一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用
阅读说明：本技术 一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用 (Chitosanase mutant and construction method and application thereof ) 是由 郭静 满在伟 杜昌阳 蔡志强 于 2021-08-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种壳聚糖酶突变体和工程菌及应用,属于酶工程技术领域。其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的壳聚糖酶第121位脯氨酸突变为天冬酰胺或半胱氨酸或缬氨酸。本发明壳聚糖酶突变体与野生型壳聚糖酶相比,三种突变体催化胶体壳聚糖获得壳寡糖的比酶活分别提高1.69、1.97及2.15倍,特别是P121N突变体,提高催化活性的同时,没有损失热稳定性,具备良好的应用前景；本发明还提供一种上述突变体的构建方法,通过分析该酶蛋白结构上的高去折叠自由能位点,以此选取突变位点,采用基因工程方法对该位点进行饱和突变,然后筛选目的蛋白。(The invention discloses a chitosanase mutant, engineering bacteria and application, and belongs to the technical field of enzyme engineering. The amino acid sequence of the chitosanase is shown in SEQ ID NO. 1, proline at position 121 is mutated into asparagine, cysteine or valine. Compared with the wild type chitosanase, the chitosanase mutant of the invention has the advantages that the specific enzyme activities of the chitosanase mutant for catalyzing the colloidal chitosan to obtain the chitooligosaccharide are respectively improved by 1.69, 1.97 and 2.15 times, particularly the P121N mutant, the catalytic activity is improved, meanwhile, the thermal stability is not lost, and the invention has good application prospect; the invention also provides a construction method of the mutant, which comprises the steps of analyzing the high unfolding free energy site on the structure of the zymoprotein, selecting a mutation site, carrying out saturation mutation on the site by adopting a genetic engineering method, and then screening the target protein.)
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用。
背景技术
壳聚糖酶(EC.3.2.1.132)是一类可以水解壳聚糖产壳寡糖或氨基葡萄糖的糖苷酶。根据糖苷酶数据库中特征氨基酸序列的差异，壳聚糖酶主要分布于GH8、GH46、GH75和GH80家族，其中以GH46家族壳聚糖酶的研究最为深入。GH46家族壳聚糖酶呈哑铃型，由α螺旋连接两个大小不同的球体，活性中心有两个催化残基Asp和Glu，一个氨基酸残基作为亲核试剂，另一个作为广义酸/碱。
壳聚糖，又称脱乙酰甲壳素，是以氨基葡萄糖为单体通过β-1.4-糖苷键连接而成的线性高聚物，广泛的存在于各类节肢动物(虾、蟹)的外壳和某些真菌与藻类的细胞壁中。每年通过生物合成的壳聚糖接近100亿吨，是含量仅次于纤维素可再生多糖。壳聚糖经降解可生成壳寡糖(聚合度为2-10)，如果彻底降解则生成氨基葡萄糖。这些产物具有水溶性高、易被生物机体吸收利用等壳聚糖没有的优点。有研究报道指出，壳寡糖具有抗肿瘤、抗炎、抗菌、提高机体免疫力及促进乳酸菌生长等功能，因此在医药、食品、农业、化妆品等领域具有广阔的应用前景。
目前，壳寡糖的制备方法主要有物理降解法、化学降解法及酶水解法。物理降解法具有产物分子量过大、难以获得有生物活性、可溶性低聚糖等缺点。化学法具有反应条件剧烈、选择性差、分离纯化困难等缺点，同时在化学反应过程中引入大量的酸和氧化剂等会对环境造成严重污染。酶水解法具有选择性强、反应条件温和、环境友好、易于制备等优点，已迅速成为近年来的研究热点。
获得高催化活性的酶是其工业化应用的前提。目前获得具有优良催化特性的酶主要有两种方法：菌株筛选及蛋白质工程。筛选菌株具有费时费力、效率低下等缺点，通过蛋白质工程改良现有酶类具有效率高、节省时间、收效明显等优点，因此，成为近年来筛选优良酶的首选。目前蛋白质工程与以计算机模拟蛋白模型为基础的理性设计相结合已成功获得很多催化特性显著提高的突变酶。
现有技术中虽然也有点突变的应用，但大部分发表文章为通过定点突变研究特定氨基酸对酶的催化功能，而不是提高其催化活性，如2016年发表于《食品工业科技》上的Microbacterium sp.OU01壳聚糖酶Glu51和Asp69定点突变对酶活性的影响，虽然突变酶(Glu51→Gln51)比活力大约为野生型的10％，确定Glu51为与该酶催化功能相关的关键氨基酸残基。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用，通过对壳聚糖酶进行分子改造，使改造后的壳聚糖酶催化活性得到提高，最终应用于壳寡糖的生产。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A是实验室前期克隆获得的一种GH46家族壳聚糖酶，该酶可以水解胶体壳聚糖产壳二糖及壳三糖，具有催化活性高、稳定性强等优点，因此具有较好的应用前景。为提高其催化活性，更好的将其应用于产壳寡糖。本发明基于已得到的壳聚糖酶在大肠杆菌中的表达平台，利用以计算机模拟为基础的定点突变技术，对BsCsn46A进行分子改造，获得催化活性提高的壳聚糖酶突变体。
