac gtcgcatgca cacccttggg cagctgcgcc aacgtacgtt 2340
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cgtcccgcga tgttggatgt gaatgtttca tgggcacggg gaagagtgcc cactcctcat 2460
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<210> 5
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