一种鱼卵细胞裂解液及快速pcr扩增测序检测方法
阅读说明：本技术 一种鱼卵细胞裂解液及快速pcr扩增测序检测方法 (Fish egg cell lysate and rapid PCR amplification sequencing detection method ) 是由 张钦 刘俊 张建军 刘肖瑶 樊梓龙 于 2021-09-07 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种鱼卵细胞裂解液及快速PCR扩增测序检测方法。包括：异硫氰酸胍、表面活性剂以及EDTA。本发明的有益效果在于：采用含有异硫氰酸胍、表面活性剂以及EDTA的细胞裂解液,可以一次性进行组织消化、细胞裂解,充分释放基因组,释放后的上清液可直接进行PCR反应,可实现PCR快速扩增,不需要在额外使用其余试剂以及后续进行DNA提取,增加了样品的安全性,减短了测试流程,提高了测试效率。(The invention provides a fish egg cell lysate and a rapid PCR amplification sequencing detection method. The method comprises the following steps: guanidine isothiocyanate, surfactant and EDTA. The invention has the beneficial effects that: by adopting the cell lysate containing guanidine isothiocyanate, a surfactant and EDTA, tissue digestion and cell lysis can be carried out at one time, the genome is fully released, the released supernatant can be directly subjected to PCR reaction, PCR rapid amplification can be realized, other reagents are not required to be additionally used, and subsequent DNA extraction is not required, so that the safety of a sample is improved, the test flow is shortened, and the test efficiency is improved.)
技术领域
本发明属于DNA测试领域，具体涉及一种鱼卵细胞裂解液及快速PCR扩增测序检测方法。
背景技术
鱼卵属于真核生物细胞组织，其细胞壁含蛋白质，糖类等造成破壁困难，处理不当基因组释放不充分就会造成PCR扩增失败。
在对鱼卵进行PCR扩增时，传统的方法是对鱼卵总基因组进行提取之后再进行PCR扩增，这种方法可以获取纯度相对较高的基因组进行PCR扩增且扩增效果理想，但提取基因组不仅会耗费大量的时间，增加实验成本，且在基因组提取的过程中，由于样本较多，操作稍微不慎就会造成样本间的交叉污染，给后续实验带来困扰。
专利申请号为201110027643.1的中国专利公开了依次经过酶解消化、细胞裂解以及细胞沉淀的DNA提取方法。该方法操作工序较长，在操作期间样品污染的增大且检测效率并不高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种鱼卵细胞裂解液及快速PCR扩增测序检测方法。
具体技术方案包括：
一种鱼卵细胞裂解液，其不同之处在于，包括：
异硫氰酸胍、表面活性剂以及EDTA。
进一步，所述表面活性剂包括Tris-HCl及tritonx-100。
进一步，所述下列含量的组分：
4.0mol/L～5.0mol/L的异硫氰酸胍；
40mmol/L～50mol/L的Tris-HCl；
体积百分比为1％～1.5％的tritonx100；
以及15mmol/L～25mmol/L的EDTA。
一种鱼卵快速PCR扩增测序检测方法，其不同之处在于，包括：
步骤S1:将鱼卵样品用上述细胞裂解液后破碎细胞壁；
步骤S2:加热静置待细胞充分裂解，得到粗品；
步骤S3:将所述粗品进行固液分离，收集其液体；
步骤S4:加入扩增引物进行PCR扩增。
进一步，在加入细胞裂解液进行破碎细胞壁后采用离心对样品进行沉积固定。
进一步，所述步骤S2中，在75℃～85℃条件下静置25min～35min。
进一步，所述步骤S3中，在2500r/min～3500r/min离心40s～90s进行固液分离。
进一步，所述步骤S4中，采用通用引物L14724与H15915进行PCR扩增。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)采用含有异硫氰酸胍、表面活性剂以及EDTA的细胞裂解液，可以一次性进行组织消化、细胞裂解，充分释放基因组，释放后的上清液可直接进行PCR反应，可实现PCR快速扩增，不需要在额外使用其余试剂以及后续进行DNA提取，增加了样品的安全性，减短了测试流程，提高了测试效率。
