具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1突变位点的确定

使用WebLogo 3在线软件对黄芪甲苷木糖苷酶氨基酸序列(SEQ ID NO：1)进行保守分析，其中用于保守分析的同源序列数据集由Consensus Finder软件输出。黄芪甲苷木糖苷酶的三维模型由SWISS-MODEL在线服务器(https://swissmodel.expasy.org/interactive)建立，所用模板为PDB ID：6Q7I。使用ProSA、PROCHECK等软件评估构建的模型质量。使用Pymol软件将构建的黄芪甲苷木糖苷酶三维结构与模板(6Q7I)进行结构叠加，并进行可视化。结果显示，黄芪甲苷木糖苷酶中的Asp407和Glu611与模板催化残基Asp307(亲核试剂)和Glu509(酸碱试剂)具有相似的位置和方向。此外，序列保守分析显示，Asp407和Glu611在进化中高度保守。因此，Asp407(亲核试剂)和Glu611(酸碱试剂)被预测为黄芪甲苷木糖苷酶的催化残基。进一步，将黄芪甲苷木糖苷酶模型与底物黄芪甲苷进行分子对接计算。从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)库中获取黄芪甲苷的三维结构，并于MMFF94力场中进行能量最小化。将黄芪甲苷木糖苷酶中的Asp407和Glu611定义对接口袋，并在Yinfo云平台(http://cloud.yinfotek.com/)上运行DOCK 6.9程序进行底物和酶的半柔性对接计算，并使用网格评分函数对输出的对接构象的进行能量打分。结果显示，黄芪甲苷木糖苷酶中的Asn131、Trp202、H322、Arg336、Try372、Asn547和Tyr548与黄芪甲苷具有相互作用，主要为氢键或疏水相互作用，因此确定以上7个位点为突变的热点残基。

实施例2引物设计

以SEQ ID NO：2为模板，设计用于定点突变的引物序列(N131A、N131G、N131S、W202G、W202A、W202D、W202E、W202T、W202S、H322A、H322G、R336G、R336A、Y372G、Y372A、Y372D、Y372E、N547A、N547G、Y548G、Y548A、Y548D、Y548E、Y548V、Y548T)，具体引物序列如表1所示：

表1

实施例3黄芪甲苷木糖苷酶突变体DNA序列的获得

利用定点突变技术获得突变体核苷酸序列，通过PCR扩增的方式在黄芪甲苷木糖苷酶上引入突变位点。以野生型黄芪甲苷木糖苷酶核苷酸序列SEQ ID NO：2为模板，先使用F-EcoRI和突变位点的下游引物扩增部分DNA片段，使用R-NotI和突变位点的上游引物扩增部分DNA片段，完成第一轮PCR扩增。然后将两次扩增后得到的DNA片段混合再进行第二轮PCR反应，从而得到完整的突变后DNA序列。PCR扩增反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性2min，58℃退火，72℃延伸180s，共30个循环，然后72℃终延伸10min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。第一轮PCR扩增体系如表2所示，第二轮PCR扩增体系如表3所示。

表2

表3

实施例4质粒构建

PCR反应结束后，使用OMEGA胶回收试剂盒对PCR产物进行分离纯化回收。使用EcoRI和NotI两种限制性内切酶对回收的DNA片段和pPIC9k载体分别进行双酶切，反应条件如表4所示。

表4

然后将酶切后的产物进行回收纯化，并通过使用T4连接酶将酶切后的基因序列分别和酶切后的pPIC9k载体进行连接，获得重组载体(pPIC9k-N131A、pPIC9k-N131G、pPIC9k-N131S、pPIC9k-W202G、pPIC9k-W202A、pPIC9k-W202D、pPIC9k-W202E、pPIC9k-W202T、pPIC9k-W202S、pPIC9k-H322A、pPIC9k-H322G、pPIC9k-R336G、pPIC9k-R336A、pPIC9k-Y372G、pPIC9k-Y372A、pPIC9k-Y372D、pPIC9k-Y372E、pPIC9k-N547A、pPIC9k-N547G、pPIC9k-Y548G、pPIC9k-Y548A、pPIC9k-Y548D、pPIC9k-Y548E、pPIC9k-Y548V、pPIC9k-Y548T)。连接体系如表5所示。