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：
一种壳聚糖酶突变体，所述壳聚糖酶突变体为枯草芽孢杆菌壳聚糖酶发生点突变后形成的具有催化产壳寡糖功能的突变体，所述突变位置为编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的核苷酸序列上第121位脯氨酸进行定点突变；所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:1
1 AGLNKDQKRRAEQLTSIFEN
21 GTTEIQYGYVERLDDGRGYT
41 CGRAGFTTATGDALEVVEVY
61 TKAVPNSKLKKYLPELRRLA
81 KEESDDTSNLKGFASAWKSL
101 ANDKEFRAAQDKVNDHLYYQ
121 PAMKRSDNAGLKTALARAVM
141 YDTVIQHGDGDDPDSFYALI
161 KRTNKKAGGSPKDGIDEKKW
181 LNKFLDVRYDDLMNPANHDT
201 RDEWRESVARVDVLRSIAKE
221 NNYNLNGPIHVRSNEYGNFV
241 IK
本发明中所述的发生突变的氨基酸位点位于壳聚糖酶活性中心的背面的α-螺旋结构中，所述突变可以增加蛋白的柔性，进而提高其催化活性。
作为改进的是，所述编码枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:2
1GCGGGACTGAATAAAGATCAAAAGCGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTTTGAAAAC
61GGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGCTATACA
121TGCGGTCGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATAC
181ACAAAGGCAGTTCCGAATAGCAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCC
241AAGGAAGAAAGCGATGATACAAGCAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTT
301GCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGACAAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAG
361CCTGCCATGAAACGATCGGATAATGCCGGACTAAAAACAGCATTGGCAAGAGCTGTGATG
421TACGATACGGTTATTCAGCATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGCCTTGATT
481AAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGG
541TTGAATAAATTCTTGGACGTACGCTATGAGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACC
601CGTGACGAATGGAGAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGCTCTATCGCCAAGGAG
661AACAACTATAATCTAAACGGACCGATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTA
721ATCAAATAA
作为改进的是，当所述第121位脯氨酸突变为天冬酰胺时，壳聚糖酶突变体记为P121N；所述第121位脯氨酸突变为半胱氨酸时，壳聚糖酶突变体记为P121C；所述第121位脯氨酸突变为缬氨酸时，壳聚糖酶突变体记为P121V。
进一步改进的是，壳聚糖酶突变体P121N的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述壳聚糖酶突变体P121C的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述壳聚糖酶突变体P121V的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
SEQ ID NO:3
1 AGLNKDQKRRAEQLTSIFEN
21 GTTEIQYGYVERLDDGRGYT
41 CGRAGFTTATGDALEVVEVY
61 TKAVPNSKLKKYLPELRRLA
81 KEESDDTSNLKGFASAWKSL
101 ANDKEFRAAQDKVNDHLYYQ
121 NAMKRSDNAGLKTALARAVM
141 YDTVIQHGDGDDPDSFYALI
161 KRTNKKAGGSPKDGIDEKKW
181 LNKFLDVRYDDLMNPANHDT
201 RDEWRESVARVDVLRSIAKE
221 NNYNLNGPIHVRSNEYGNFV
241 IK
对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示：
1GCGGGACTGAATAAAGATCAAAAGCGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTTTGAAAAC
61GGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGCTATACA
121TGCGGTCGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATAC
181ACAAAGGCAGTTCCGAATAGCAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCC
241AAGGAAGAAAGCGATGATACAAGCAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTT
301GCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGACAAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAG
