具体实施方式

一种氟雷拉纳起始物中有关物质的检测方法，所述氟雷拉纳起始物为1,3-二氯-5-(1-三氟甲基-乙烯基)苯，所述有关物质为3,5-二氯溴苯和3,5-二氯-2,2,2-三氟苯乙酮，包括如下步骤：

配制氟雷拉纳起始物及有关物质的对照品溶液；

配制氟雷拉纳起始物供试品溶液；

使用反相高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为磷酸氢二氨溶液，洗脱程序为梯度洗脱；

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用加校正因子的主成分自身对照法确定供试品溶液中1,3-二氯-5-(1-三氟甲基-乙烯基)苯、3,5-二氯溴苯和3,5-二氯-2,2,2-三氟苯乙酮的含量。

在一些实例中，所述流动相B的浓度为8～12mM。

在一些实例中，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～12min，30％～50％运行，13min～20min，60％～68％运行，21min～30min，30％运行。

在一些实例中，流动相的流速为0.3～0.8mL/min。这种流速下，有利于洗脱和分离。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱中的色谱柱温为25℃～35℃。柱温在25～35℃可以获得更为稳定的数据。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱中的进样量为5μL～15μL。

在一些实例中，所述反相高效液相色谱中的检测波长为240nm～260nm。

在一些实例中，所述供试品溶液的质量浓度为400μg/mL～600μg/mL。

在一些实例中，所述对照品溶液和供试品溶液均采用体积分数为40％～80％的乙腈水溶液进行配制。

在一些实例中，所述检测方法包括如下步骤：

使用体积分数为40％～80％的乙腈水溶液配制氟雷拉纳起始物及有关物质的对照品溶液；

使用体积分数为40％～80％的乙腈水溶液配制质量浓度为400μg/mL～600μg/mL的氟雷拉纳起始物供试品溶液；

使用反相高效液相色谱测定对照品溶液和供试品溶液的色谱图，所述反相高效液相色谱的流动相A为乙腈，流动相B为浓度为8～12mM的磷酸氢二氨溶液，洗脱程序为梯度洗脱，其中：梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：以体积分数计，0min～12min，30％～50％运行，13min～20min，60％～68％运行，21min～30min，30％运行，流动相的流速为0.3～0.8mL/min；进样量为5μL～15μL、色谱柱温为25℃～35℃、检测波长为240nm～260nm；

根据对照品溶液和供试品溶液的色谱图，利用加校正因子的主成分自身对照法确定供试品溶液中3,5-二氯溴苯和3,5-二氯-2,2,2-三氟苯乙酮的含量。

在一些实例中，使用的色谱柱为YMC-Triart Phenyl色谱柱：4.6mm×250mm，5μm。

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

方便比较起见，以下实施例和对比例中，所采用的溶剂均为体积分数为60％乙腈水溶液；起始物为1,3-二氯-5-(1-三氟甲基-乙烯基)苯，有关物质包括3,5-二氯溴苯(杂质A)、3,5-二氯-2,2,2-三氟苯乙酮(杂质B)。

实施例1：纯度试验：

S1：供试品溶液制备：准确称取氟雷拉纳起始物供试品10mg，于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀；

S2：高效液相色谱测定：YMC-Triart Phenyl色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈：10mM磷酸氢二氨溶液＝(30～68)：(70～32)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～12min，30％～50％运行，13min～20min，60％～68％运行，21min～30min，30％运行。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：251nm；进样量：10μL；将样品溶液注入液相色谱仪。

检测结果如图1所示。由图1可知：起始物保留时间为18.912min，杂质A保留时间17.465min，杂质B保留时间11.841min，最小分离度为4.98，远大于1.5，起始物与杂质之间能很好的分离。且峰型良好，峰纯度高(≥98.0％)。

实施例2：专属性及系统适用性试验：

S1：杂质储备溶液制备：分别取杂质A、杂质B，加入溶剂使其浓度为0.10mg/mL，作为储备溶液备用；

S2：杂质定位溶液制备：取杂质储备溶液0.5mL于20mL的容量瓶中，得到浓度为2.50μg/mL的杂质A、杂质B定位溶液；

S3：系统适用性溶液制备：称取起始物对照品10mg于20mL的容量瓶，并加入上述杂质A、杂质B储备溶液各0.5mL，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀，作为系统适用性溶液，该系统适用性溶液中，起始物的浓度为500μg/mL，杂质A、杂质B的浓度为2.50μg/mL；

S4：按照实施例1中的高效液相色谱条件进行测定，将杂质A、杂质B定位溶液以及系统适用性溶液注入液相色谱仪，其中系统适用性溶液连续测定6次，记录色谱图，结果如图2、图3、图4和表1所示：

表1

由表1可知：系统适用性溶液各组分之间的分离度≥2.4，互相之间不存在干扰，杂质定位溶液与系统适用性溶液出峰时间基本一致。6针系统适用性溶液主峰理论塔板数在116142～116516之间，均大于2000，符合理论塔板数要求；拖尾因子为0.97～0.98之间，在拖尾因子要求的范围内(0.8～2.0)；统计6针系统适用性溶液起始物峰面积RSD值为0.13％，出峰时间RSD值为0.02％。