表5

实施例5构建毕赤酵母重组宿主

使用SalI限制性内切酶对上述获得的重组载体(pPIC9k-N131A、pPIC9k-N131G、pPIC9k-N131S、pPIC9k-W202G、pPIC9k-W202A、pPIC9k-W202D、pPIC9k-W202E、pPIC9k-W202T、pPIC9k-W202S、pPIC9k-H322A、pPIC9k-H322G、pPIC9k-R336G、pPIC9k-R336A、pPIC9k-Y372G、pPIC9k-Y372A、pPIC9k-Y372D、pPIC9k-Y372E、pPIC9k-N547A、pPIC9k-N547G、pPIC9k-Y548G、pPIC9k-Y548A、pPIC9k-Y548D、pPIC9k-Y548E、pPIC9k-Y548V、pPIC9k-Y548T)进行单酶切线性化；然后将线性化的重组载体分别电转化到活化的毕赤酵母GS115中得到产酶宿主细胞(GS115-N131A、GS115-N131G、GS115-N131S、GS115-W202G、GS115-W202A、GS115-W202D、GS115-W202E、GS115-W202T、GS115-W202S、GS115-H322A、GS115-H322G、GS115-R336G、GS115-R336A、GS115-Y372G、GS115-Y372A、GS115-Y372D、GS115-Y372E、GS115-N547A、GS115-N547G、GS115-Y548G、GS115-Y548A、GS115-Y548D、GS115-Y548E、GS115-Y548V、GS115-Y548T)。

实施例6黄芪甲苷木糖苷酶突变体的表达和纯化

将上述得到的产酶宿主细胞接入BMMG培养基中于220rpm、30℃条件下培养12h；然后收集菌体并用无菌水清洗2遍，并接入BMMY培养基中在220rpm、30℃条件下培养，每隔24h添加1％甲醇诱导。培养4天后，通过离心和过滤去除菌体得到发酵液，再使用镍柱对上述发酵液进行纯化，最终获得纯化的黄芪甲苷木糖苷酶突变体(N131A、N131G、N131S、W202G、W202A、W202D、W202E、W202T、W202S、H322A、H322G、R336G、R336A、Y372G、Y372A、Y372D、Y372E、N547A、N547G、Y548G、Y548A、Y548D、Y548E、Y548V、Y548T)。

实施例7黄芪甲苷木糖苷酶突变体酶活研究

酶活的测定：底物为5mM黄芪甲苷，加入黄芪甲苷木糖苷酶突变体，在pH 5.5和温度45℃条件下反应1h，反应结束后加入适量甲醇溶解，高效液相色谱检测底物黄芪甲苷的含量，并计算酶活，结果如表6所示。其中黄芪甲苷木糖苷酶突变体酶活定义(U)为每分钟反应掉1μmol黄芪甲苷所需的酶量，比酶活为单位mg的蛋白所具有的酶活。

表6

+代表酶活相对野生型提高1～5倍，++代表酶活相对野生型提高5～10倍，+++代表酶活相对野生型提高10～20倍，-代表酶活相对野生型没有明显变化或降低。

将酶活提高明显的单突变体进行组合，结果如表7所示。

表7

+代表酶活相对野生型提高1～5倍，++代表酶活相对野生型提高5～10倍，+++代表酶活相对野生型提高10～20倍，-代表酶活相对野生型没有明显变化或降低。

实施例8黄芪甲苷木糖苷酶突变体W202G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用

向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.1mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体W202G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.2％。

实施例9黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用

向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.6％。

实施例10黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y372E在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用

向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y372E以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.7％。

实施例11黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y548G在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用

向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.2mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体Y548G以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.1％。

实施例12黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G/Y372A在转化黄芪甲苷制备环黄芪醇中的应用