361AATGCCATGAAACGATCGGATAATGCCGGACTAAAAACAGCATTGGCAAGAGCTGTGATG
421TACGATACGGTTATTCAGCATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGCCTTGATT
481AAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGG
541TTGAATAAATTCTTGGACGTACGCTATGAGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACC
601CGTGACGAATGGAGAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGCTCTATCGCCAAGGAG
661AACAACTATAATCTAAACGGACCGATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTA
721ATCAAATAA
SEQ ID NO:4
1 AGLNKDQKRRAEQLTSIFEN
21 GTTEIQYGYVERLDDGRGYT
41 CGRAGFTTATGDALEVVEVY
61 TKAVPNSKLKKYLPELRRLA
81 KEESDDTSNLKGFASAWKSL
101 ANDKEFRAAQDKVNDHLYYQ
121 CAMKRSDNAGLKTALARAVM
141 YDTVIQHGDGDDPDSFYALI
161 KRTNKKAGGSPKDGIDEKKW
181 LNKFLDVRYDDLMNPANHDT
201 RDEWRESVARVDVLRSIAKE
221 NNYNLNGPIHVRSNEYGNFV
241 IK
对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示：
1GCGGGACTGAATAAAGATCAAAAGCGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTTTGAAAAC
61GGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGCTATACA
121TGCGGTCGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATAC
181ACAAAGGCAGTTCCGAATAGCAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCC
241AAGGAAGAAAGCGATGATACAAGCAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTT
301GCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGACAAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAG
361TGCGCCATGAAACGATCGGATAATGCCGGACTAAAAACAGCATTGGCAAGAGCTGTGATG
421TACGATACGGTTATTCAGCATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGCCTTGATT
481AAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGG
541TTGAATAAATTCTTGGACGTACGCTATGAGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACC
601CGTGACGAATGGAGAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGCTCTATCGCCAAGGAG
661AACAACTATAATCTAAACGGACCGATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTA
721ATCAAATAA
SEQ ID NO:5
1 AGLNKDQKRRAEQLTSIFEN
21 GTTEIQYGYVERLDDGRGYT
41 CGRAGFTTATGDALEVVEVY
61 TKAVPNSKLKKYLPELRRLA
81 KEESDDTSNLKGFASAWKSL
101 ANDKEFRAAQDKVNDHLYYQ
121 VAMKRSDNAGLKTALARAVM
141 YDTVIQHGDGDDPDSFYALI
161 KRTNKKAGGSPKDGIDEKKW
181 LNKFLDVRYDDLMNPANHDT
201 RDEWRESVARVDVLRSIAKE
221 NNYNLNGPIHVRSNEYGNFV
241 IK
对应的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示：
1GCGGGACTGAATAAAGATCAAAAGCGCCGGGCGGAACAGCTGACAAGTATCTTTGAAAAC
61GGCACAACGGAGATCCAATATGGATATGTAGAGCGATTGGATGACGGGCGAGGCTATACA
121TGCGGTCGGGCAGGCTTTACAACGGCTACCGGGGATGCATTGGAAGTAGTGGAAGTATAC
181ACAAAGGCAGTTCCGAATAGCAAACTGAAAAAGTATCTGCCTGAATTGCGCCGTCTGGCC
241AAGGAAGAAAGCGATGATACAAGCAATCTCAAGGGATTCGCTTCTGCCTGGAAGTCGCTT
301GCAAATGATAAGGAATTTCGCGCCGCTCAAGACAAAGTAAATGACCATTTGTATTATCAG
361GTTGCCATGAAACGATCGGATAATGCCGGACTAAAAACAGCATTGGCAAGAGCTGTGATG
421TACGATACGGTTATTCAGCATGGCGATGGTGATGACCCTGACTCTTTTTATGCCTTGATT
481AAACGTACGAACAAAAAAGCGGGCGGATCACCTAAAGACGGAATAGACGAGAAGAAGTGG
541TTGAATAAATTCTTGGACGTACGCTATGAGATCTGATGAATCCGGCCAATCATGACACC