(2)采用本发明细胞裂解液进行一步操作，可以降低交叉污染，确保测试结果无假阳性。
附图说明
图1为实施例5的跑胶图；
图2为实施例5的测序峰图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在本发明实施例中，所使用的原料均为常规市售产品。
实施例1
本实施例提供一种鱼卵细胞裂解液，具体包括以下含量的组分：
4.7mol/L的异硫氰酸胍；
46mol/L的Tris-HCl；
体积百分比为1.2％的tritonx-100；
以及20mmol/L的EDTA。
实施例2
本实施例提供一种鱼卵细胞裂解液，具体包括以下含量的组分：
4.0mol/L的异硫氰酸胍；
40mmol/L的Tris-HCl；
体积百分比为1％的tritonx-100；
以及15mmol/L的EDTA。
实施例3
5.0mol/L的异硫氰酸胍；
50mol/L的Tris-HCl；
体积百分比为1.5％的tritonx-100；
以及25mmol/L的EDTA
实施例4
本实施例提供一种鱼卵细胞裂解液，具体包括以下含量的组分：
4.5mol/L的异硫氰酸胍；
45mol/L的Tris-HCl；
体积百分比为1.3％的tritonx-100；
以及22mmol/L的EDTA。
实施例5
本实施例提供一种鱼卵PCR扩增测序的方法，具体操作包括：
1.将鱼卵放入1.5ML的离心管中，加入50ul实施例1细胞裂解液，用吸头将其挤碎，破碎细胞壁。
2.再加入50ul的裂解液冲洗吸头，冲洗液进行离心管。
3.3000r/min离心1min，鱼卵样品进行沉积。
4.放入80℃热水中水浴30min，10000r/min离心1min
5.取上清液1ul,通用引物L14724 GACTTGAAAAACCACCGTTG，H15915CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC各1ul,ddH2O 7ul,MIX 10ul,进行扩增
扩增程序：96°5min
96°30S
55°30S
72°1min 30个循环
72°5min
6.点样跑琼脂糖电泳，记录扩增结果及回收PCR产物，采用该方法测试11组不同的样品(P1～P11)，跑胶结果如图1所示，从测序峰图如图2(P1样品)所示。从跑胶结果来看，本发明的测序产物纯正，且经多次测试结果均一致，确保了测试结果的准确性。
实施例6
本实施例提供一种鱼卵PCR扩增测序的方法，具体操作包括：
1.将鱼卵放入1.5ML的离心管中，加入50ul实施例2细胞裂解液，用吸头将其挤碎，破碎细胞壁。
2.再加入50ul的裂解液冲洗吸头，冲洗液进行离心管。
3.3000r/min离心1min，鱼卵样品进行沉积。
4.放入80℃热水中水浴30min，10000r/min离心1min
5.取上清液1ul,通用引物L14724 GACTTGAAAAACCACCGTTG，H15915CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC各1ul，ddH2O 7ul,MIX 10ul,进行扩增
扩增程序：96°5min
96°30S
55°30S
72°1min 30个循环
72°5min
6.点样跑琼脂糖电泳，记录扩增结果及回收PCR产物。
实施例7
本实施例提供一种鱼卵PCR扩增测序的方法，具体操作包括：
1.将鱼卵放入1.5ML的离心管中，加入50ul实施例3细胞裂解液，用吸头将其挤碎，破碎细胞壁。
2.再加入50ul的裂解液冲洗吸头，冲洗液进行离心管。
3.3000r/min离心1min，鱼卵样品进行沉积。
4.放入80℃热水中水浴30min，10000r/min离心1min
5.取上清液1ul,通用引物L14724 GACTTGAAAAACCACCGTTG，H15915CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC各1ul,ddH2O 7ul,MIX 10ul,进行扩增
扩增程序：96°5min
96°30S
55°30S
72°1min 30个循环
72°5min
6.点样跑琼脂糖电泳，记录扩增结果及回收PCR产物。
实施例8
本实施例提供一种鱼卵PCR扩增测序的方法，具体操作包括：
1.将鱼卵放入1.5ML的离心管中，加入50ul实施例1细胞裂解液，用吸头将其挤碎，破碎细胞壁。
2.再加入50ul的裂解液冲洗吸头，冲洗液进行离心管。
3.3000r/min离心1min，鱼卵样品进行沉积。
4.放入75℃热水中水浴30min，8000r/min离心1min
5.取上清液1ul,通用引物L14724 GACTTGAAAAACCACCGTTG，H15915CTCCGATCTCCGGATTACAAG AC各1ul,ddH2O 7ul,MIX 10ul,进行扩增
扩增程序：96°5min
96°30S
55°30S
72°1min 30个循环
72°5min
6.点样跑琼脂糖电泳，记录扩增结果及回收PCR产物。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。