向10mL100 mM(pH 6.0)的磷酸缓冲液中加入100mg质量含量为10％的黄芪甲苷粉末，然后在分别加入0.1mg黄芪甲苷木糖苷酶突变体H322G/Y372A以及0.1mg葡萄糖苷酶，后在200r/min、45℃条件下充分反应3h。反应结束后液相检测，结果显示环黄芪醇得率高达98.3％。

由以上实施例可知，本发明提供了一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用，所述突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列突变得到；所述突变的位点包括第202位、第322位、第372和第548位中的一种或多种。本发明中的黄芪甲苷木糖苷酶突变体通过4个位点的单点突变或组合突变，能够显著提高酶水解黄芪甲苷C₃位置木糖苷键的水解活性，相较于野生型黄芪甲苷木糖苷酶，对底物黄芪甲苷的催化活性提高了1～20倍，大幅降低环黄芪醇工业生产的成本，使酶催化黄芪甲苷制备环黄芪醇的生产效率显著提高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 威海百合生物技术股份有限公司

北京化工大学

<120> 一种黄芪甲苷木糖苷酶突变体及其应用

<160> 54

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 884

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Lys Phe Leu Ser Trp Ser Val Leu Leu Gln Gly Val Ser Tyr

1 5 10 15

Thr Leu Ala Ala Pro Gln Gln Gly Lys Cys Leu Pro Ala Val Asn Val

20 25 30

Gly Tyr Ala Ala Asn Ile Thr Phe Val Gly Cys Tyr Thr Asp Asn Ser

35 40 45

Thr Arg Ile Leu Gln Gly Gly Ser Thr Val Pro Pro Asn Gly Asn Asp

50 55 60

Pro Gln Ser Cys Ala Asp Ser Cys Gly Ala Ser Gly Phe Thr Tyr Ala

65 70 75 80

Gly Val Glu Tyr Gly Ser Gln Cys Tyr Cys Gly Ser Thr Ile Leu Ser

85 90 95

Gly Ala Gln Gln Gln Ala Asp Ser Ala Cys Thr Met Thr Cys Ser Gly

100 105 110

Asn Ser Ser Glu Ile Cys Gly Gly Thr Trp Leu Val Asp Ile Tyr Gln

115 120 125

Ile Ser Asn Pro Ser Ser Thr Pro Val Pro Leu Ser Gly Ala Val Lys

130 135 140

Pro Asn Cys Thr Ala Asp Pro Leu Cys Ser Asn Pro Val Cys Asn Ala

145 150 155 160

Ala Leu Asp Pro Leu Thr Arg Ala Lys Gly Leu Val Asp Ala Leu Thr

165 170 175

Phe Asp Glu Lys Ile Gln Asn Thr Gln Asn Gly Ser Pro Gly Ser Ala

180 185 190

Arg Leu Gly Leu Pro Gly Tyr Gln Trp Trp Ser Glu Ala Leu His Gly

195 200 205

Val Ala Ser Ser Pro Gly Val Thr Phe Gln Thr Gly Asn Phe Ser Tyr

210 215 220

Ala Thr Ser Phe Pro Gln Pro Ile Leu Met Ser Ala Ala Phe Asp Asp

225 230 235 240

Ala Leu Ile Gln Gln Val Gly Thr Val Val Ser Ile Glu Gly Arg Ala

245 250 255

Phe Ser Asn Tyr Gly Asn Ala Gly Leu Asp Phe Trp Thr Pro Asn Ile

260 265 270

Asn Pro Phe Arg Asp Pro Arg Trp Gly Arg Gly Gln Glu Thr Pro Gly

275 280 285

Glu Asp Pro Phe His Ile Ala Arg Tyr Val Tyr Asn Leu Val Asp Gly

290 295 300

Leu Gln Asn Gly Ile Gly Pro Thr Asn Pro Arg Val Val Ala Thr Cys

305 310 315 320

Lys His Phe Ala Gly Tyr Asp Ile Glu Asp Trp Glu Gly Asn Ala Arg

325 330 335

Tyr Gly Phe Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gln Asp Leu Ser Glu Tyr Tyr