601CGTGACGAATGGAGAGAATCAGTTGCCCGTGTGGACGTGCTTCGCTCTATCGCCAAGGAG
661AACAACTATAATCTAAACGGACCGATTCATGTTCGTTCAAACGAGTACGGTAATTTTGTA
721ATCAAATAA
一种基因，所述基因编码上述的壳聚糖酶突变体。
一种重组载体，所述重组表达载体携带有编码壳聚糖酶突变体的基因。
一种重组菌，所述重组菌为转化/转染上述的重组载体的宿主菌。
上述壳聚糖酶突变体的构建方法，以来自于能够甲基化的大肠杆菌宿主携带的壳聚糖酶基因的重组质粒为模板，以带有突变位点的寡聚核苷酸序列为引物，及逆行反向PCR，扩增突变质粒全长；使用DpnI限制性内切酶消化模板质粒；将经过DpnI限制性内切酶处理的PCR产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，涂布于含有卡那霉素抗性的固体LB平板过夜培养；挑取单菌落接种至含有卡那霉素抗性的LB液体培养基，过夜培养后提取质粒并进行测序验证；将测序结果正确的质粒转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，即得壳聚糖酶突变体。
具体步骤如下：
步骤1，将基因序列SEQ ID No.2克隆至质粒pET-28a中，构建重组质粒pET-BsCsn46A；
步骤2，利用Swiss-Model在线软件对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A进行模拟，获得壳聚糖酶的空间结构；
步骤3将壳聚糖酶的空间结构提交至PoPMuSiC在线预测软件，确定P121位点作为饱和突变的位点；
步骤4，设计定点突变引物，通过反向PCR对壳聚糖酶基因序列进行定点突变，获得含有突变壳聚糖酶基因序列的重组载体；
步骤5，将突变后的重组载体热击转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，诱导表达，离心收集菌体，经超声波破碎细胞后使用Ni-NTA进行蛋白纯化，获得壳聚糖酶突变体。
上述任一种所述的壳聚糖酶突变体在催化产壳寡糖上的应用。
有益效果：
与现有技术相比，本发明一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用，通过对壳聚糖酶进行分子改造，所述的发生突变的氨基酸位点位于壳聚糖酶活性中心的背面的α-螺旋结构中，所述突变可以增加蛋白的柔性，所得壳聚糖酶突变体酶活变化显著，其中突变体P121N、P121C、P121V的酶活提高显著，特别是P121N突变体，提高酶活的同时并没有影响酶的热稳定性。将该壳聚糖酶突变体应用于提高壳寡糖的产量具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为野生型壳聚糖酶及其突变体的温度稳定性，其中，Wild-type为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A；
图2为壳聚糖酶蛋白的结构图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
实施例1突变体的构建
菌株E.coli DH5α，购买于武汉淼灵生物科技有限公司；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A，购买于武汉淼灵生物科技有限公司。
1.壳聚糖酶突变位点的确定
利用Swiss-Model在线软件对壳聚糖酶BsCsn46A进行模拟，获得壳聚糖酶的空间结构，将由Swiss-Model模拟获得的蛋白结构提交至PoPMuSiC在线服务器计算壳聚糖酶每个突变氨基酸的去折叠自由能变化(ΔΔG)，来辅助寻找对壳聚糖酶催化有较大影响的氨基酸，选取ΔΔG最高的氨基酸作为突变氨基酸，将该氨基酸突变成其他19种氨基酸。以表1的引物进行反向PCR扩增获得相应的突变质粒，质粒模板来自于E.coli DH5α(该菌株能够在GATC位点上进行甲基化)。
表1引物序列
反向PCR体系为：
试剂名称
体积(μL)
模板
2
PCR Buffer
5
dNTPs(10mM)
1
上/下游引物(100mM)
各0.3
PfuDNA聚合酶
1.5
ddH<sub>2</sub>O
40
总体积
50
反向PCR扩增条件：95℃预变性5min；95℃变性50s，58℃退火30s，68℃延伸12.5min，12个循环；4℃保温。
2.DpnI消化模板质粒
取20μL PCR产物，在PCR产物种直接添加1μL DpnI限制性内切酶。
3.转化大肠杆菌
取10μL酶切产物直接转化E.coli DH5α感受态细胞。将携带突变质粒的重组细胞送至上海生物工程有限公司测序。将测序正确的突变质粒转化至E.coli BL21。
4.蛋白纯化
将经超声波破碎细胞获得的粗酶液上样至Ni-NTA亲和层析柱，使用上样缓冲液充分洗脱未结合的蛋白，最后用洗脱缓冲液(50mM Tris-HCl，0.5mM NaCl，0.1M咪唑，pH 8.0)洗脱带有组氨酸标签的重组蛋白，将带有组氨酸标签的重组蛋白保存于-20℃备用。利用Broadford法测定酶液中的蛋白含量。
5.酶活测定
在比色管中加入1475μL pH 6.2磷酸盐缓冲液、500μL 1％胶体壳聚糖溶液、18μL100 mM的Mn2+，最后加入25μL纯化获得的纯化壳聚糖酶，混匀后立刻55℃水浴5min，水浴结束后立即加入1.5mL DNS试剂混匀，终止反应，以没有添加酶液的样品作为空白对照；沸水浴5min，加水至25mL，测定其在520nm下的吸光度。
6.酶活定义
在此条件下，每分钟催化生成1μM还原糖的酶量定义为一个酶活单位(U)。
7.酶学性质
(1)最适pH
在50℃的温度条件下，在不同的pH(磷酸盐缓冲液)，测定壳聚糖酶的酶活。以酶活最高点作为100％。
(2)pH稳定性
在4℃的条件下，将壳聚糖酶置于pH 6.2的磷酸盐缓冲液中保存2h，0h时测定的壳聚糖酶酶活作为100％。
(3)最适温度
在最适pH条件下，将反应体系分别置于40-75℃下进行反应，测定壳聚糖酶的酶活。以酶活最高点作为100％。
(4)温度稳定性
将壳聚糖酶置于55℃的条件下保存2h，0h时测定的壳聚糖酶酶活作为100％。
8.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A及其突变体的酶学性质
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A及其突变体的酶学性质如图1及表2所示，突变体P121N、P121C、P121V、P121S、P121R催化活性显著高于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A，但P121S及P121R温度稳定性下降显著。