实施例3：定量限(LOQ)和检测限(LOD)试验：

根据实施例2中系统适用性溶液液相色谱图可初步得出各组分的信噪比，取系统适用性溶液，采用逐步稀释方法，找出信噪比为2～4的对应浓度，初步定为相应检测限浓度；找出信噪比为8～12的对应浓度，初步定为相应定量限浓度。对各组分的LOQ和LOD进行确认，按照实施例1中的高效液相色谱条件进行测定，每个浓度进样5针，响应值RSD≤10％符合方法学验证判定基准才能定为该化合物的最终LOD和LOQ值。根据检测限和定量限确认试验，各组分LOD和LOQ分别如表2所示：

表1

从表2可看出，本发明的氟雷拉纳起始物中有关物质的检测方法对起始物、杂质A以及杂质B具备较高的灵敏度，对各物质均有较高的响应。

实施例4：线性范围关系试验：

S1：200％限度混合溶液配制：分别吸取杂质A、杂质B储备液各1.0mL于同一个20mL容量瓶中，用溶剂稀释定容至刻度；

S2：各限度混合溶液配制：分别称取200％限度混合溶液2.5mL、4.0mL、5.0mL、6.0mL、7.5mL于5个10mL容量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀，得样品浓度为50％、80％、100％、120％和150％的限度混合溶液。其中，LOQ混合溶液根据实施例3定量限试验结果进行配制；

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件对5个浓度水平的限度混合溶液测定峰面积，每份样品检测3次。以测得的响应信号和被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，用最小二乘法进行线性回归。杂质A、杂质B的线性图谱分别如图5、图6所示。

由图5～6可看出，各杂质的峰面积与浓度呈现良好的线性关系，计算得相关系数r均大于0.995标准要求。

实施例5：准确度试验：

S1：供试品溶液配制：称取起始物供试品10mg，置于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀；

S2：加杂供试品溶液配制：分别称取5.0mL、10mL、15mL 200％限度混合溶液至三份称有10mg起始物对照品的20ml容量瓶中，加入溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。得到限度为50％、100％和150％的加杂供试品溶液；

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定供试样品溶液的峰面积，根据主成分自身对照法计算供试样品溶液中有关物质的回收率，结果如下表3。

表3

从表3可看出，三个不同浓度下杂质A、杂质B的回收率均在82％～97％之间，符合方法学验证要求(80.0％～120.0％)。

实施例6：重复性试验：

S1：对照品溶液配制：精密称取起始物对照品10mg，置于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀，作为对照品溶液。

S2：供试品溶液配制：分别称取6份起始物供试品，其质量分别为10.16mg、10.35mg、10.22mg、10.30mg、10.12mg、10.27mg，加入溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。得到浓度分别为508μg/mL、517.5μg/mL、511μg/mL、515μg/mL、506μg/mL、513.5μg/mL溶液；

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定样品溶液的峰面积，根据主成分自身对照法计算供试样品溶液中起始物的回收率，结果如下表4。

表4

从表4可看出，起始物的回收率均在99％之间，说明采用本方法测定起始物的含量准确可靠。

实施例7：耐用性与稳定性试验：

S1：对照品溶液配制：精密称取起始物对照品10mg，置于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。

S2：供试品溶液配制：分别精密称取2份起始物供试品10mg，分别置于20mL容量瓶中，用溶剂溶解并稀释至刻度线，混匀。

S3：按照实施例1中的高效液相色谱条件测定样品溶液的峰面积，考察不同柱温对起始物及杂质检测结果的影响，分别在柱温＝35±5℃下进行检测。日光下放置24小时后取样品溶液进行测定，与耐用性结果进行比较，计算3组数据的RSD值。结果如表5所示。

表5

从表5可看出，3组共6个数据的RSD值均符合验证方法学验证中耐用性判定基准。柱温波动不超过5℃情况下，柱温对氟雷拉纳起始物供试品各组分的影响均在可接受范围内。

对比例1：

对比例1和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件，具体为：

S1：按照实施例2配制系统适用性溶液；

S2：高效液相色谱测定：YMC-Triart Phenyl色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；甲醇：10mM磷酸氢二氨溶液＝(30～68)：(70～32)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～12min，30％～50％运行，13min～20min，60％～68％运行，21min～30min，30％运行。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：251nm；进样量：10μL；将供试样品溶液注入液相色谱仪，检测结果如图7所示。

从图7可看出，起始物与各杂质均无法检出，无响应。

对比例2

对比例2和实施例1的检测方法相同，不同之处在于S2的色谱条件，具体为：

S1：按照实施例2配制系统适用性溶液；

S2：高效液相色谱测定：YMC-Triart Phenyl色谱柱：4.6mm×250mm，5μm；乙腈：水＝(30～68)：(70～32)(v/v)进行梯度洗脱，梯度洗脱时间及流动相乙腈的体积比顺序为：0min～12min，30％～50％运行，13min～20min，60％～68％运行，21min～30min，30％运行。流速：0.5mL/min；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：251nm；进样量：10μL；将供试样品溶液注入液相色谱仪，检测结果如图8所示。

从图8可看出，起始物保留时间过大，且与附近杂质没有达到基线分离。

对比可知，本发明所限定的色谱条件，可以很好地实现起始物与各有关物质色谱峰之间的完全分离，具有专属性强、回收率好、线性关系优异、重复性好且耐用性好的优点。色谱条件的改变，对于检测效果有着难以预见的影响。

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。