340 345 350

Leu Pro Pro Phe Lys Ser Cys Ala Arg Asp Ala Lys Val Asp Ala Ile

355 360 365

Met Cys Ser Tyr Asn Ala Val Asn Gly Ile Pro Thr Cys Ala Asp Ser

370 375 380

Tyr Leu Leu Asp Thr Ile Leu Arg Asp His Trp Asn Trp Asn Gln Thr

385 390 395 400

Gly Arg Trp Val Thr Ser Asp Cys Asp Ala Ile Gly Asn Ile Phe Thr

405 410 415

Asp His His Tyr Thr Ser Thr Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Ala Leu

420 425 430

Asn Ala Gly Thr Asn Leu Asp Cys Gly Thr Thr Met Ser Asn Asn Leu

435 440 445

Ala Ala Ala Ser Ala Gln Asp Leu Phe Gln Asn Ala Thr Leu Asp Thr

450 455 460

Ala Leu Thr Tyr Leu Tyr Ser Ser Leu Val Arg Leu Gly Trp Phe Asp

465 470 475 480

Glu Glu Thr Ser Pro Tyr Arg Ser Leu Asp Trp Ser Asp Val Gly Thr

485 490 495

Pro Ala Ser Gln Gln Leu Ala Ile Arg Ala Ala Val Glu Gly Ile Val

500 505 510

Leu Leu Lys Asn Asp Lys Thr Lys Val Leu Pro Leu Ser Ser His Arg

515 520 525

Gln Thr Ile Ala Leu Ile Gly Pro Tyr Ala Asn Ala Thr Thr Gln Leu

530 535 540

Gln Gly Asn Tyr Ala Gly Val Ala Glu Tyr Ile Arg Thr Leu Val Trp

545 550 555 560

Gly Ala Glu Gln Ala Gly Tyr Asn Val Glu Tyr Ala Leu Gly Thr Asp

565 570 575

Ile Asn Ser Thr Asp Thr Ser Gly Phe Ser Ala Ala Val Ala Ala Ala

580 585 590

Asn Ala Ser Asp Ile Ile Ile Tyr Ala Gly Gly Ile Asp Asn Ser Ile

595 600 605

Glu Ala Glu Ala Met Asp Arg Asp Thr Ile Ser Trp Pro Gly Asn Gln

610 615 620

Leu Gln Leu Val Asp Glu Leu Ser Gln Val Gly Lys Pro Leu Ile Val

625 630 635 640

Leu Gln Phe Gly Gly Gly Gln Leu Asp Asp Ser Ala Leu Leu Glu Asn

645 650 655

Glu Lys Val Asn Ala Ile Leu Trp Ala Gly Tyr Pro Ser Gln Ala Gly

660 665 670

Gly Gln Ala Val Phe Asp Ile Leu Thr Gly Lys Ser Ala Pro Ala Gly

675 680 685

Arg Leu Pro Ile Thr Gln Tyr Pro Ala Asn Tyr Thr Asn Glu Ile Pro

690 695 700

Met Thr Asp Met Ala Leu Arg Pro Asn Gly Thr Asn Pro Gly Arg Thr

705 710 715 720

Tyr Arg Trp Tyr Asp Asp Ala Val Ile Pro Phe Gly Tyr Gly Leu His

725 730 735

Tyr Thr Ser Phe Asp Val Ser Trp Ala Ser Lys Lys Leu Gly Pro Tyr

740 745 750

Asn Thr Ala Ser Leu Gly His Val Ser Lys Ser Gln Tyr Pro Asp Thr

755 760 765

Ala Ala Phe Asp Thr Phe His Ile Asp Val Lys Asn Thr Gly Lys Val

770 775 780

Thr Ser Asp Tyr Val Ala Leu Leu Phe Ala Ser Thr Lys Asn Ala Gly

785 790 795 800

Pro Ala Pro Tyr Pro Ile Lys Thr Leu Val Gly Tyr Ala Arg Ala Pro

805 810 815

Ser Ile Lys Pro Gly Glu Thr Arg Ser Val Ser Leu Asp Val Thr Leu

820 825 830

Gly Ala Ile Ala Arg Thr Ala Glu Asn Gly Asp Leu Val Leu Tyr Pro

835 840 845

Gly Thr Tyr Thr Leu Glu Val Asp Val Gly Gln His Tyr Pro Thr Ala

850 855 860

Glu Phe Gln Val Asn Gly Pro Asp Lys Val Leu Asp Ser Phe Pro Gln

865 870 875 880

Pro Pro Ser Ser

<210> 2

<211> 2652

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctaaat ttttgtcttg gtctgttttg ttgcaaggtg tttcttatac tttggctgcc 60