表2枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)壳聚糖酶BsCsn46A及其突变体的酶学性质
从上述结果可以看出，本发明一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用，获得了六种催化活性显著提升的壳聚糖酶突变体，其中P121N突变体在没有影响酶稳定性的前提下提高催化活性，该活性是目前壳聚糖酶报道的最高活性。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 常州大学
<120> 一种壳聚糖酶突变体及其构建方法与应用
<160> 48
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 242
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 1
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Ser Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Pro Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 45
<211> 728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60
ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
tgcggtcggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180
acaaaggcag ttccgaatag caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
cctgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgag atctgatgaa tccggccaat catgacaccc 600
gtgacgaatg gagagaatca gttgcccgtg tggacgtgct tcgctctatc gccaaggaga 660
acaactataa tctaaacgga ccgattcatg ttcgttcaaa cgagtacggt aattttgtaa 720
tcaaataa 728
<210> 2
<211> 242
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 2
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Ser Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Asn Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 46
<211> 728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gcgggactga ataaagatca aaagcgccgg gcggaacagc tgacaagtat ctttgaaaac 60
ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
tgcggtcggg caggctttac aacggctacc ggggatgcat tggaagtagt ggaagtatac 180
acaaaggcag ttccgaatag caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
aatgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgag atctgatgaa tccggccaat catgacaccc 600
gtgacgaatg gagagaatca gttgcccgtg tggacgtgct tcgctctatc gccaaggaga 660
acaactataa tctaaacgga ccgattcatg ttcgttcaaa cgagtacggt aattttgtaa 720
tcaaataa 728
<210> 3
<211> 242
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 3
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
Ala Thr Gly Asp Ala Leu Glu Val Val Glu Val Tyr Thr Lys Ala Val
50 55 60
Pro Asn Ser Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Cys Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
<210> 47
<211> 728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
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ggcacaacgg agatccaata tggatatgta gagcgattgg atgacgggcg aggctataca 120
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acaaaggcag ttccgaatag caaactgaaa aagtatctgc ctgaattgcg ccgtctggcc 240
aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
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tgcgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
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aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgag atctgatgaa tccggccaat catgacaccc 600