ccacaacaag gtaaatgttt gcctgctgtt aacgttggat acgctgctaa cattactttt 120

gttggttgtt acactgacaa ctccactcgt attttgcaag gtggttccac tgttccacca 180

aacggtaacg acccacaatc ttgtgctgac tcctgtggtg cttctggttt cacctacgcc 240

ggtgttgagt acggttccca atgttactgt ggttctacca ttctgtcagg tgctcagcaa 300

caagccgatt ctgcttgtac catgacttgt tccggtaatt cttctgagat ttgtggtggt 360

acttggttgg ttgatatcta ccagatctct aacccttctt ctactccagt tccattgtct 420

ggtgctgtta agcctaattg tactgctgat cctttgtgtt ctaaccccgt ttgtaacgct 480

gcactggatc cattgactag agctaaggga ttagttgacg ctttgacttt tgacgaaaag 540

attcaaaaca cccagaacgg aagtcctggt tccgctcgtt tgggtttgcc aggttatcag 600

tggtggtctg aagctttgca cggagttgct tcttctccag gtgttacttt ccaaaccggt 660

aacttttcct acgctacttc tttcccacaa ccaattctta tgtccgctgc ttttgatgat 720

gctctgattc aacaagttgg tactgttgtt tcaattgaag gtagagcttt ctccaactac 780

ggtaacgccg gactggattt ttggactcct aacattaacc ctttccgtga tcctagatgg 840

ggtagaggtc aagaaactcc tggtgaggac cctttccaca ttgctcgtta cgtttacaat 900

ctggttgatg gtctgcaaaa cggtatcggt cctactaacc ctagagttgt tgctacctgt 960

aagcactttg ctggttacga cattgaggat tgggaaggta acgctagata cggttttaac 1020

gctattattt caactcaaga tttgtccgag tactacctgc ctccttttaa atcttgtgct 1080

agagacgcta aggttgacgc tattatgtgt tcttataatg ctgttaacgg tattcctacc 1140

tgtgctgact cctacttgtt ggacaccatt ttgagagatc attggaactg gaaccaaacc 1200

ggtagatggg tgacctctga ttgtgacgct attggtaata tcttcactga tcaccactac 1260

acttccactg ctgctgctgc tgccgcagat gctttgaatg ccggtaccaa cttggactgt 1320

ggtaccacca tgtctaacaa tcttgctgct gcttctgccc aggatctgtt ccaaaacgcc 1380

actctagaca ccgccttgac ttatttgtac tcgtctttgg ttcgtttggg ttggtttgac 1440

gaagaaacct ctccataccg atctttggat tggtctgacg tcggtactcc agcttcccag 1500

caactggcca tcagagccgc tgttgaaggt atcgttttgt tgaagaacga caaaactaag 1560

gttttgcctt tgtcatctca ccgtcaaacc atcgctctta ttggaccata cgctaacgct 1620

accactcaat tgcaaggtaa ctacgctggt gtcgctgaat acatcagaac tttggtttgg 1680

ggtgctgagc aagctggtta taacgttgaa tatgctttgg gtactgatat taattcaact 1740

gatacttctg gtttctctgc cgctgtcgca gctgctaacg cttctgatat catcatctac 1800

gctggtggta ttgataactc aatcgaggca gaggctatgg acagagatac tatctcttgg 1860

ccaggtaatc aattgcaatt ggttgatgaa ctttctcaag tcggtaaacc tttaattgtt 1920

cttcaattcg gaggtggaca acttgatgac tctgccttgt tggaaaatga gaaggttaac 1980

gctattcttt gggctggtta cccatcccaa gctggtggtc aagccgtttt tgatatcttg 2040

actggtaaat ccgctcctgc tggtagactg cctattaccc aataccctgc taactacacc 2100

aacgaaatcc caatgactga catggctttg agaccaaatg gtactaaccc aggtagaacc 2160

tatagatggt acgatgatgc tgtgattcct ttcggttacg gtttgcatta cactagtttc 2220

gacgtttctt gggcttccaa gaagttgggt ccatacaaca ccgcctcact gggtcacgtt 2280

tctaagtctc aataccctga taccgctgcc tttgacactt ttcatatcga cgtcaagaac 2340

actggtaaag ttactagtga ttacgtcgct ctgctgttcg cttctactaa gaacgctggt 2400

ccagcccctt accctatcaa gaccttggtc ggttatgcta gagccccatc aatcaagcca 2460

ggtgaaacta gatccgtctc cttggatgtt actttgggtg ctattgctag aactgctgaa 2520

aacggtgacc tggtcttgta cccaggaact tacaccttgg aggttgacgt cggtcaacac 2580

tacccaactg ctgagttcca ggtcaacggt cctgataagg tcttggattc tttcccacaa 2640

cctccatctt ct 2652

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gggaaagaat tcgccccaca acaagg 26

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gggaaagcgg ccgcgtgatg gtggtggtga tg 32

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ccagatctct gctccttctt c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggtctagaga cgaggaagaa g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagatctct ggcccttctt c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggtctagaga ccgggaagaa g 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagatctct agcccttctt c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggtctagaga tcgggaagaa g 21

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcagtgggg ctctgaagc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagtcacccc gagacttcg 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcagtgggc ttctgaagc 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagtcacccg aagacttcg 19

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

atcagtggga ctctgaagc 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

tagtcaccct gagacttcg 19

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

atcagtggga gtctgaagc 19

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tagtcaccct cagacttcg 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

atcagtggac gtctgaagc 19

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tagtcacctg cagacttcg 19

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atcagtggag ctctgaagc 19

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tagtcacctc gagacttcg 19

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

acctgtaagg cttttgctg 19

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tggacattcc gaaaacgac 19

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acctgtaagg gctttgctg 19

<210> 26

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tggacattcc cgaaacgac 19

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtaacgctg gctacggttt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ccattgcgac cgatgccaaa 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggtaacgctg cttacggttt 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ccattgcgac gaatgccaaa 20

<210> 31

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gtgttctggc aatgctgtta acgg 24

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cacaagaccg ttcgacaatt gcc 23

<210> 33

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gtgttctgct aatgctgtta acgg 24

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

cacaagacga ttcgacaatt gcc 23

<210> 35

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gtgttctgac aatgctgtta acgg 24

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cacaagactg ttcgacaatt gcc 23

<210> 37

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

gtgttctgag aatgctgtta acgg 24

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cacaagactc ttcgacaatt gcc 23

<210> 39

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

gcaaggtgct tacgctggt 19

<210> 40

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cgttccacga atgcgacca 19

<210> 41

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gcaaggtggc tacgctggt 19

<210> 42

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

cgttccaccg atgcgacca 19

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

caaggtaacg gcgctggtgt c 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

gttccattgc cgcgaccaca g 21

<210> 45

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

caaggtaacg ctgctggtgt c 21

<210> 46

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gttccattgc gacgaccaca g 21

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

caaggtaacg acgctggtgt c 21

<210> 48

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gttccattgc tgcgaccaca g 21

<210> 49

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

caaggtaacg aggctggtgt c 21

<210> 50

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

gttccattgc tccgaccaca g 21

<210> 51

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

caaggtaacg tcgctggtgt c 21

<210> 52

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gttccattgc agcgaccaca g 21

<210> 53

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 53

caaggtaaca ctgctggtgt c 21

<210> 54

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 54

gttccattgt gacgaccaca g 21