gtgacgaatg gagagaatca gttgcccgtg tggacgtgct tcgctctatc gccaaggaga 660
acaactataa tctaaacgga ccgattcatg ttcgttcaaa cgagtacggt aattttgtaa 720
tcaaataa 728
<210> 4
<211> 242
<212> PRT
<213> 氨基酸序列(Amino acid Sequence)
<400> 4
Ala Gly Leu Asn Lys Asp Gln Lys Arg Arg Ala Glu Gln Leu Thr Ser
1 5 10 15
Ile Phe Glu Asn Gly Thr Thr Glu Ile Gln Tyr Gly Tyr Val Glu Arg
20 25 30
Leu Asp Asp Gly Arg Gly Tyr Thr Cys Gly Arg Ala Gly Phe Thr Thr
35 40 45
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50 55 60
Pro Asn Ser Lys Leu Lys Lys Tyr Leu Pro Glu Leu Arg Arg Leu Ala
65 70 75 80
Lys Glu Glu Ser Asp Asp Thr Ser Asn Leu Lys Gly Phe Ala Ser Ala
85 90 95
Trp Lys Ser Leu Ala Asn Asp Lys Glu Phe Arg Ala Ala Gln Asp Lys
100 105 110
Val Asn Asp His Leu Tyr Tyr Gln Val Ala Met Lys Arg Ser Asp Asn
115 120 125
Ala Gly Leu Lys Thr Ala Leu Ala Arg Ala Val Met Tyr Asp Thr Val
130 135 140
Ile Gln His Gly Asp Gly Asp Asp Pro Asp Ser Phe Tyr Ala Leu Ile
145 150 155 160
Lys Arg Thr Asn Lys Lys Ala Gly Gly Ser Pro Lys Asp Gly Ile Asp
165 170 175
Glu Lys Lys Trp Leu Asn Lys Phe Leu Asp Val Arg Tyr Asp Asp Leu
180 185 190
Met Asn Pro Ala Asn His Asp Thr Arg Asp Glu Trp Arg Glu Ser Val
195 200 205
Ala Arg Val Asp Val Leu Arg Ser Ile Ala Lys Glu Asn Asn Tyr Asn
210 215 220
Leu Asn Gly Pro Ile His Val Arg Ser Asn Glu Tyr Gly Asn Phe Val
225 230 235 240
Ile Lys
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
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aaggaagaaa gcgatgatac aagcaatctc aagggattcg cttctgcctg gaagtcgctt 300
gcaaatgata aggaatttcg cgccgctcaa gacaaagtaa atgaccattt gtattatcag 360
gttgccatga aacgatcgga taatgccgga ctaaaaacag cattggcaag agctgtgatg 420
tacgatacgg ttattcagca tggcgatggt gatgaccctg actcttttta tgccttgatt 480
aaacgtacga acaaaaaagc gggcggatca cctaaagacg gaatagacga gaagaagtgg 540
ttgaataaat tcttggacgt acgctatgag atctgatgaa tccggccaat catgacaccc 600
gtgacgaatg gagagaatca gttgcccgtg tggacgtgct tcgctctatc gccaaggaga 660
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<210> 12
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
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<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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<400> 29
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<400> 33
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
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<210> 42
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ccgatcgttt catggctttc tgataataca aatggtc 37
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<211> 34
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
catttgtatt atcagcatgc catgaaacga tcgg 34
<210> 44
<211> 34
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
ccgatcgttt catggcatgc tgataataca aatg 34
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